СИНТЕЗ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ Российский патент 2012 года по МПК C07H21/00 C07D233/58 

Область техники, к которой относится изобретение

Данное изобретение относится к способам получения олигонуклеотидов.

Уровень техники

Олигонуклеотиды являются ключевыми соединениями в области естественных наук, играющими важные роли в различных областях. Они, например, используются в качестве зондов в области анализа экспрессии генов, в качестве праймеров в полимеразно-цепной реакции (ПЦР) или секвенировании ДНК.

Кроме того, существует также множество потенциальных терапевтических применений, которые включают, например, http://www.multitran.ru/c/m.exe?t=4117011_1_2антисмысловые олигонуклеотиды.

Растущее число применений требует большего количества олигонуклеотидов, следовательно, существует насущная потребность в разработке улучшенных способов их синтеза.

Для общего обзора см., например, "Antisense - From Technology to Therapy" Blackwell Science (Oxford, 1997).

Одним из известных типов строительных блоков в синтезе олигонуклеотидов являются фосфорамидиты; см., например, S.L Beaucage, M. H. Caruthers, Tetrahedron Letters 1859 (1981) 22. Эти фосфорамидиты нуклеозидов, дезоксирибонуклеозидов и их производных коммерчески доступны. 3'-O-фосфорамидиты применяются в обычном твердофазном синтезе, но в других синтетических процедурах также используют 5'-О и 2'-О-фосфорамидиты. Одной из стадий в получении таких фосфорамидитов нуклеозидов является фосфитилирование (защищенных) нуклеозидов. После фосфитилирования полученные амидиты обычно выделяют с использованием дорогостоящих способов разделения, например хроматографии. После выделения чувствительные амидиты должны храниться в специальных условиях (например, при низкой температуре, обезвоженными). При хранении качество амидитов может снижаться в результате определенной степени их разложения и гидролиза. Могут происходить обе эти побочные реакции, а их результаты становятся заметными. Наиболее часто гидроксильная группа и аминогруппы, а также остальные функциональные группы, присутствующие в нуклеозиде, защищают перед фосфитилированием оставшейся 3'-, 5'- или 2'-O-гидроксильной группы.

Эти фосфорамидиты затем конденсируют с гидроксильными группами нуклеотидов или олигонуклеотидов. Применение выделенного амидита также может приводить к частичному гидролизу при конденсации амидита.

Фосфорамидиты являются дорогостоящими соединениями. Обычная цена дезоксиамидитов находится в диапазоне 40.00 евро за грамм. Соответствующие строительные блоки РНК стоят еще дороже.

Сущность изобретения

Задачей данного изобретения является предложение способа получения олигонуклеотидов, преодолевающего, по меньшей мере, некоторые недостатки предшествующего уровня техники.

В одном из вариантов реализации данное изобретение представляет способ получения олигонуклеотида, включающий стадии:

a) предоставление гидроксилсодержащего соединения, имеющего формулу

в которой

B представляет собой гетероциклическое основание

и

i) R₂ представляет собой H, защищенную 2'-гидроксильную группу, F, защищенную аминогруппу, О-алкильную группу, O-замещенный алкил, замещенный алкиламино или C4'-О2' метиленовый мостик,

R₃ представляет собой OR'₃, NHR"₃, NR"₃R'"₃, где R'₃ представляет собой группу, защищающую гидроксил, защищенный нуклеотид или защищенный олигонуклеотид, R"₃, R'"₃ независимо друг от друга представляют собой группы, защищающие амин,

и R₅ представляет собой OH

или

ii) R₂ представляет собой H, защищенную 2'-гидроксильную группу, F, защищенную аминогруппу, O-алкильную группу, O-замещенный алкил, замещенный алкиламино или C4'-О2' метиленовый мостик,

R₃ представляет собой OH и

R₅ представляет собой OR'₅ и R'₅ представляет собой группу, защищающую гидроксил, защищенный нуклеотид или защищенный олигонуклеотид

или

iii) R₂ представляет собой OH,

R₃ представляет собой OR'₃ , NHR"₃, NR"₃R'"₃, где R'₃ представляет собой группу, защищающую гидроксил, защищенный нуклеотид или защищенный олигонуклеотид, R"₃, R"'₃ независимо друг от друга представляют собой группы, защищающие амин, и

R₅ представляет собой OR'₅ и R'₅ представляет собой группу, защищающую гидроксил, защищенный нуклеотид или защищенный олигонуклеотид;

b) взаимодействие указанного соединения с фосфитилированным агентом в присутствии активатора, имеющего формулу I (активатор I)

в которой

R представляет собой алкил, циклоалкил, арил, аралкил, гетороалкил, гетероарил,

R₁, R₂ представляют собой H, либо образуют 5-6-членное кольцо,

X₁, X₂ независимо друг от друга представляют собой N или CH,

Y представляет собой H или Si(R₄)₃, где R₄ представляет собой алкил, циклоалкил, арил, аралкил, гетероалкил, гетероарил,

B представляет собой депротонированную кислоту,

с получением фосфитилированного соединения,

c) взаимодействие указанного фосфитилированного соединения без его выделения с вторым соединением, имеющим формулу

в которой R₅, R₃, R₂, B выбраны независимо друг от друга, но имеют те же определения, как указано выше,

в присутствии активатора II, выбранного из группы, состоящей из тетразола, производных тетразола, 4,5-дицианоимидазола, трифторацетата пиридиния и их смеси.

В соответствии с данным изобретением фосфитилированное соединение получают путем фосфитилирования гидроксильной группы нуклеозида, нуклеотида или олигонуклеотида с использованием активаторов, имеющих формулу I, которые предпочтительно являются производными имидазола.

Полученный чувствительный фосфорамидит без очистки или выделения конденсируют с гидроксильными группами нуклеозидов, нуклеотидов или олигонуклеотидов в присутствии активатора II, иного чем активатор I. Ни выделения полученного фосфорамидита, ни отделения амидита от активатора I не проводится. Предпочтительно реакция продолжается в том же реакционном сосуде. Активатор II используют в присутствии активатора I.

