СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ ВОЗБУДИТЕЛЯ БРУЦЕЛЛЕЗА Российский патент 1999 года по МПК C12Q1/04 G01N33/569 

Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано при бактериологической диагностике бруцеллеза.

Известен бактериологический метод выделения бруцелл из исследуемого материала путем посева его на питательные среды для выращивания указанных возбудителей ("Бруцеллез" под редакцией акад. АМН СССР П.А.Вершиловой -М.: Медицина, 1972 г., с.198-200).

Недостатком этого метода является трудность выделения чистой культуры возбудителя брццеллеза, так как его рост на питательных средах подавляется сопутствующей микрофлорой.

Известен метод ускоренного выделения возбудителей бруцеллеза, включающий введение исследуемого материала предварительно обработанным кортизоном белым мышам, которых через 14 дней умерщвляют и осуществляют посев кусочков внутренних органов на питательные среды для выращивания бруцелл (Методические рекомендации "Диагностика бруцеллеза и применение лабораторных данных при проведении противоэпидемических мероприятий". Алма-Ата, 1983 г., с. 18-20).

Недостатками этого способа являются длительные сроки получения окончательных результатов (до 14 суток), необходимость исследования многих внутренних органов биопробных животных (лимфатических узлов, селезенки, печени, костного мозга), что приводит к большому объему работ. Указанные недостатки затрудняют проведение ускоренного анализа и увеличивают сроки выдачи результатов исследования, особенно при наличии небольшого количества микробных клеток в исследуемых пробах.

Наиболее близким к заявляемому является способ индикации возбудителя бруцеллеза, направленный на ускорение процесса (Заявка N 92006909/13, МПК C 12 Q 1/04, C 01 N 33/569, положительное решение от 26.04.95 г.).

Способ включает введение белым мышам подкожно в область спины 0,5-1 мл суспензии исследуемого материала в физиологическом растворе, которую предварительно смешивают в гепаринизированной кровью морской свинки в соотношении 1: 0,5-1:0,7, к полученной смеси добавляют 0,5-0,7 мл желтка куриного яйца, 5-7 мг кортизона и 90-120 мг сухого молока, а патологический материал берут с места введения.

Использование этого способа позволяет ускорить процесс индикации возбудителя бруцеллеза до 3-4 суток благодаря задержке и накоплению бруцеллезного микроба только на месте введения исследуемого материала. Однако указанный способ не предусматривает выделение чистой культуры возбудителя бруцеллеза и при высеве патологического материала с места введения на твердые питательные среды имеет место подавление специфического роста бруцелл сопутствующей микрофлорой.

Целью предлагаемого изобретения является ускоренное введение чистой культуры бруцелл из материала, загрязненного посторонней микрофлорой.

Поставленная цель достигается тем, что биопробным животным вводят подкожно в область спины 0,5-1 мл суспензии исследуемого материала в физиологическом растворе, смешанной с желтком куриного яйца в соотношении 1:0,5-1: 0,7 и с добавленными затем в смесь 0,5-0,7 мл гепаринизированной крови морской свинки, 5-7 мг кортизона, 0,4-1 мг полимиксина, 0,04-0,08 мг генцианвиолета, бактериологически исследуют только место введения, патологический материал которого высевают на пластины твердой питательной среды, содержащей 200-300 мкг/мл полимиксина и 0,02-0,03 мкг/мл генцианвиолета.

По отношению к прототипу заявляемый способ имеет следующие отличительные признаки. Предварительно добавляемый к исследуемой суспензии желтого, куриного яйца предохраняет возбудитель бруцеллеза от действия фагоцитов и других факторов естественного иммунитета, обеспечивает благоприятные условия для задержки, размножения и накопления бруцелл только на месте введения до развития генерализованого процесса. Добавление к исследуемого материалу и твердой питательной среде полимиксина и генцианвиолета подавляет рост посторонней микрофлоры и обеспечивает получение чистой культуры бруцилл при ее минимальной концентрации.

Способ осуществляется следующим образом. Исследуемый материал в количестве 0,5-1 мл смешивают с желтком куриного яйца в соотношении 1:0,5-1:0,7, к полученной смеси добавляют 0,5-0,7 мл гапаринизированной крови морской свинки, а также кортизон, полимиксин и генцианвиолет из расчета 5-7 мг, 0,4-1,0 мг и 0,04-0,08 мг соответственно на одно животное. Полученную суспензию набирают в шприц и вводят двум белым мышам подкожно в область спины, при этом помощник фиксирует животное, а экспериментатор пинцетом захватывает кожу в складку в области крестца и вводит иглу под контролем глаза так, чтобы срез иглы был на уровне лопаток. После этого, плавным движением надавливая на поршень шприца, вводят нужное количество материала.

Биопробных животных умерщвляют хлороформированием на 1 и 2 сутки после заражения. Грызунов прикрепляют к вскрывочной доске приколышами спиной кверху. Кожу над крестцом животного захватывают хирургическим пинцетом, приподнимают вверх, делают маленький поперечный разрез ножницам и в образовавшееся окошечко вводят закругленную браншу ножниц и делают дугообразные разрывы кожи, обход по бокам место введения. Образовавшийся лоскут кожи (в виде фартука) откидывают на голову грызуна. При этом легко обнаруживают место введения за счет пропитывания мягких тканей кровью.

