Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS, используемый для получения моноклональных антител к интерлейкину-2 человека Советский патент 1989 года по МПК C12N5/00 

те составляет 0,3 мкг/мл при общей концентрации белка 0,5 мг/мл.

К концентрированному супернатанту добавляют 168 г сульфата аммония (80% насыщения) и выдерживают в течение одного часа. Осадок отделяют центрифугированием (lOOOOxg, 30мин), растворяют в 5 мл 0,01 М натрийфос- фатного буфера, рН 7,2, содержащего 0,15 М NaCl и О,1% полиэтиленглико- ля 6000 (ФСБП), и проводят диализ против того же буфера (18 ч).

Отдиализованный образец наносят на колонку с ультрогелем АсА 54 (2, см) и элюируют ФСБП. Фракции, имеющие IL 2-активность, выходят с колонки как симметричньй пик, соответствующий белку с молекулярной массой 15000 дельтой.

Активные фракции объединяют, наносят на 10-мл колонку с голубой сефарозой CL-6B и колонку промывают ФСБП. Элюирование проводят градиентом NaCl от О,15 до 1 М IL 2 выходит с колонки в интервале 0,3 М до 0,5 М NaCl. Активные фракции объединяют, концентрируют и подвергают лиофилиг зации. Лиофилизованный препарат IL 2 при хранении в холодильнике сохраняет активность в течение двух месяцев . Выход IL 2 составляет 55% (50 мкг), удельная активность - 8, единиц/мг белка. Все операции при вьзделении IL 2 проводят при 4 С.

Биологическую активность IL 2 определяют с помощью 1Ь 2-зависимой линии цнтотоксических Т-лимфоцитов мьшй. Уровень пролиферации оценивают путем окрашивания клеток 3-(4,5- диметиптиазол-2-ш1)-2,5-дифенилтетр$ 3олийбромидом.

Количественную оценку осуществляют срав,нением тестируемых образцов IL 2 с международным стандартом.

IL 2 (25 мкг) в физиологическом растворе вводят в селезенку анести- зированной мьши. Через четыре дня после иммунизации мьппь забивают. . Селезенку забирают асептически, переносят в чашку Петри и перфузируют средой, для чего в селезенку вводят в несколько точек иглы и нагнетают под напором среду. Клеточную суспензию переносят в пробирку и позволяют неразбившимся комочкам клеток осесть в течение 2-3 мин. Клеточную суспензию декантируют в другую про0

5

0

5

0

5

0

5

0

5

бирку и центрифугируют (200xg, 10 мин) при комнатной температуре. Затем 301 10 селезеночных клеток мыши и миеломных клеток ХбЗ Ag 8 653 смешивают в пробирке и промьшйют средой RPMI-1640. Надоса- дочную жидкость осторожно удаляют и при помешивании к клеточному осадку медленно, по каплям, в течение 30 с добавляют 1 мл 50%-ного раствора полиэтиленгликоля 4000 с 10% диметилсульфоксида в среде RPMI-.1640. Через одну Минуту для разбавления полизтиленгликоля по каплям приливают 10 мл-КРМ 1640. Клетки оставляют на 10 мин при комнатной температуре, затем центрифугируют (200 xg, 10 мин). Надоеадоч- ную жидкость декантируют, к осадку добавляют 40 мл RPMI 1640, содержащей 10% эмбриональной телячьей сьто- ротки (ЭТС), суспензируют клетки пипетированием и клеточную суспензию распределяют в четыре 96-луноч- ные плашки, в которые за день до слияния высаживают мышиные перитоне- альные клетки (5 «10 клеток на лунку). На следующий день в лунки планки вносят по 100 мкл среды, содержащей гипоксантина, 8 10 М аминоптерина и 3,2 тимидина. Клоны гибридных клеток становятся заметными через 7-10 дней. Тестирование клонов проводят, когда клетки заполняют лунку на 20%. Положительные культуры клонируют методом лими- тирующих разведений при плотности 0,1-1 клетка на лунку.

Полученный штамм обозначают ЛНКБ-1, он депонирован в специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Института цитологии АН СССР под номером ВСКК/П/ № 127D и характеризуются следующими признаками.

Культуральные прнзнаки.