Активаторы конденсации амидита, известные из уровня техники, имели высокую реакционную способность в активировании функции амидита. Использование такого активатора для процедуры фосфитилирования приводит также к определенной степени «избыточной реакции» (например, к образованию 3'-3' побочного продукта). Чтобы преодолеть эту и другие проблемы, реакционная способность активатора модулируется. В этом случае реакция селективно прекращается на уровне амидита, по существу свободного от побочных продуктов, таких как 3'-3'-побочный продукт. Только этот результат (образование амидита in situ) позволяет продолжить такой процесс путем начала конденсации амидита.

Активатор II способен индуцировать стадию конденсации. После добавления активатора II амидит вступает в амидитную конденсацию.

Можно использовать в качестве активатора II все активаторы (иные, чем активатор I), которые способны активировать полученный амидит для реакции с гидроксилсодержащим соединением на стадии c); т.е. тетразол и производные тетразола. Предпочтительными производными тетразола являются бензилмеркаптотетразол и этилтиотетразол (ETT). Подходящие соединения выбраны из группы, состоящей из азотсодержащих гетероциклов, имеющих непротонированную форму водорода кислоты, пиридина, солей пиридина и их смесей. Азотсодержащие гетероциклы имеют N⁰-H связь, т.е. N не протонирован. Эти соединения могут быть использованы в виде солей путем комбинирования с кислотами, такими как кислоты H⁺B^-, в которых B^- имеет такое же значение, как определено в формуле изобретения. Другим подходящим активатором II является пиридин, предпочтительно трифторацетат пиридиния.

Предпочтительные соединения выбраны из группы, состоящей из тетразола, производных тетразола, 4,5-дицианоимидазола, трифторацетата пиридиния и их смесей.

После конденсации обычно применяют окисление (образование PO) или сульфирование (образование PS). Для образования PO предпочтителен пероксидный подход. Эту реакцию возможно выполнить без каких-либо стадий экстракции (йодное окисление требует нескольких стадий экстракции).

В случае сульфирования возможно использование любого известного реагента для сульфирования (т.е. PADS, S-Tetra, beaucage). Предпочтительным реагентом для образования PS является сера. Разница в стоимости продукции свидетельствует в пользу применения серы.

В одном варианте реализации реакция может протекать в присутствии ацетона.

Фосфитилирующий агент может быть использован в более или менее эквимолярном количестве по отношению к гидроксильным группам гидроксилсодержащего соединения.

В другом варианте реализации может быть использован избыток, например 3-5 моль/моль, гидроксильных групп в гидроксилсодержащем соединении.

В еще одном предпочтительном варианте реализации полимерный спирт добавляют после стадии b) по п. 1 [формулы изобретения]. Подходящие полимерные спирты включают в себя поливиниловый спирт (PVA), коммерчески доступный как PVA 145000 фирмы Merck, Дармштадт. Предпочтительным является крупнопористый PVA с размером частиц >120 мкм (80%). Подходящими также являются мембраны с гидроксильными группами или другими соединениями, способными образовывать енолы.

Активатор I может быть использован в стехиометрическом, каталитическом (3-50 моль %, предпочтительно - 10-30 моль %) количестве или в избытке.

В предпочтительном варианте реализации активатор I имеет формулу, выбранную из группы, состоящей из

в которых

Y представляет собой H или Si(R₄)₃, где R₄ представляет собой алкил, циклоалкил, арил, аралкил, гетероалкил, гетероарил,

B представляет собой депротонированную кислоту,

R представляет собой метил, фенил или бензил.

Получение этих активаторов описано, например, в Hayakawa et al, J. Am. Chem. Soc. 123 (2001) 8165-8176.

В одном варианте реализации активатор используют в комбинации с добавкой. Добавки могут быть выбраны из непротонированных форм соединений, имеющих формулу I, и других гетероциклических оснований, например пиридина. Походящими соотношениями между активатором и добавкой являются 1:1-1:10.

В одном из предпочтительных вариантов реализации активатор может быть получен, следуя процедуре «in situ». В этом случае активатор не выделяют, что приводит к улучшению результатов реакции. Гидролиз или разложение целевой молекулы подавляются.

Для более высокого выхода фосфитилирования в 3'- и/или 5'-положении олигонуклеотидов (ди, три, тетра, пента, гекса, гепта и октамеров) получение активатора in situ и комбинация с добавкой предпочтительны.

Как описано выше, фосфитилирование особенно полезно при синтезе олигонуклеотидов и фосфорамидитных строительных блоков. Следовательно, в предпочтительном варианте реализации гидроксилсодержащее соединение представляет собой остаток сахара, например нуклеозид или полученный из него олигомер. Такими нуклеозидами являются, например, аденозин, цитозин, гуанозин и урацил, дезоксиаденозин, дезоксигуанозин, дезокситимидин, дезоксицитозин и их производные, возможно содержащие защитные группы.

Обычно они должны быть подходящим образом защищены по функциональным группам гетероцикла и гидроксильным группам, за исключением одной, которая должна быть фосфитилирована. Типичными группами, которые используются в качестве защитных для 5'OH-групп, являются диметокситритил, монометокситритил или трет-бутилдиметилсилил (TBDMS), что позволяет провести фосфитилирование 3'-OH группы. Другими возможными группами являются фосфаты и H-фосфонаты, см., например,

В случае фосфоэфира и фосфодиэфира R может быть выбран из алкила, арила, алкиларила. Фенил является предпочтительным.

Другие группы, защищающие гидроксил в 5', 3' и 2' [положениях], хорошо известны в данной области техники, например TBDMS.

В целом, фосфитилирующий агент может быть тем же самым, что при реакции фосфитилирования с использованием 1-H-тетразола.