Место введения подвергают бактериологическому, серологическому и иммунофлюоресцентному исследованиям. Ножницами тщательно срезают ткани места введения, пропитанные кровью, переносят их в стерильные фарфоровые ступки, в которые предварительно наливают 0,5 мл стерильного физиологического раствора и тщательно растирают пестиком. По 0,2 мл полученной эмульсии вносят в две чашки Петри с агаром "Альбими" и равномерно распределяют по поверхности агаровых пластин. После впитывания эмульсии в агар одну из чашек используют для определения антибиотикочувствительности диско-диффузионным методом, другую - для излучения морфологических, культуральных и биохимических признаков по совокупности которых определяют видовую принадлежность бруцелл. Оставшиеся грубые частицы тканей с места введения в фарфоровых ступках вновь тщательно растирают в 1 мл стерильного физиологического раствора, полученный гомогенизат переносят в пробирки, обеззараживают по общепринятой методике и используют для постановки серологических реакций. Посевы места введения выдерживают в термостате при 37^oC в течение 2 суток.

Возможность использования предлагаемого способа иллюстрируется примерами практического его выполнения с использованием полной совокупности заявляемых признаков.

Пример 1. Из расчета на одно животное берут 0,5 мл исследуемого материала, смешивают его с желтком куриного яйца в соотношении 1:0,5. К полученной смеси добавляют 0,5 мл гепаринизированной крови морской свинки, 5 мг кортизона, 0,4 мг полимиксина и 0,04 мг генцианвиолета. Приготовленную смесь набирают в шприц и вводят под кожу спины двум белым мышам поровну, которых затем вскрывают через 24 и 28 ч после заражения и исследуют только место введения с помощью бактериологического, серологического и иммунофлуорецсцентного методов, которые позволяют выделить и идентифицировать возбудитель бруцеллеза при его концентрации 10⁸ - 10⁷ и 10⁶ - 10¹ КОЕ мл соответственно на 3 и 4 сутки от начала исследования.

Пример 2. Из расчета на одно животное берут 0,7 мл исследуемого материала, смешивают его с желтком куриного яйца в соотношении 1:0,6. К полученной смеси добавляют 0,6 мг гепаринизированной крови морской свинки, 6 мг кортизона, 0,6 мг полимиксина и 0,06 мг генцианвиолета. Приготовленную смесь набирают в шприц и вводят под кожу спины двум белым мышам поровну, которых затем вскрывают через 24 и 48 ч после заражения и исследуют только место введения с помощью бактериологического, серологического и иммунофлуоресцентного методов, которые позволяют выделить и идентифицировать возбудитель бруцеллеза при его концентрации 10⁸ - 10⁷ и 10⁶ и 10¹ КОЕ мл соответственно на 3 и 4 сутки от начала исследования.

Пример 3. Из расчета на одно животное берут 1,0 мл исследуемого материала, смешивают его с желтком куриного яйца в соотношении 1:0,7. К полученной смеси добавляют 0,7 мг гепаринизированной крови морской свинки, 7 мг кортизона, 1,0 мг полимиксина и 0,08 мг генцианвиолета. Приготовленную смесь набирают в шприц и вводят поровну под кожу спины двум белым мышкам, которых вскрывают через 24 и 48 ч после заражения и исследуют только место введения с помощью бактериологического, серологического и иммунофлуоресцентного методов, которые позволяют выделить и идентифицировать возбудителя бруцеллеза при его концентрации 10⁸ - 10⁷ и 10⁶ - 10¹ КОЕ мл соответственно на 3 и 4 сутки на начала исследования.

Как показали экспериментальные исследования, заявляемые пределы содержания ингредиентов, входящих в состав инокулята и твердой питательной среды, являются оптимальными для достижения поставленной цели, так как при уменьшении их содержания менее заявляемых пределов не происходит ингибиции роста посторонней микрофлоры, а при их увеличении подавляется рост бруцелл.

Таким образом, изобретение практически осуществимо, его использование в бактериологических исследованиях позволит в кратчайшие сроки получить чистую культуру возбудителя бруцеллеза с последующим ускоренным проведением дифференциации возбудителя и определения антибиотикочувствительности.

Изобретение касается бактериологической диагностики объектов, подозрительных в качестве факторов передачи бруцеллезной инфекции. Биопробным животным вводят подкожно в область спины 0,5-1 мл суспензии исследуемого материала в физиологическом растворе. Исследуемый материал предварительно смешивают с желтком куриного яйца в соотношении 1:0,5-1:0,7. Добавляют в смесь 0,5-0,7 мл гепаринизированной крови морской свинки, 5-7 мг кортизона, 0,4-1,0 мг полимиксина и 0,04-0,08 мг генцианвиолета. Затем проводят бактериологическое исследование патологического материала только с места введения, при этом в твердую питательную среду добавляют 200-300 мкг/мл полимиксина и 0,02-0,03 мкг/мл генцианвиолета. Изобретение позволяет в кратчайшие сроки получить чистую культуру возбудителя бруцеллеза за счет обеспечивания благоприятных условий для задержки, размножения и накопления бруцелл только на месте введения без развития генерализованного процесса.

Способ выявления возбудителя бруцеллеза, включающий введение биопробным животным подкожно в область спины 0,5-1 мл суспензии исследуемого материала в физиологическом растворе в смеси с гепаринизированной кровью морской свинки, желтком куриного яйца, 5-7 мг кортизона и последующим исследованием патологического материала с места введения, отличающийся тем, что исследуемый материал смешивают с желтком куриного яйца в соотношении 1:0,5-1:0,7, затем добавляют 0,5-0,7 мл гепаринизированной крови морской свинки, кортизон, дополнительно добавляют 0,4-1,0 мг полимиксина, 0,04-0,08 мг генцианвиолета, а при бактериологическом исследовании патологического материала в твердую питательную среду добавляют 200-300 мкг/мл полимиксина и 0,02-0,03 мкг/мл генцианвиолета.