Стандартные условия культийирова- ния. Среда EPMI-1640, 300 мг/мл L-глютамина, - 10% ЭТС, ЗхЮ М мер- каптоэтанола, температура . При суспензионном культивировании клетки слабо прикреплены к субстрату или располагаются свободно. При посевной плотности кл./мл через 3-5 дней плотность достигает 3-10 1110 кло/мл. Кратность рассева 5- : 10 раз.

Культивирование в организме животных Гибридные клетки прививают и выращивают в виде асцита в перитоне- альной полости мышей линии BALB/C, За 7 дней до введения клеток мышам вводят по 0,5 мл пристана. Осцит образуется через. дней после введения 2-5 млн. клеток.

Продуктивность штамма.

Концентрация специфических иммуноглобулинов в культуральной жидкости более 75 мкг/мл, в асцитной жидкости 5-10 мг/мл.

Характеристика полученного продукта. Штамм продуцирует иммуноглобулин G субкласса I. В твердофазном иммуноферментном анализе антитела взаимодействуют с препаратами IL 2 из линии Jurkat и рекомбинантного IL 2.

Стабильность продуцирования ан- - тител сохраняется на протяжении 25 пассажей в культуре„

Криоконсервирование.

Среда дпя замораживания - 90% ЭТС, 10% ДМСО. Плотность клеток 1-5 «Ю кл/мл. Ампулы с клетками в пенопластовой коробке вьщерживают при -70 С в течение 1 дня и переносят в дюары с жидким азотом. Режим отогрева - водяная баня при . Жизнеспособность клеток после криоконсер- вирования 60% по окрашиванию с трипа- новым синим.

Контаминация. Контаминации отсут- ствуют.

Пример . Иммуноферментный

1472498

жащего антитела. После инкубации в течение одного часа при 37°С плаш ки отмьгоают ФСБТ и обрабатьшают раствором антител к иммуноглобулинам мыши, конъюгированных с перокси дазой хрена (100 мкл на лунку, разведение 1:1000, 1 ). Плапжу еще раз отмьгоают и вносят 100 мкл 10 раствора орто-феннлендиамина

(1 мг/мл) в 1%-ном цитратном буфере (рН 4,5), содержащем 0,05% Реакцию останавливают через 15 мин добавлением 100 мкл на лунку раст- 15 вора 2М . Отрицательным контролем слзокат лунки плашки, не содержащие IL 2, а также лунки, в которые вместо антител к IL 2 вносят нормальньп иммуноглобулин мыши.

Пример 2. Получение и очист ка моноклональньк антител,

а) Получение и очистка ЛНКБ-1 антител из культуральной и асцитной жидкости.

Гибридные клетки наращивают в пластиковых матрасах в среде RPMI 1640, содержащей 10% ЭТС, 300 мг/л L-глутамина и 5 10 М 2- меркаптоэтанола При посевной плотности 5x10 кл./мл через пять дней плотность достигает 1 10 кл./мл. Культуральную жидкость с максимальной продукцией иммуноглобулинов (75 мкг/мл) получают от клеток в стационарной фазе роста (седьмой день). Очистку иммуноглобулинов проводят на протеин А-сефарозе: культу- ральную жидкость (200 мл), рН которой доводят до 8,5, наносят на ко20

25

30

35

анализ моноклональных антител ЛПКБ-1. лонку объемом 5 мл. Колонку промьшаI 1ППЯ ч TTtTл о ТТО гтгел i ттгптгт ч-т гчI f -m ...ш. f f Ч Tlit .Ч-.ч. .

Образцы, содержащие антитела (супер- натанты клеточных культур или асцит- ная жидкость), тестируют методом твердофазного иммуноферментного анализа по связьшанию с препаратами IL 2 из клеточной линии Jurkat и рекомбинантного IL 2. В лунки 96-лу- ночной плашки вносят препарат IL 2 (50 нг на лунку) в 0,05 М бикарбо- натном буфере рН 9,6 и оставляют на 18 ч при 4°С. Плашку отмьшают 0,1%- ным раствором твина-20 в 0,01 М натрий фосфатном буфере, содержащем 0,15 М NaCl (ФСБТ), рН 7,2 и инкубируют с 200 мкл 1%-ного раствора бычьего сьшороточного альбумина (БСА) в течение 1 ч при 37°С. Плашку снова отмывают ФСБТ и вносят в лунку по 100 мкл препарата, содер45