В предпочтительном варианте реализации он имеет формулу

в которой Z представляет собой уходящую группу, например, -CH₂CH₂CN, -CH₂CH=CHCH₂CN, пара-CH₂C₆H₄CH₂CN, -(CH₂)_2-5N(H)COCF₃, -CH₂CH₂Si(C₆H₅)₂CH₃, или -CH₂CH₂N(CH₃)COCF₃, а R₁ и R₂ независимо друг от друга представляют собой вторичные аминогруппы N(R₃)₂, в которых R₃ представляет собой алкил, имеющий от 1 до около 6 атомов углерода; или R₃ представляет собой гетероциклоалкильное или гетероциклоалкенильное кольцо, содержащее от 4 до 7 атомов и имеющее до 3 гетероатомов, выбранных из азота, серы и кислорода.

Типичный фосфитилирующий агент представляет собой 2-цианоэтил-N,N,N',N'-тетраизопропилфосфородиамидит.

Другими предпочтительными фосфитилирующими реагентами являются производные оксазафосфолидина, как описано в N. Ok et al., J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 8307-8317, включенном сюда в качестве ссылки. Этот фосфитилирующий агент позволяет осуществить синтез олигонуклеотидов, в котором межнуклеотидная связь стереоселективным образом преобразуется в фосфотиоаты. Такие диастереоселективно синтезированные межнуклеотидные фосфотиоатные связи имеют многообещающее влияние на применение фосфотиоатов в качестве антисмысловых препаратов или иммуностимулирующих препаратов.

Фиг. 1 показывает схему реакции в соответствии с данным изобретением.

Подходящими примерами депротонированных кислот B^- являются трифторацетат, трифлат, дихлорацетат, мезил, тозил, o-хлорфенолят. Кислоты с pKa ниже 4,5 предпочтительны. Предпочтительно они имеют низкую нуклеофильность.

В одном из вариантов реализации реакцию проводят в присутствии молекулярных сит для обезвоживания реакционной среды. В целом, вода должна быть устранена или связана путем обезвоживания среды в ходе реакции.

Возможно также комбинировать активатор I по данному изобретению с фосфитилирующим агентом и добавить гидроксильный компонент позже. Также возможно комбинировать активатор I с гидроксилсодержащим соединением и добавить потом фосфитилирующий агент.

В случае использования добавки активатор смешивают с гидроксильным компонентом перед добавлением фосфитилирующего агента.

Для получения активатора «in situ» выбранную кислоту предпочтительно добавляют после добавления добавки при контролируемой температуре реакции.

Фосфитилирующий агент может быть добавлен перед добавлением выбранной кислоты или после него.

Относительно добавления кислоты и фосфитилирующего агента нуклеозидный компонент может быть добавлен в конце или в начале.

В предпочтительном варианте реализации соответствующее основание активатора, гидроксилсодержащее соединение и фосфитилирующий агент объединяют и кислоту добавляют в начале реакции.

Фосфитилированное соединение (фосфорамидит) затем конденсируют с гидроксильной группой нуклеозида, нуклеотида или олигонуклеотида в присутствии активатора II.

После реакции соединения, описанной выше, полученный триэфир подвергают окислению. Окисление может быть использовано, например, для получения стабильных фосфатных и тиофосфатных связей.

Так, как это используется в данном документе, термин «олигонуклеотиды» охватывает также олигонуклеозиды, аналоги олигонуклеотидов, модифицированные олигонуклеотиды, миметики нуклеотидов и им подобные в форме РНК и ДНК. В целом, эти соединения образуют скелет связанных мономерных субъединиц, где каждая связанная мономерная субъединица прямо или косвенно присоединена к остатку гетероциклического основания. Связи, соединяющие мономерные субъединицы, мономерные субъединицы и остатки гетероциклических оснований могут варьировать по структуре, приводя к множественности вариантов образующихся соединений.

Данное изобретение особенно полезно в синтезе олигонуклеотидов, имеющих формулу X_n, в которой каждый X выбран из A, dA, C, dC, G, dG, U, dT и n=2-30, предпочтительно - 2-12, более предпочтительно 2-8 или 2-6, и их производных, содержащих защитные группы. Модификации, известные в данной области техники, являются модификациями гетероциклических оснований, сахара или связей, соединяющих мономерные субъединицы. Вариации межнуклеотидных связей описаны, например, в WO 2004/011474, начиная с низа страницы 11, включенной в качестве ссылки.

Типичными производными являются фосфотиоаты, фосфодитиоаты, метил- и алкил-фосфонаты и фосфоноацетопроизводные.

Другие типичные модификации имеют место в остатках сахара. Либо рибоза заменена другим сахаром, либо одно или более положений являются замещенными другим группами, такими как F, O-алкил, S-алкил, N-алкил. Предпочтительный вариант реализации представляет собой 2'-метил и 2'-метоксиэтокси. Все эти модификации известны в данной области техники.

Что касается остатка гетероциклического основания, то существует множество других синтетических оснований, которые используются в данной области техники, например 5-метилцитозин, 5-гидрокси-метилцитозин, ксантин, гипоксантин, 2-аминоаденин, 6- или 2-алкильные производные аденина и гуанина, 2-тиоурацил. Такие модификации также описаны в WO 2004/011474, начиная со страницы 21.

При использовании в синтезе эти основания обычно имеют защитные группы, например, N-6-бензиладенин, N-4-бензилцитозин или N-2-изобутирилгуанин. В целом, все реакционноспособные группы, которые не предназначены для участия в последующей реакции, должны быть защищены, особенно гидроксильные группы сахара.

В вариантах реализации, относящихся к синтезу олигонуклеотидов, полезно проведение реакции в присутствии альдегидов или кетонов, которые могут быть использованы либо как реакционная среда, либо как дополнительный растворитель вместе с другими растворителями.

