ЭКСПРЕСС-СПОСОБ ОЦЕНКИ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ B-СИСТЕМЫ ИММУНИТЕТА ПО ГЕВОНДЯН Российский патент 1999 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к области иммунологии, в частности клинической иммунологии, и касается определения функциональной активности и степени дисфункции B-систем иммунитета.

Основной функцией B-системы иммунитета является способность адекватного адаптивного реагирования на поступающие в организм чужеродные антигены и патогены путем биосинтеза специфических антител с тонкой настройкой их аффинитета и особенно авидитета в процессе иммунного ответа, что обеспечивает селективную нейтрализацию и элиминацию антигенов из организма, а также иммунологическую адаптацию. В процессе иммунного ответа происходит созревание аффинитета и авидитета антител, что имеет большое биологическое значение. Только высокоавидные антитела эффективно защищают организм от патогенов. Показано, что высокоавидные и высокоаффинные антитела в 100-1000 раз эффективнее низкоавидных [1]. В условиях интенсивного перманентного потока антигенов при блокаде РЭС, поражении T-системы иммунитета увеличивается биосинтез антител со сниженным аффитетом и авидитетом, не способных выполнять защитные и эффективные функции [1, 2]. Появление в сыворотке крови и секретах антител с низким аффинитетом и авидитетом свидетельствует о недостаточности B-системы иммунитета [2].

Известны способы оценки аффинитета секретируемых антител, включающие введение в организм антигенов, конъюгированных с носителем гаптенов, взятие и получение иммунной сыворотки, выделение специфических к антигену антител, определение константы ассоциации комплекса антиген-антитело на основании учета свободного и связанного меченого гаптена в реакциях равновесного диализа, торможения реакции пассивной гемагглютинации (РПГА) гаптенами [3, 4]. Однако существенным недостатком этих способов является невозможность выявления всех антител к антигену, в частности низкоавидных, поскольку уже само выделение антител и определение константы ассоциации комплекса антиген-антитело ведет к отбору преимущественно высокоавидных антител и значительной потере (неучету) низкоавидных. Кроме того, этим способом невозможно определять в одной и той же пробе сыворотки содержание высокоавидных и низкоавидных антител и их соотношение. К тому же, круг антигенов (в том числе гаптенов), которые можно было бы вводить в организм и исследовать аффинитет и авидитет антител, ограничен, а сложность, трудоемкость и длительность операций для оценки аффинитета и авидитета антител делают их неприемлемыми для использования в клинической практике для выявления иммунодефицитных состояний.

Задачей изобретения явилась разработка принципиально нового простого и доступного способа определения функциональной активности и степени выраженности иммунологической недостаточности B-системы иммунитета.

Поставленную цель удалось реализовать путем выявления высокоавидных и низкоавидных антител в реакции пассивной гемагглютинации (РПГА) к полисахаридам и пептидгликанам, что значительно упростило анализ и позволило отказаться от трудоемких этапов (операций) определения констант ассоциации комплекса антиген-антитело с использованием гаптенов. Определение титров, постоянно присутствующих в сыворотке крови нормальных антител, к ряду пептидгликанов бактерий значительно упростило проведение анализа, поскольку отпала необходимость введения в организм чужеродных антигенов, а анализ антител к различным антигенам позволил судить о спектре супрессии и значительно повысить чувствительность и информативность способа.

Разработанный экспресс-способ включает взятие крови, получение сыворотки, определение титров нормальных антител к полисахаридам и пептидгликанам Грам+, Грам- и грамвариабельных бактерий с соответствующими эритроцитарными диагностикуками и дефференциацией двух дискретных групп антител: высокоавидных, агглютинирующих в присутствии 0,9% хлористого натрия и низкоавидных, выявляемых в среде для неагглютинирующих антител (5), при этом увеличение низкоавидных антител до 75-90% при одновременном снижении высокоавидных антител до 5-25% свидетельствует о наличии иммунологической недостаточности B-системы иммунитета.