50

55

ют 0,01 М натрийфосфатным буфером, содержащим 0,15 М хлористого натрия (ФСБ), рН 9,5, и злюируют специфически адсорбировавшийся иммуноглобулин 0,1 М цитратом натрия с 0,15М NaCl, рН 3,5. Элюат сразу нейтрализуют 1 М раствором трис-HCl, рН 8,1. Раствор иммуноглобулинов концентрируют до 3 мг/мл и диализуют против ФСБ, рН 7,2. Иммуноглобулин гомогенен по данным электрофореза в 10%- ном полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия. Выход 70 мг на 1 л культуральной жидкости. При получении иммуноглобулинов из асцитной жидкости гибридные клетки прививают и выращивают в перитоне- альной полости мышей линии BALB/c. За 7 дней до инъекции клеток мьш)ам

1472498

жащего антитела. После инкубации в течение одного часа при 37°С плашки отмьгоают ФСБТ и обрабатьшают раствором антител к иммуноглобулинам мыши, конъюгированных с перокси дазой хрена (100 мкл на лунку, разведение 1:1000, 1 ). Плапжу еще раз отмьгоают и вносят 100 мкл 0 раствора орто-феннлендиамина

(1 мг/мл) в 1%-ном цитратном буфере (рН 4,5), содержащем 0,05% . Реакцию останавливают через 15 мин добавлением 100 мкл на лунку раст- 5 вора 2М . Отрицательным контролем слзокат лунки плашки, не содержащие IL 2, а также лунки, в которые вместо антител к IL 2 вносят нормальньп иммуноглобулин мыши.

Пример 2. Получение и очистка моноклональньк антител,

а) Получение и очистка ЛНКБ-1 антител из культуральной и асцитной жидкости.

Гибридные клетки наращивают в пластиковых матрасах в среде RPMI 1640, содержащей 10% ЭТС, 300 мг/л L-глутамина и 5 10 М 2- меркаптоэтанола При посевной плотности 5x10 кл./мл через пять дней плотность достигает 1 10 кл./мл. Культуральную жидкость с максимальной продукцией иммуноглобулинов (75 мкг/мл) получают от клеток в стационарной фазе роста (седьмой день). Очистку иммуноглобулинов проводят на протеин А-сефарозе: культу- ральную жидкость (200 мл), рН которой доводят до 8,5, наносят на ко0

5

0

5

лонку объемом 5 мл. Колонку промьша.ш. f f Ч Tlit .Ч-.ч. .

45

50

55

ют 0,01 М натрийфосфатным буфером, содержащим 0,15 М хлористого натрия (ФСБ), рН 9,5, и злюируют специфически адсорбировавшийся иммуноглобулин 0,1 М цитратом натрия с 0,15М NaCl, рН 3,5. Элюат сразу нейтрализуют 1 М раствором трис-HCl, рН 8,1. Раствор иммуноглобулинов концентрируют до 3 мг/мл и диализуют против ФСБ, рН 7,2. Иммуноглобулин гомогенен по данным электрофореза в 10%- ном полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия. Выход 70 мг на 1 л культуральной жидкости. При получении иммуноглобулинов из асцитной жидкости гибридные клетки прививают и выращивают в перитоне- альной полости мышей линии BALB/c. За 7 дней до инъекции клеток мьш)ам

вводят внутрибрюшинно по 0,5 мл пристана. Асцитнуго жидкость забирают через 14 дней после введения о клеток на мышь. С одной мьппи получают 6 мл асцитной жидкости. Пос |Ле отделения клеток центрифугированием (400xg) асцитную жидкость разбавляют до концентрации белка Юмг/м и проводят высаливание 40%-ным сульфатом аммония (2,4 г сульфата аммония на 10 мл разбавленного асщ1та). Осадок отделяют центрифугированием (lOOOOxg, 30.мин), растворяют в ФСБ буфере, рН 8,5, и диализуют против зтого же буфера. Дальнейшую очистку проводят на протеин А-сефарозе по описанной схеме. Выход гомогенного по данным электрофореза в полиакрил- амидном геле иммуноглобулина составляет 5 мг из J мя асцитной жидкости.