Подходящими соединениями являются таковые, способные образовывать енолы. Типичные соединения имеют формулу R₁R₂C=O, в которой R₁ и R₂ независимо друг от друга представляют собой H или состоят из 1-20 атомов углерода, которые могут образовывать циклические структуры сами по себе, или R₁ и R₂ образуют циклические системы вместе, в которых ни R₁, ни R₂ не являются H. Особенно предпочтительным кетоном является ацетон. Присутствие ацетона подавляет активность любых количеств аминов, таких как диизопропиламин (DIPA), которые освобождаются в ходе процесса фосфитилирования. Это может быть использовано для фосфитилирования более коротких и более длинных олигонуклеотидов со сходными результатами (отсутствие разложения). Другие кетоновые соединения, имеющие формулу R_x-C(=O)-R_y, в которой R_X и R_y независимо друг от друга представляют собой C₁-С₆ алкил или вместе образуют циклоалкил, также могут быть использованы постольку, поскольку они способны образовывать енолаты в присутствии, например, аминов с CH₂-группой в α-положении.

Данное изобретение далее иллюстрируется следующими неограничивающими примерами.

Пример 1

Синтез 5'-О-DMTr-T-T-3'-O-Lev цианоэтилфосфотриэфира через получение in situ 5'-О-DMTr-T-3'-O-фосфорамидита с применением трифторацетата метилимидазолия (MIT)

5,0 г 5'-О-DMTr-T-3'-OH (9,2 ммоль, 1.0 экв.) и 2,34 г MIT (11,9 ммоль, 1,3 экв.) растворяли в 100 мл дихлорметана и добавляли 3 г молекулярных сит 3Е (ангстрем), и смесь перемешивали в течение 10 мин. Добавляли 3,8 мл 2-цианоэтил N,N,N',N'-тетра-изопропилфосфордиамидита (11,9 ммоль, 1,3 экв.). Образование 5'-О-DMTr-T-3'-О-фосфорамидита завершалось через 2 ч, после чего добавляли 3,28 г 5'-OH-T-3'-O-Lev (9,64 ммоль, 1,05 экв.) и 51 мл раствора тетразола (0,45 M, 22,95 ммоль, 2,5 экв.) и перемешивали в течение ночи. Образовавшийся трехзамещенный фосфит окисляли добавлением 4,57 г I₂, 140 мл тетрагидрофурана (THF), 35 мл пиридина и 4 мл H₂O. Реакция завершилась через 10 мин. Реакционную смесь выпаривали, растворяли в 300 мл дихлорметана, экстрагировали 200 мл насыщенного раствора тиосульфата натрия, а затем экстрагировали 200 мл насыщенного раствора гидрокарбоната натрия. Объединенные водные слои экстрагировали 30 мл дихлорметана, объединенные органические слои обезвоживали сульфатом магния, а растворитель выпаривали. Выход составил 9,0 г (бесцветная пена): 98%; чистота (определено с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ)): 84%.

Пример 2

Синтез 5'-О-DMTr-dC ^Bz -T-3'-О-Lev цианоэтилфосфотриэфира через получение 5'-О-DMTr-dC ^Bz -3'-О-фосфорамидита in situ с использованием трифторацетата метилимидазолия (MIT)

108 мг MIT (0,56 ммоль, 1,5 экв.) и 224 мг 5'-О-DMTr-dC^Bz-3'-OH (0,37 ммоль, 1,0 экв.) растворяли в 9 мл дихлорметана и добавляли 300 мг молекулярных сит 3Е. 140 мкл 2-цианоэтил N,N,N',N'-тетраизопропилфосфордиамидита (0,44 ммоль, 1,2 экв.) добавляли к перемешиваемому раствору. Образование 5'-О-DMTr-dC^Bz-3'-O-фосфорамидита завершалось через 30 мин. Смесь фильтровали, добавляли 125 мг 5'-OH-T-3'-О-Lev (0,37 ммоль, 1,0 экв.) и 2 мл раствора тетразола (0,45 M, 0,9 ммоль, 2,4 экв.) и перемешивали в течение ночи. Образовавшийся трехзамещенный фосфит окисляли добавлением 10 мл окислительного раствора (254 мг I₂, 7,8 мл THF, 1,9 мл пиридина и 222 мкл H₂O). Реакция завершалась через 30 мин. Выход (определенный с помощью ВЭЖХ): 66%.

Пример 3

Синтез 5'-О-DMTr-dC ^Bz -dG ^iBu -3'-О-Lev цианоэтилфосфоротиоатного триэфира через получение 5'-O-DMTr-dC ^Bz -3'-O-фосфорамидита in situ с использованием трифторацетата метилимидазолия (MIT)

2,57 г 5'-О-DMTr-dC^Bz-3'-OH (6,0 ммоль, 1,0 экв.) и 1,76 г MIT (9,0 ммоль, 1,5 экв.) растворяли в 6 мл ацетона и 6 мл ацетонитрила и добавляли 3,0 г молекулярных сит 3Е. 2,46 мл 2-цианоэтил N,N,N',N'-тетраизопропилфосфордиамидита (7,74 ммоль, 1,3 экв.) добавляли к перемешиваемому раствору. Образование 5'-О-DMTr-dC^Bz-3'-О-фосфорамидита завершалось через 30 мин. Раствор фильтровали и добавляли к раствору 2,48 г 5'-OH-G^iBu-3'-О-Lev (5,7 ммоль, 0,95 экв.) и 2,3 г бензилмеркаптотетразола (12,0 ммоль, 2,0 экв.) в 20 мл дихлорметана и 20 мл ацетонитрила и перемешивали 30 мин. Раствор, содержащий образовавшийся трехзамещенный фосфит фильтровали и сульфировали добавлением 14 г полимер-связанного тетратионата (25,2 ммоль, 4,2 экв.). Реакция завершалась через 16 ч. Выход (определенный с помощью ВЭЖХ): 84%.