Предлагаемый экспресс-способ осуществляется следующим образом. Для исследования необходимо 0,3-0,6 мл сыворотки крови. РПГА ставят в стандартных пластиковых 96-луночных микроплашках с U-образными лунками объемом 0,25 мл с 8 горизонтальными рядами (A, B, C, D, E, F, G, H) и 12-ю - вертикальными (1-12). Во все нечетные вертикальные ряды вносят по 0,05 мл 0,12 М раствора хлорида натрия, а в четные - по 0,05 мл среды для выявления неагглютинирующих антител (5). Одна и та же испытуемая сыворотка крови вносит в лунки 1-6 ряда A в объеме 0,05 мл. Разведение сыворотки делается путем переноса по 0,05 л из лунок ряда A в лунки ряда B, из лунок ряда B - в лунки ряда C, из лунок ряда C - в лунки ряда D и так далее с тем, чтобы получить следующие разведения сыворотки: 1:2 (ряд A), 1:4 (ряд B), 1:8 (ряд C), 1:16 (ряд D), 1: 32 (ряд E), 1: 64 (ряд F), 1:128 (ряд G), 1:256 (ряд H). Во все лунки вертикальных рядов 1 и 2 (от A до H) вносится эритроцитарный диагностикум с X пептидглюканом (ПГ) по 0,05 мл, в вертикальные ряды 3-4 - эритроцитарный диагностикум с Y - ПГ, в ряды 5-6 - эритроцитарный диагностикум K- ПГ. Плашку встряхивают в горизонтальной плоскости и инкубируют при комнатной температуре в течение 1-2 часов. Учет реакции начинают спустя 15-20 минут и далее ведут через каждые 10 минут на протяжении 60-90 минут от момента постановки, при этом учитывают характер агглютината, время его проявления, площадь, стойкость. Окончательную оценку РПГА в рядах с хлоридом натрия ведут по титрам на 50-60 минутах, а в специальной среде на 60-90 минутах.

Оценка функциональной активности B-системы иммунитета ведется на основании учета титров нормальных антител в растворе хлорида натрия и в среде для выявления негглютинирующих антител с одним и тем же эритроцитарным диагностикумом с расчетом процента агглютинирующих антител по формуле

где: ATx - титр нормальных антител к ПГ в растворе хлорида натрия;
ATc - титр нормальных антител к ПГ в растворе, выявляющем низкоавидные антитела (5).

На основании процента высокоавидных нормальных антител к полисахаридам и пептидгликанам Грам+ и Грам- бактерий, уровня антителогенеза, степени выраженности функционального антагонизма между высокоавидными и низкоавидными антителами к полилиганду можно судить о степени выраженности иммунологической недостаточности (ИН):
Ниже приводятся конкретные примеры использования экспресс-способа определения состояния B-системы сыворотка крови больного М.А., возраст - 56 лет, подвергшегося воздействию радиации в процессе работы на Чернобыльской АЭС.

Данные иммунограммы представлены в табл. 1 и 2.

В табл. 1 показана динамика образования агглютинатов с разными пептидгликанами (X, Y, Z, F, K). Формирование агглютинатов к пептидгликанам, в частности F и K происходит уже на 15-20 минутах, тогда как к другим - X, Y, Z несколько позже. Более того, на 35-45 минутах титры к ПГ F и K резко снижались в сравнении с 15-20 минутами и исчезли, тогда как при наличии декстрана они составили 1:6 - 1:32, что свидетельствует о вытеснении агглютинирующих антител к F и K ПГ из комплекса неагглютинирующими антителами и наличия функционального антагонизма между ними. Большинство антител (табл. 2) к X, Y, Z ПГ приходилось на низкоавидные (76-94%) и только 12-25% на высокоавидные. Средний титр в среде с хлоридом натрия составил 6,8 +2,4; в среде для выявления неагглютинирующих антител - 48+ 9,6; процент высокоавидных антител - 13, низкоавидных - 87.

