СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИНТЕРФЕРОНА В КРОВИ У ДЕТЕЙ Российский патент 1999 года по МПК G01N33/53 

Способ относится к медицине, и в частности к вирусологии, и связан с определением уровня эндогенного интерферона у человека. Интерферон является одним из основных регуляторов экстренной защиты организма от вирусных инфекций. Известно несколько типов интерферонов (α,β,γ). α- интерферон является блокатором синтеза вирусных белков в клетке, в то время как γ- интерферон, будучи одним из основных лимфокинов, наряду с противовирусной активностью обладает иммунорегулирующими свойствами, воздействует на ряд субпопуляций T- и B-лимфоцитов. В человеческом организме выработка интерферона осуществляется главным образом макрофагами и лимфоцитами. При оценки устойчивости организма к вирусным процессам, при лечении интерфероном и различными интерфероно- и иммуностимуляторами в клинической практике важным является определение интерферонного статуса, т.е. наличие эндогенного интерферона в организме и способности клеток, продуцирующих интерферон, его вырабатывать.

Известны различные способы индикации интерферона в сыворотках как человека, так и животных. Основным принципом определения интерферона служит внесение интерферонсодержащей жидкости (кровь, ликвор, моча) в выросший пласт тканевой культуры гомологичного происхождения (О.А.Аксенов, Д.А.Гвоздилова, В.И.Руденко, Ал.А.Смородинцев "Метод количественной гемадсорбции для титрования интерферона в организме мышей и человека" //В кн. "Проблемы патогенеза и иммунологии респираторных вирусных заболеваний", Л., 1969, с. 156 - 163). Для человеческих интерферонов чаще всего используют первичные культуры фибробластного типа: первичные эмбриональные человеческие фибробласты, диплоидные клетки человеческих легких и др., а также некоторые перевиваемые линии, в частности культуру L-41. Известны также способы определения интерферона непосредственно иммуноферментным тестом с закреплением на полистироле антиинтерферонной сыворотки и тестировании интерферона по ферментативной реакции. Однако и в том, и в другом типе определения интерферона практически обязательным является титрование исследуемого материала для определения величины интерферонного титра.

Все указанные способы имеют ряд недостатков. В классическом методе титрования интерферона в тканевой культуре учет цитопатогенной активности тест-вируса визуален, поэтому величина интерферонных показателей выражается в титре, что не всегда бывает объективным при тонком расчете истинных показателей активности интерферона. С другой стороны, представляет достаточную сложность точный подбор 10 - 50 ТЦД₅₀ тест-вируса, что в случае ошибки может резко изменить титр выявляемого вируса. Еще одним недостатком классического определения интерферона является достаточно большие объемы материала, идущего на исследование (сыворотка, тканевая культура, вирусы и т.д).

Недостатком же классического иммуноферментного метода выявления интерферона является следующее: во-первых, трудность получения гипериммунной антиинтерфероновой сыворотки, учитывая низкомолекулярную массу интерферона, во-вторых, при индикации интерферона антисывороткой возможно взаимодействие антител с отдельными эпитопами в неинтерферонных белках, но имеющих родственные участки с интерферонами, в-третьих, при тестировании интерферона иммуноферментным методом в одном опыте выявляется один из типов интерферона (например, альфа, или бета, или их подтипы). Поэтому большинство специалистов по интерферону предпочитают классический метод титрования интерферона в тканевой культуре, особенно с использованием пластических панелей.

Наиболее близким к предлагаемому способу является способ определения интерферона в культуре ткани L-41, выращенный в микропанелях (Кондратьева Г. А. , Екимова Е.Д., Иовлев В.И. "Определение противовирусной и антипролиферативной активности интерферона человека микрометодом" // "Реаферон", сб. науч. трудов, -Л., 2 1988, с. 156 - 163). Сыворотки или другой материал вносится в выросшую тканевую культуру в разведении с 1:4 до 1:64. Через сутки инкубации пробы интерферона отсасывают и в культуру вносят 10 цитопатогенных доз вируса везикулярного стоматита. Через 24 ч определяют титр интерферона в каждой из проб по задержке размножения вируса и появлению цитопатогенного эффекта, выявляемого по витальной окраске клеток.

Главным недостатком данного прототипного способа является необходимость титрования интерферонсодержащих материалов, тем более, что оно производится в двух параллельных рядах. Все это не дает возможности проводить массовое обследование интерферонного статуса, так как на одной микропанели нельзя испытать более 20 исследуемых материалов. С другой стороны, визуальный учет интерферона и отсутствие цифрового показателя в прототипном способе снижает возможность точной оценки его титра и ограничивает возможности интерпретации показателей в научно-исследовательских разработках. Указанные недостатки устраняются предлагаемым заявителем способом.