Пример 4

Синтез 5'-О-DMTr-dC ^Bz -dC ^Bz -3'-О-Lev цианоэтилфосфоротиоатного триэфира через получение 5'-О-DMTr-dC ^Bz -3'-О-фосфорамидита in situ с использованием трифторацетата метилимидазолия (MIT)

10 г 5'-О-DMTr-dC^Bz-3'-OH (15,8 ммоль, 1,0 экв.) и 7,75 г MIT (39,5 ммоль, 2,5 экв.) растворяли в 30 мл дихлорметана и 30 мл ацетонитрила, добавляли 10 г молекулярных сит 3Е и смесь перемешивали в течение 30 мин. 9,0 мл 2-цианоэтил N,N,N',N'-тетраизопропилфосфордиамидита (28,4 ммоль, 1,8 экв.) растворяли в 15 мл дихлорметана и 15 мл ацетонитрила. Раствор 5'-О-DMTr-dC^Bz-3'-OH и MIT по каплям добавляли к перемешиваемому раствору 2-цианоэтил N,N,N',N'-тетраизопропилфосфордиамидита. Образование 5'-О-DMTr-dC^Bz-3'-O-фосфорамидита завершалось через 30 мин. Этот раствор фильтровали и добавляли к раствору 5,43 г 5'-OH-C^Bz-3'-О-Lev (12,6 ммоль, 0,8 экв.) и 7,6 г бензилмеркаптотетразола (39,5 ммоль, 2,5 экв.) в 90 мл диметилформамида и 450 мл ацетонитрила и перемешивали в течение 10 мин. Раствор, содержащий образовавшийся трехзамещенный фосфит, фильтровали и сульфировали добавлением 50 г полимер-связанного тетратионата (90 ммоль, 5,7 экв.). Реакция завершалась через 16 ч. Выход (определенный с помощью ВЭЖХ): 80%.

Пример 5

Синтез 5'-О-DMTr-dA ^Bz -dG ^iBu -3'-О-Lev цианоэтилфосфоротиоатного триэфира через получение 5'-О-DMTr-dA ^Bz -3'-O-фосфорамидита in situ с использованием трифторацетата метилимидазолия (MIT)

5,0 г 5'-ODMTr-dA^Bz-3'-OH (5,8 ммоль, 1,0 экв.) и 1,8 г MIT (9,2 ммоль, 1,6 экв.) растворяли в 50 мл ацетона и 50 мл ацетонитрила, добавляли 2,5 г молекулярных сит 3Е и смесь перемешивали в течение 15 мин. 3,0 мл 2-цианоэтил N,N,N',N'-тетраизопропилфосфордиамидита (9,5 ммоль, 1,6 экв.) добавляли к перемешиваемому раствору. Образование 5'-О-DMTr-dA^Bz-3'-О-фосфорамидита завершалось через 1 ч. Этот раствор фильтровали и добавляли к раствору 2,22 г 5'-OH-G^iBu-3'-O-Lev (5,1 ммоль, 0,94 экв.) и 2,9 г бензил-меркаптотетразола (15,1 ммоль, 2,6 экв.) в 25 мл дихлорметана и 25 мл ацетонитрила и перемешивали в течение 40 мин. Раствор, содержащий образовавшийся трехзамещенный фосфит, фильтровали и сульфировали добавлением 2 г полимер-связанного тетратионата (3,6 ммоль, 3,9 экв.). Реакция завершалась через 16 ч. Выход (определенный с помощью ВЭЖХ): 71%.

Пример 6

Синтез 5'-О-DMTr-T-dG ^iBu -3'-О-Lev цианоэтилфосфоротиоатного триэфира через получение 5'-О-DMTr-T-3'-О-фосфорамидита in situ с использованием трифторацетата метилимидазолия (MIT)

5,0 г 5'-О-DMTr -T-3'-OH (9,2 ммоль, 1,0 экв.) и 2,7 г MIT (13,5 ммоль, 1,5 экв.) растворяли в 50 мл ацетона и 50 мл ацетонитрила, добавляли 2,5 г молекулярных сит 3Е и смесь перемешивали в течение 15 мин. 3,0 мл 2-цианоэтил N,N,N',N'-тетраизопропилфосфордиамидита (9,5 ммоль, 1,03 экв.) добавляли к перемешиваемому раствору. Образование 5'-О-DMTr-T-3'-О-фосфорамидита завершалось через 1 ч. Этот раствор фильтровали и добавляли к раствору 4,44 г 5'-OH-G^iBu-3'-О-Lev (10,2 ммоль, 1,1 экв.) и 5,3 г бензилмеркаптотетразола (27,6 ммоль, 1,6 экв.) в 50 мл дихлорметана и 50 мл ацетонитрила и перемешивали в течение 2 ч. Раствор, содержащий образовавшийся трехзамещенный фосфит, фильтровали и сульфировали добавлением 30 г полимер-связанного тетратионата (54 ммоль, 5,9 экв.). Реакция завершалась через 16 ч. Выход (определенный с помощью ВЭЖХ): 90%.

Пример 7

Синтез 5'-О-DMTr-T-dC ^Bz -dC ^Bz -dC ^Bz -3'-О-Lev цианоэтилфосфоротиоатного триэфира через получение 5'-О-DMTr-T-P(S)-dC ^Bz -3'-О-фосфорамидита in situ с использованием трифторацетата метилимидазолия (MIT)

100 мг 5'-О-DMTr-T-P(S)-dC^Bz-3'-OH (0,10 ммоль, 1,0 экв.) и 24,4 мг MIT (0,11 ммоль, 1,1 экв.) растворяли в 10 мл дихлорметана, добавляли 200 мг молекулярных сит 4Е. 32 мкл 2-цианоэтил N,N,N',N'-тетраизопропилфосфордиамидита (0,10 ммоль, 1,0 экв.) добавляли к перемешиваемому раствору. Образование 5'-О-DMTr-T-P(S)-dC^Bz-3'-О-фосфорамидита завершалось через 24 ч. Добавляли 82 мг 5'-OH-dC^Bz-3'-P(S)-dC^Bz-3'-О-Lev (0,09 ммоль, 0,9 экв.) и 366 мкл раствора тетразола (0,45 M, 0,16 ммоль, 1,6 экв.) и перемешивали в течение 45 ч. Образовавшийся трехзамещенный фосфит сульфировали добавлением 400 мг полимер-связанного тетратионата в течение 72 ч. Выход (определенный с помощью ВЭЖХ): 58%.

