СПОСОБ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ БРУЦЕЛЛЕЗНОЙ ИНФЕКЦИИ У ЛЮДЕЙ Российский патент 2003 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано в лабораторной диагностике бруцеллезной инфекции.

Известны исследования по индикации бруцелл полимеразной цепной реакцией (ПЦР) [Ю. К. Кулаков, В.Н. Горелов, В.Л. Мотин и др. Молекулярная генетика, микробиология, вирусология. 7-8, 1992, с. 23-27]. Клетки бактерий B.melitensis 565 дважды отмывали в дистиллированной воде и кипятили 15 мин, затем осаждали 5 мин при 14 тыс. об/мин. В реакции амплификации использовали надосадочную жидкость. Чувствительность индикации составила 10⁴-10³ мкм/мл.

При исследовании клинического материала, например крови, на наличие бруцелл возникают трудности, связанные с малым содержанием бруцелл в крови, прочностью их клеточной стенки, внутриклеточным расположением паразита, наличием ингибиторов полимеразной цепной реакции. Известны клинические исследования по выявлению возбудителей инфекционных заболеваний в патологическом материале путем сочетанного использования магнитной сорбции и ПЦР [J. Clin. Мicrоbiol. Immunol. , 1995, Nov, 11, pp. 2908-2912]. Согласно этому способу на магнитные носители наносятся специфические иммуноглобулиновые фракции или моноклональные антитела и инкубируются в бактериальной суспензии. Из бактериальных клеток, связавшихся с носителями, выделяют ДНК, которую амплифицируют с последующей идентификацией специфических фрагментов. Отмечается значительное повышение чувствительности и специфичности обнаружения бактерий. Однако при выявлении бруцелл в крови человека этот метод не обеспечивает достаточной надежности и чувствительности, т.к. не выявляются внутриклеточно расположенные бруцеллы.

Известен способ ПЦР-диагностики бруцеллезной инфекции у людей в клиническом материале, в частности крови [Шестопалов М.Ю., Калиновский А.К., Балахонов С. В. и др. // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. - 1999. 3. - С. 12-17]. Способ включает подготовку пробы, лизис клеток бруцелл для выделения ДНК и генотестирование. Исследуемую пробу добавляют в щелочной лизирующе-осаждающий раствор, центрифугируют, осадок промывают этаналом, растворяют в ТЕ-буфере и генотестируют. Недостатком способа является недостаточная чувствительность, т.к. при лизисе из пробы не удаляются ингибиторы полимеразной цепной реакции.

Наиболее близким к заявляемому способу является способ индикации микроорганизмов, описанный в патенте РФ 2165081, кл G 01 N 33/53, опубл. 20.03.2001, БИ 8. Согласно этому способу определяют наличие возбудителя бруцеллеза в объектах внешней среды с использованием селективного концентрирования бруцелл, содержащихся в пробах исследуемого материала, на бруцеллезных магноиммуносорбентах, отмывания образовавшихся комплексов от ингибиторов ПЦР, кипячения в дистиллированной воде для выхода ДНК в раствор и ганотестирования в ПЦР. Недостатком данного способа является недостаточная чувствительность при определении возбудителя бруцеллеза в крови больных, поскольку данным способом не определяются бруцеллы, находящиеся внутри форменных элементов крови.

Технической задачей изобретения является повышение чувствительности и достоверности способа диагностики.

Решение технической задачи заключается в том, что при подготовке пробы осуществляют разрушение форменных элементов крови путем добавления к цитратной крови дистиллированной воды в соотношении 1:45-1:50. Затем образец смешивают с 10% взвесью бруцеллезных магноиммуносорбентов в количестве 0,02 г/мл и инкубируют в течение 25-30 мин. Отмывают осадок физиологическим раствором трижды. Лизис клеток бруцелл, сорбированных на магноиммуносорбентах, осуществляют кипячением осадка в дистиллированной воде в течение 30 мин. Супернатант, в качестве подготовленной пробы, используют для проведения реакции амплификации для определения ДНК бруцелл.

Существенными отличительными признаками заявляемого способа является следующая совокупность действий, обеспечивающая технический результат изобретения;
- предварительное смешивание цитратной крови с дистиллированной водой, что способствует разрушению форменных элементов крови, внутри которых находятся бруцеллы;
- добавление взвеси бруцеллезных магноиммуносорбентов к образцу и инкубация, при этом происходит специфическая адсорбция и концентрирование высвободившихся клеток бруцелл на поверхности магноиммуносорбентов.

Использование в анализе бруцеллезных магноиммуносорбентов приводит к увеличению специфичности и чувствительности определения.

Пример 1.

У пациента из вены берут 7,5 мл крови, смешивают с 1,5 мл 3,8% цитрата натрия. Добавляют 40 мл дистиллированной воды, встряхивают 15 сек, затем добавляют 0,2 мл 10% взвеси бруцеллезных магноиммуносорбентов, инкубируют в течение 30 мин при температуре 37^oС, периодически встряхивая. Супернатант удаляют, осадок заливают физиологическим раствором рН 7,2, перемешивают. Супернатант вновь удаляют и повторяют промывание осадка физиологическим раствором дважды. К осушенному осадку добавляют 0,5 мл дистиллированной воды, встряхивают и кипятят в течение 30 мин. Супернатант используют в качестве пробы для проведения ПЦР-анализа. Полимеразную цепную реакцию проводят с использованием праймеров, комплементарных участку ДНК бруцелл. Положительный результат (наличие бруцелл в пробе крови) учитывают по наличию амплификата в пробе, находящегося на уровне амплификата положительного контроля.

Изобретение относится к медицине, в частности к микробиологии. Способ обеспечивает повышение чувствительности и достоверности лабораторной диагностики бруцеллезной инфекции у людей. Проводят селективное концентрирование на магноиммуносорбентах, отмывку проб с последующим кипячением в воде, генотестирование методом полимеразной цепной реакции, при этом у пациента берут пробу крови, разрушают в ней форменные элементы путем добавления дистиллированной воды в соотношении 1:45-1:50, перемешивают, а селективное концентрирование на магноиммуносорбентах высвободившихся внутриклеточно расположенных бруцелл проводят после добавления 10% взвеси бруцеллезных магноиммуносорбентов в количестве 0,02 г/мл и инкубации в течение 25-30 мин.

Способ лабораторной диагностики бруцеллезной инфекции у людей, включающий селективное концентрирование на магноиммуносорбентах, отмывку проб с последующим кипячением в воде, генотестирование методом полимеразной цепной реакции, отличающийся тем, что у пациента берут пробу крови, разрушают в ней форменные элементы путем добавления дистиллированной воды в соотношении 1: 45-1: 50, перемешивают, а селективное концентрирование на магноиммуносорбентах высвободившихся внутриклеточно расположенных бруцелл проводят после добавления 10% взвеси бруцеллезных магноиммуносорбентов в количестве 0,02 г/мл и инкубации в течение 25-30 мин.