Сущность заявляемого способа заключается в том, что интерферон определяется так же, как и в прототипе на культуре, выросшей на полистирольной микропанели, однако интерферонсодержащие жидкости от каждого обследуемого вносятся в одном разведении в одну лунку панели. Это создает возможность обследования большого количества проб на содержание интерферона, так как на одной панели можно обследовать 80 материалов. Далее проводится инкубация при 37^oC, 3%-ном содержании CO₂ в течение 18 ч. Наличие CO₂ препятствует развитию бактериальной флоры даже в случаях, когда исследуемые пробы содержаться в нестерильных условиях. Тест-вирусом для определения интерферона берется мышиный вариант вируса Сендай, так как этот вирус обладает гемосорбирующими свойствами. Гемосорбция необходима для того, чтобы осуществив лизис сорбированных на зараженном пласте эритроцитов, можно точно определить количество инактивированного вируса по одной лунке без использования титрования, как в прототипном способе. Однако, если измерять непосредственно гемоглобин, то величина в условиях панельного определения интерферона очень мала из-за малого числа выросших клеток в одной лунке и соответственно небольшого количества специфически сорбированных эритроцитов на зараженных клетках. Особенностью данного способа является то, что найден метод усиления показателей лизата эритроцитов, которые минимальны и иногда не улавливаются спектрофотометрически. Используются свойства оксидазных ферментов лизата эритроцитов вызывать ферментативное изменение цветности субстрата ортофенилендиамина при его окислении. С этой целью в лунку панелей вносится смесь 0,06%-ного раствора ортофенилендиамина с 3%-ной перекисью водорода. Через 20 мин инкубации при комнатной температуре в защищенном от света месте реакцию останавливают IN серной кислотой и цветность учитывают на спектрофотометре типа АИФ-Ц01С.

Таким образом, с помощью заявляемого способа оказывается возможным использовать количественный показатель вирусной гемосорбции для определения интерферона и тем самым исключить необходимость использования титрования. Это дает возможность использования одной лунки для определения интреферона в каждой пробе.

Способ осуществляется следующим образом.

Культура клеток L-41 в среде Игла вносится во все лунки микропанели в объеме 100 мкл и выращивается при температуре 37^oC и 3%-ной концентрации CO₂ в течение 24 ч. Затем в выросший пласт вносятся сыворотки или другие материалы в разведении 1:20 в объеме 250 мкл и инкубируются в таких же условиях в течение 18 - 24 ч. В двух последних рядах панели производится замена на свежий раствор Игла. Следующим этапом является внесение вируса Сендей в предварительно выбранной дозе (доза выбирается при титровании вируса в культуре клеток и составляет 10⁷ ЭИД₅₀). Вирус вносится во все лунки микропанели, кроме последнего ряда, где производится смена фазы на свежий раствора Игла (контроль культуры ткани). После суточной инкубации при 37^oC и 3%-ной концентрации CO₂ осуществляется учет результатов. Для этого из микропанели удаляется ее содержимое с помощью отсасывания, один раз отмывается раствором Игла и затем во все лунки вносится 0,05%-ная взвесь эритроцитов морской свинки на 30 минут при комнатной температуре. После многократной отмывки (5 - 6 раз) мединал-вероналовым буфером вносится дистиллированная вода во все лунки в объеме 100 мкл, при наступлении гемолиза вносится 50 мкл 0,06%-ного раствора ортофенилендиамина в перекиси водорода, затем реакция останавливается добавлением 50 мкл IN серной кислоты. Учет производится на иммуноферментном анализаторе АИФ-Ц01С в программе 22 (рабочая длина волны 490 нм, фоновая длина волны 620 нм).

Пример. Было исследовано 78 сывороток от больных с сочетанной респираторно-вирусно-дифтерийной инфекцией. Все сыворотки разделены 1:20 и исследованы описанным способом. В таблицах 1, 2 представлены показатели снижения экстинции для каждой из 78 сывороток и титр интерферона по математическому расчету снижения экстинции, выведенному из титрования стандартного интерферона (в обратных величинах логарифмов, соответствующих международным единицам). Очевидно, что из 78 сывороток на одной панели 5 сывороток не имели интерферона, 18 сывороток имели интерферон до 10 МЕ, 41 сыворотка - 10 - 30 МЕ, 14 сывороток - 30 - 100 МЕ.