Пример 8

Синтез 5'-О-DMTr-dC ^Bz -dG ^iBu -dC ^Bz -dC ^Bz -3'-О-Lev цианоэтилфосфоротиоатного триэфира через получение 5'-О-DMTr-dC ^Bz -P(S)-dG ^iBu -3'-О-фосфорамидита in situ с использованием трифторацетата метилимидазолия (MIT)

100 мг 5'-О-DMTr-dC^Bz-P(S)-dG^iBu-3'-OH (0,09 ммоль, 1,0 экв.) и 17,8 мг MIT (0,09 ммоль, 1,0 экв.) растворяли в 10 мл дихлорметана, добавляли 200 мг молекулярных сит 4Е. К перемешиваемому раствору добавляли 28 мкл 2-цианоэтил N,N,N',N'-тетраизопропилфосфордиамидита (0,09 ммоль, 1,0 экв.). Образование 5'-О-DMTr-dC^Bz-P(S)-dG^iBu-3'-О-фосфорамидита завершалось через 3 ч. Добавляли 40 мг 5'-OH-dC^Bz-3'-P(S)-dC^Bz-3'-О-Lev (0,04 ммоль, 0,5 экв.) и 0,9 мл раствора этилтиотетразола (0,25 M, 0,23 ммоль, 2,5 экв.) и перемешивали в течение 2 ч. Образовавшийся трехзамещенный фосфит сульфировали добавлением 200 мг полимер-связанного тетратионата в течение 72 ч. Выход 30 мг (14,1 мкмоль, белые кристаллы): 16%; чистота (определенная с помощью ВЭЖХ): 67%.

Пример 9

Синтез S'-O-DMTr-dC ^Bz -dC ^Bz -dA ^Bz -T-3'-O-Lev цианоэтилфосфортиоатного триэфира через получение 5'-О-DMTr-dC ^Bz -P(S)-dC ^Bz -3'-О-фосфорамидита in situ с использованием трифторацетата бензилимидазолия (BIT)

100 мг 5'-О-DMTr-dC^Bz-P(S)-dC^Bz-3'-OH (0,09 ммоль, 1,0 экв.) и 46 мг BIT (0,17 ммоль, 1,9 экв.) растворяли в 5 мл ацетона и 5 мл ацетонитрила, добавляли 500 мг молекулярных сит 3Е. 58 мкл 2-цианоэтил N,N,N',N'-тетраизопропилфосфордиамидита (0,14 ммоль, 1,5 экв.) добавляли к перемешиваемому раствору. Образование 5'-О-DMTr-dC^Bz-P(S)-dC^Bz-3'-О-фосфорамидита завершалось через 1 ч. Добавляли 41,3 мг 5'-OH-dA^Bz-3'-P(S)-T-3'-О-Lev (0,05 ммоль, 0,55 экв.) и 43,7 мг бензилмеркаптотетразола (0,23 ммоль, 2,5 экв.) и перемешивали в течение 1,5 ч. Образовавшийся трехзамещенный фосфит сульфировали добавлением 500 мг полимер-связанного тетратионата в течение 72 ч. Выход (определенный с помощью ВЭЖХ): 70%.

Пример 10

Синтез 5'-О-DMTr-dG ^iBu -dG ^iBu -dG ^!Bu -T-dG ^iBu -dG ^iBu -3'-О-Lev цианоэтилфосфотриэфира через получение 5'-О-DMTr-dG ^lBu -P(О)-dG ^iBu -3'-О-фосфорамидита in situ с использованием трифторацетата метилимидазолия (MIT)

200 мг 5'-О-DMTr-dG^iBu-P(О)-dG^iBu-3'-OH (0,18 ммоль, 1,0 экв.) и 56 мг MIT (0,27 ммоль, 1,5 экв.) растворяли в 5 мл ацетона и добавляли 300 мг молекулярных сит. В перемешиваемый раствор добавляли 128 мкл 2-цианоэтил N,N,N',N'-тетраизопропилфосфордиамидита (BisPhos) (0,4 ммоль, 2,2 экв.). Образование 5'-О-DMTr-dG^iBu-3'-P(О)-dG^iBu-3'-О-фосфорамидита завершалось через 15 мин. Добавляли 156 мг 5'-OH-dG^iBu-T-dG^iBu-dG^iBu-3'-О-Lev (0,09 ммоль, 1,0 экв.) и 87 мг бензилмеркаптотетразола (0,46 ммоль, 5,0 экв.) и перемешивали в течение 20 мин. Образовавшийся трехзамещенный фосфит окисляли добавлением 3,7 мл окисляющего раствора (94 мг I₂, 2,9 мл THF, 0,7 мл пиридина и 82 мкл H₂O). Реакция завершалась через 30 мин. Выход (определенный с помощью ВЭЖХ): 51%.

Пример 11

Синтез 5'-О-DMTr-dG ^!Bu -T-3'-О-Lev цианоэтилфосфатного триэфира

200 г (312 ммоль) DMTr-dG^IBu-3'-OH и 80 г (408 ммоль) MIT растворяли в 400 мл дихлорметана и 400 мл ацетона. Добавляли 200 г молекулярных сит и 89 мл (1,25 моль) NMI (N-метил-имидазол). При 15°С к перемешиваемому раствору добавляли 109 мл (344 ммоль) BisPhos. Образование 5'-О-DMTr-dG^IBu-3'-О-фосфорамидита завершалось через 10 мин, и раствор перемешивали еще 30 мин. 88,4 г (260 ммоль) 5'-OH-T-3'-О-Lev и 83,4 г (624 ммоль) ETT растворяли в 600 мл ацетона и 600 мл дихлорметана. Добавляли 100 г молекулярных сит и 86 мл (1,08 моль) NMI. К этому перемешиваемому раствору добавляли 800 мл раствора фосфорамидита. Реакция завершалась через 10 мин, и к охлажденной смеси (ледяная баня) добавляли 46 мл раствора перекиси бутанона (Curox M400). Реакция завершалась через 5 мин. Конверсия (определенная с помощью ВЭЖХ): 100%.