б)Определение концентрации ЛНКБ- антител в культуральной и асцитной жидкостях.

В лунки 96-луночной плашки вносят по 250 нг кроличьих антител к IgG мьш1и.в 0,05 М бикарбонатном буфере, рН 9,6 и инкубируют 18 ч при , Лунки плашки отмьшают ФСБТ и инкубируют с 200 мкл 1%-ного раствора бычьего сьтороточного альбумина (1 ч, ), После отмывки лунок ФСБТ по плашке раститровывают образцы (100 мкл), содержащие монокло- нальные антитела, и инкубирзпот в течение 1 ч при затем лунки плашки отмьшают ФСБТ и вносят 100 мкл кроличьих антител к IgG мьшш, мечен- ньк пероксидазой хрена. Далее ИФА проводят как описано в примере 1. В качестве стандарта используют нормальные мьш1иные иммуноглобулины. Концентрация моноклональных антител, в культуральной жидкости составляет 75 мкг/мл. Концентрация иммуноглобулина в асцитной жидкости составляет 8 мг/мл.

в)Определение константы связывания МА ЛНКБ- с IL 2.

Константу связьшания определяют с помощью ИФА по уравнению К 1/(4 МАВ - 2 МАВ), где МАЕ - кон0

5

центрация антител, соответствующая 50% связьшаниЮ от максимального; МАВ - концентрация антител, соответствующая 50% связьшанию от максимального в случае нанесения на плашку вдвое меньшего, количества антигена. Количество IL 2 нанесенного |на плашку, соответствует 100 и 50 нг/лунку. Константа связывания составляет 5 10 .

Пример 3. Использование моноклональных антител ЛНКБ-1 дЛя определения IL 2.

Культурапьный супернатант (1,5л), полученный в результате стимул;1ции клеток линии Jurkat, высаливают и наносят на колонку с ультрогелем АсА 54 (пример 1)„ После п ровед.ения

Q гельфильтрации каждую фракцию тестируют в биологическом тесте (в разведении 1:10) ив твердофазном иммуно- ферментном анализе (ЮО.мкл. из, каждой фракции вносят в плашку, далее

5 как в примере J). Иммуноферментное и биологическое тестирование дают одинаковые профили элюирования XL 2 Такую же корреляцию биологическим тестом и ИФА получают после хромаQ.; ТОГ рафии, препарата IL 2 на колонке с голубой сефарозой GL-6B.

Таким образом, использование штамма гибридных клеток ЛНКБ-1 поз- ) воляет моноклональные антитела к IL 2 человека, используя для этого более простую и экономичную технологию; кроме того, указанный штамм- продуцент является более продуктивным, чем известные: так уровень биосинтеза моноклональных антител составляет 75 мкг/мл, что на 33% больше, чем ползгчаемый в известном, продуцируемые этим штаммом моноклональные антитела имеют константу, связьгоания с интерлейкином 2 5 10 М

5

0

5

Формулаизрбретения

Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus musculus BCKK(li) № 127Д, используемьй для получения моноклональных антител к интерлей- кину 2 человека.

Изобретение относится к области иммунологии и биотехнологии. Цель изобретения - упрощение способа получения штамма - продуцента моноклональных антител (МА) к интерлейкину-2 (IL2) человека, увеличение уровня биосинтеза. Штамм получают от слияния миеломных клеток X63 AG 8 653 со спленоцитами мыши, иммунизированной препаратом 1L2, который получают из культуральной жидкости клеточной линии JURKAT. Иммунизацию мышей осуществляют однократным введением очищенного 1L2 в селезенку, слияние клеток проводят полиэтиленгликолем в присутствии 5-15% диметилсульфоксида. Затем отбирают положительные клоны по связыванию с рекомбинантной и гликозилированной формами 1L2. Штамм депонирован под номером ВСКК(П) N 127Д. Концентрация МА в культуральной жидкости 75 мкг/мл, в асците 8 мг/мл. Константа связывания МА с интерлейкином-2 составляет 5^.10⁸ М^-1. Получаемые МА являются иммуноглобулинами класса G 1 и могут быть использованы для тестирования 1L2 в биоллогических жидкостях и бактериальных лизатах, а также для создания иммуноферментных и радиоиммунных диагностикумов.