Таким образом предложен способ, позволяющий в течение 48 часов, а при некоторых случаях при внесении интерферона за 7 - 8 часов до вируса и через 24 - 25 часов, определять уровень интерферона у значительной массы обследуемого контингента (больные, доноры и т.д.). Основным преимуществом метода является то, что одновременно возможно на 3 - 4-х панелях с минимальными затратами реактивов (тканевой культуры вируса и т.д.) протестировать от 200 до 300 обследуемых материалов. Более того, метод титрования интерферона заменен количественным (цифровым) тестом, позволяющим легко осуществлять калибровку и определение истинной активности интерферона по испытанию в одной лунке тканевой культуры.

Важным моментом предложенного способа является ферментное тестирование вирусного размножения в тканевой культуре. Вирус Сендай обладает свойствами сорбировать виды эритроцитов, в том числе и эритроциты морской свинки. Тестирование вирусного размножения по лизису адсорбированных на клетках тканевой культуры эритроцитов общеизвестно, однако измерение активности гемадсорбции производится чаще всего по гемоглобину. При использовании капельного метода эти показатели минимальны, поэтому количественное определение интерферона в данном случае практически невозможно из-за невозможности учета реакции. Мы применили оригинальный способ количественного выявления размножения вируса Сендай, соединив принцип учета по гемосорбции с выявлением активности лизиса с помощью количественной оценки оксидазных ферментов в лизате эритроцитов. Введенный в реакцию субстрат ортофенилендиамин окисляется под действием оксидазных ферментов лизата эритроцитов в 2,4-ортонитрофенол, цифровой показатель спектрального пропускания которого выше при длине волн 492 нм, чем аналогичный показатель гемоглобина лизата, измеренный при длине волны 405 нм. Таким образом, подъем цифрового порога дает возможность определять интерфероны различной активности по снижению цифрового показателя.

Данный способ наиболее целесообразен при исследовании интерферона у детей: отсутствие необходимости раститровывать интерферон резко уменьшает нужный объем сыворотки для исследования, что особенно важно у детей 1-х месяцев жизни (требуемый объем исходной сыворотки ребенка для исследования 50 мкл). В то же время достаточно короткий период проведения исследования (48 ч всего), а в ряде случаев при использовании данного метода сокращение периода между внесением сыворотки и заражением культуры до 7 ч (суммарное время исследования 24 ч) значительно облегчает обследование на интерферон детей с целью определения интерферонового статуса для назначения интерферонных препаратов и контроля за их введением.

В заключение необходимо отметить также, что в современных условиях российского здравоохранения метод является очень экономичным, так как в 4 раза сокращается необходимое количество тканевой культуры для постановки данного теста и ростовых питательных сред. При стоимости 1 млн клеток культуры L-41 - 2000 - 4000 руб. это дает экономию в 200 000 руб. по сравнению с прототипным способом при определении интерферона в 500 пробах.

Способ может быть использован в области медицины, в частности в вирусологии, и связан с определением уровня эндогенного интерферона. Для определения используют задержку цитопатогенного действия тествируса в культуре ткани, выращенной на полистироловых планшетах. Исследуемый материал от детей вносят в одном разведении в выросшую тканевую культуру, инкубируют в течение 18 ч при температуре 37^oС и 3%-ном содержании СО₂, после чего культуру инфицируют 10⁷ ЭИД вируса Сендай и через 18 ч при тех же условиях инкубации на зараженный пласт сорбируют эритроциты морской свинки. Затем эритроциты лизируют водой, вносят в лунки 0,06%-ный раствор ортофенилендиамина в смеси с 3%-ной перекисью водорода, через 20 мин останавливают реакцию 1N серной кислотой и учитывают результат на иммуноферментном анализаторе. Активность интерферона оценивают по уровню снижения показателей в лунках с испытуемыми материалами по сравнению с вирусным контролем. Способ обеспечивает точную оценку титра интерферона. 2 табл.

Способ определения интерферона в крови детей путем задержки цитопатогенного действия тест-вируса в культуре ткани, выращенной на полистироловых планшетах, отличающийся тем, что исследуемый материал от детей вносят в одном разведении в выросшую тканевую культуру, инкубируют 18 ч при 37^oC и 3%-ном содержании CO₂, после чего культуру инфицируют 10⁷ ЭИД вируса Сендай и спустя 18 ч при таких же условиях инкубации на зараженный пласт сорбируют эритроциты морской свинки, специфически адсорбированные эритроциты лизируют дистиллированной водой, затем в лунки панелей вносят 0,06%-ный раствор ортофенилендиамина в смеси с 3%-ной перекисью водорода, спустя 20 мин останавливают реакцию 1 N серной кислотой и учитывают результат на иммуноферментном анализаторе, активность интерферона оценивают по уровню снижения показателей в лунках с испытуемыми материалами по сравнению с вирусным контролем.