Пример 12

Синтез 5'-О-DMTr-dG ^iBu -T-3'-О-Lev цианоэтилфосфоротиоатного триэфира

1,0 г (1,56 ммоль) DMTr-dG^iBu-3'-OH и 368 мг (1,88 ммоль) MIT растворяли в 3 мл дихлорметана и 3 мл ацетона. Добавляли 1 г молекулярных сит и 154 мкл (1,25 моль) NMI. При 15°С к перемешиваемому раствору добавляли 594 мкл (1,87 ммоль) BisPhos. Образование 5'-О-DMTr-dG^iBu-3'-О-фосфорамидита завершалось через 10 мин, и раствор оставляли перемешиваться в течение еще 30 мин. 438 мг (1,29 ммоль) 5'-OH-T-3'-О-Lev и 396 мг (3,07 ммоль) ETT растворяли в 5 мл ацетона и 5 мл дихлорметана. Добавляли 1 г молекулярных сит и 248 мл (3,61 моль) NMI. К этому перемешиваемому раствору добавляли 5,5 мл раствора фосфорамидита. Реакция завершалась через 10 мин и

А) добавляли 25 мг (7,8 ммоль) серы (S₈) и 2,5 мг Na₂S×9H₂O. Реакция завершалась через 10 мин. Конверсия (определенная с помощью ВЭЖХ): 100%;

В) добавляли 25 мг (7,8 ммоль) серы (S₈). Реакция завершалась через 3 ч. Конверсия 99%.

Пример 13

Синтез 5'-О-DMTr-T-dC ^Bz -dG ^iBu -T-T-dG ^iBu -3'-О-Lev цианоэтилфосфоротиоатного триэфира

5,0 г (4,9 ммоль) DMTr-T-dC^Bz-3'-OH и 2,4 г (12,3 ммоль) MIT растворяли в 10 мл дихлорметана и 10 мл ацетона. Добавляли 8 г молекулярных сит и 980 мкл (12,3 моль) NMI. При 15°С к перемешиваемому раствору добавляли 3,13 мл (9,85 ммоль) BisPhos. Образование 5'-О-DMTr-T-dC^Bz-3'-О-фосфорамидита завершалось через 10 мин, и раствору позволяли перемешиваться в течение 30 мин. Добавляли 100 мл гептана, декантировали и к образовавшемуся осадку добавляли 10 мл дихлорметана и 10 мл ацетона. 4,44 г (2,79 ммоль) 5'-OH- dG^iBu-T-T-dG^iBu-3'-О-Lev и 1,05 г (8,06 ммоль) ETT растворяли в 15 мл ацетона и 15 мл дихлорметана. Добавляли 5 г молекулярных сит и 640 мкл (8,06 моль) NMI. К этому перемешиваемому раствору добавляли 20 мл раствора фосфорамидита. Реакция завершалась через 10 мин, и добавляли 930 мг (3,09 ммоль) PADS. Реакция завершалась через 10 мин. Конверсия (определенная с помощью ВЭЖХ) 92%.

Пример 14

Синтез 5'-О-DMTr-dC ^Bz -dA ^Bz -dC ^Bz -dA ^Bz -dC ^Bz -dA ^Bz -dC ^Bz -dA ^Bz -3'-O-Lev цианоэтилфосфатного триэфира

860 мг (0,45 ммоль) 5'-О-DMTr-dC^Bz-dA^Bz-dC^Bz-dA^Bz-3'-OH и 133 мг (0,67 ммоль) MIT растворяли в 3 мл дихлорметана и 3 мл ацетона. Добавляли 800 мг молекулярных сит и 55 мкл (69 моль) NMI. К перемешиваемому раствору добавляли 214 мкл (0,65 ммоль) BisPhos. Образование 5'-О-DMTr-dC^Bz-dA^Bz-dC^Bz-dA^Bz-3'-3'-О-фосфорамидита завершалось через 10 мин, и раствору позволяли перемешиваться в течение 20 мин. Добавляли 30 мл гептана, декантировали и к образовавшемуся осадку добавляли 5 мл дихлорметана и 5 мл ацетона. 545 мг (0,3 ммоль) 5'-OH-dG^iBu-T-T-dG^iBu-3'-О-Lev и 117 мг (0,9 ммоль) ETT растворяли в 3 мл ацетона, 3 мл дихлорметана и 0,3 мл диметилфталата (DMF). Добавляли 1 г молекулярных сит и 70 мкл (0,9 ммоль) NMI. К этому перемешиваемому раствору добавляли 8 мл раствора фосфорамидита. Реакция завершалась через 30 мин, и к смеси добавляли 70 мкл раствора пероксида бутанона (Curox M400). Реакция завершалась через 10 мин. Конверсия (определенная с помощью ВЭЖХ): 80%.

В настоящем изобретении заявлен способ получения олигонуклеотида, включающий стадии: а) предоставления гидроксилсодержащего соединения, имеющего формулу (А), в которой В представляет собой гетероциклическое основание и i) R₂ представляет собой Н, защищенную 2-гидроксильную группу, F, защищенную аминогруппу, O-алкильную группу, O-замещенный алкил, замещенный алкиламино или С4'-O2' метиленовый мостик; R₃ представляет собой OR'₃, NHR"₃, NR"₃R'''₃, в котором R'₃ представляет собой группу, защищающую гидроксил, защищенный нуклеотид или защищенный олигонуклеотид, R"₃, R"'₃ независимо друг от друга представляют собой группы, защищающие амин, и R₅ представляет собой ОН или ii) R₂ представляет собой Н, защищенную 2'-гидроксильную группу, F, защищенную аминогруппу, O-алкильную группу, O-замещенный алкил, замещенный алкиламино или С4'-O2' метиленовый мостик; R₃ представляет собой ОН, a R₅ представляет собой OR'₅ и R'₅ представляет собой группу, защищающую гидроксил, защищенный нуклеотид или защищенный олигонуклеотид или iii) R₂ представляет собой ОН, R₃ представляет собой OR'₃, NHR"₃, NR"₃R'''₃, в котором R₃ представляет собой группу, защищающую гидроксил, защищенный нуклеотид или защищенный олигонуклеотид, R"₃, R'''₃ независимо друг от друга представляют собой группы, защищающие амин, a R₅ представляет собой OR'₅ и R'₅ представляет собой группу, защищающую гидроксил, защищенный нуклеотид или защищенный олигонуклеотид; b) взаимодействия указанного соединения с фосфитилирующим агентом в присутствии активатора, имеющего формулу (I) (активатор I), в которой R представляет собой алкил, циклоалкил, арил, аралкил, гетероалкил, гетероарил; R₁, R₂ представляет собой Н или вместе образуют 5-6-членное кольцо; X₁, Х₂ независимо друг от друга представляют собой N или СН; Y представляет собой Н или Si(R₄)₃, где R₄ представляет собой алкил, циклоалкил, арил, аралкил, гетероалкил, гетероарил; В представляет собой депротонированную кислоту, с получением фосфитилированного соединения; с) взаимодействия указанного фосфитилированного соединения без его выделения со вторым соединением, имеющим формулу (А), в которой R₅, R₃, R₂, В выбраны независимо друг от друга, но имеют те же определения, как приведено выше, в присутствии активатора II, иного чем активатор I. 8 з.п. ф-лы, 14 пр., 1 ил.

1. Способ получения олигонуклеотида, включающий стадии:
а) предоставление гидроксил-содержащего соединения, имеющего формулу

в которой В представляет собой гетероциклическое основание и
i) R₂ представляет собой Н, защищенную 2'-гидроксильную группу, F, защищенную аминогруппу, O-алкильную группу, O-замещенный алкил, замещенный алкиламино или С4'-O2' метиленовый мостик,
R₃ представляет собой OR'₃, NHR"₃, NR"₃R'''₃, где R'₃ представляет собой группу, защищающую гидроксил, защищенный нуклеотид или защищенный олигонуклеотид, R"₃, R'''₃, независимо друг от друга, представляют собой группы, защищающие амин,
и R₅ представляет собой ОН
или
ii) R₂ представляет собой Н, защищенную 2'-гидроксильную группу, F, защищенную аминогруппу, O-алкильную группу, O-замещенный алкил, замещенный алкиламино или С4'-O2' метиленовый мостик, R₃ представляет собой ОН, и
R₅ представляет собой OR'₅ и R'₅ представляет собой группу, защищающую гидроксил, защищенный нуклеотид или защищенный олигонуклеотид,
или
iii) R₂ представляет собой ОН,
R₃ представляет собой OR'₃, NHR"₃, HR"₃R'''₃, где R'₃ представляет собой группу, защищающую гидроксил, защищенный нуклеотид или защищенный олигонуклеотид, R"₃, R'''₃ независимо друг от друга представляет собой группы, защищающие амин, и
R₅ представляет собой OR'₅, и R'₅ представляет собой группу, защищающую гидроксил, защищенный нуклеотид или защищенный олигонуклеотид;
b) взаимодействие указанного соединения с фосфитилирующим агентом в присутствии активатора, имеющего формулу I (активатор I)

в которой
R представляет собой алкил, циклоалкил, арил, аралкил, гетероалкил, гетероарил,
R₁, R₂ представляют собой Н, либо они вместе образуют 5-6-членное кольцо,
X₁, Х₂ независимо друг от друга представляют собой N или СН,
Y представляет собой Н или Si(R₄)₃, где R₄ представляет собой алкил, циклоалкил, арил, аралкил, гетероалкил, гетероарил,
В представляет собой депротонированную кислоту,
с получением фосфитилированного соединения,
с) взаимодействие указанного фосфитилированного соединения без выделения со вторым соединением, имеющим формулу

в которой R₅, R₃, R₂, В выбраны независимо друг от друга, но имеют те же определения, как указано выше,
в присутствии активатора II, отличающегося от активатора I.

2. Способ по п.1, в котором активатор формулы I имеет формулу, выбранную из группы, включающей

в которых Y такой, как определено в п.1,
R представляет собой метил, фенил или бензил.

3. Способ по п.1 или 2, в котором фосфитилирующий агент имеет формулу
II

в которой Z представляет собой уходящую группу, a R₁ и R₂, независимо друг от друга, являются вторичными аминогруппами.

4. Способ по п.3, в котором фосфитилирующий агент представляет собой 2-цианоэтил-N,N,N',N'-тетраизопропилфосфордиамидит.

5. Способ по п.1, в котором депротонированная кислота образована из группы, включающей трифторуксусную кислоту, дихлоруксусную кислоту, метансульфоновую кислоту, трифторметансульфоновую кислоту, о-хлорфенолят.

6. Способ по п.1, в котором реакцию проводят в присутствии ацетона.

7. Способ по п.1, в котором фосфитилирующий агент используют в количестве от 1,0 до 1,2 моль/моль гидроксильных групп в гидроксил-содержащем соединении.

8. Способ по п.1, в котором фосфитилирующий агент используют в количестве от 3 до 5 моль/моль гидроксильных групп в гидроксил-содержащем соединении.

9. Способ по п.1, в котором депротонированная кислота образована из группы, включающей трифторуксусную кислоту, дихлоруксусную кислоту, метансульфоновую кислоту, трифторметансульфоновую кислоту (трифлат), о-хлор-фенолят и их смеси.