На основании анализа иммунограммы имеющуюся иммунологическую недостаточность B-системы иммунитета можно отнести к ЛИН-II, выражающуюся преимущественным биосинтезом низкоавидных антител (87%), носящей поликлональный характер, с выраженными явлениями функционального антагонизма между высокоавидными и низкоавидными антителами к пептидгликанам F и K.

Пример 2. Исследование сыворотки крови кролика N5, возраст - 3 месяца, до и после экспериментального инфицирования B-лимфотропным ретровирусом лейкоза крупного рогатого скота.

Титры нормальных антител к пептидгликанам (X), (Y) и (K) определялись с соответствующими эритроцитарными диагностикумами (X, Y, K). Результаты исследования до инфицирования ретровирусом и в латентной стадии инфекции на 7 и 30 сутки представлены в табл. 3.

Из табл. 3 видно, что в сыворотке крови до инфицирования 94% антител к пептидгликанам (X, Y, K) приходилось на высокоавидные антитела и только 6% на низкоавидные неагглютинирующие. На 7-е сутки после инфицирования титры к пептидгликанам (X, Y, K) были представлены низкоавидными антителами (75-91%), тогда как на высокоавидные приходилось 9-25%. Аналогичная картина отмечалась и на 30-е сутки. Таким образом B-лимфотропный ретровирус вызывает стойкую латентнотекущую иммунологическую недостаточность, характеризующуюся преимущественным поликлональным биосинтезом неагглютинирующих антител. При этом несмотря на наличие неагглютинирующих антител явления функционального антагонизма между антителами не проявлялись. Таким образом, у инфицированного кролика отмечается выраженная стойкая напряженность B-системы иммунитета и иммунологическая недостаточность.

Пример 3. Больная М.С., 30 лет, носитель токсигенных дифтерийных бактерий. Исследования иммунограммы от 25.03.1994 г. (табл.4).

При исследовании в сыворотке крови антител к пептидгликанам (ПГ-K) и дифтерийному токсину (ДТ) было установлено, что только 25% к ПГ-K в сыворотке крови и слюне приходилось на агглютинирующие, тогда как на неагглютинирующие - 75%. Аналогичная картина отмечалась и в слюне. Общий уровень антителогенеза к ПГ-K был в 4 раза выше, чем в норме. Результаты анализа иммунограммы свидетельствуют о наличии у больной иммунологической латентнотекущей недостаточности, одним из проявлений которой является, в частности, стойкое бацилоносительство токсигенных дифтерийных бактерий.

Пример 4. Больная Ю.А., 47 лет с клиническим диагнозом: "Рак матки. IV стадия, метастазы в позвоночник, мочевой пузырь, толстый кишечник". Иммунограмма от 07.06.94 г. (табл. 5)
Полученные данные у больной свидетельствуют о резкой активизации биосинтеза нормальных антител к пептидгликанам Грам+ и Грамбактерий на 80% в сравнении с нормой, однако 88-97% антител приходилось на неагглютинирующие и только 3-12 на агглютинирующие. Между агглютинирующими и неагглютинирующими антителами отмечались выраженные явления функционального антагонизма.

Таким образом, экспресс-способ позволяет вести целенаправленную диагностику не только клинически выраженных форм иммунологической недостаточности, но, что особенно важно, латентyотекущих доклинических форм широко распространенных, предболезненных состояний, что открывает возможность для профилактики многих заболеваний на самых ранних этапах развития.

Достоинством "Тест-системы" является также:
- Высокая чувствительность (0,02-0,05 мкг антител).

- Возможность выявления в одной и той же пробе как высокоавидных, так и низкоавидных антител.

- Микроколичество исследуемого материала (0,3 мл).

- Высокая производительность (10 и более проб одновременно).

- Быстрота получения результатов (1-2 часа).

- Однозначность и простота трактовки результатов исследования.

- Экономическая доступность (5 $/тест).

- Возможность постановки реакции в любых условиях (у постели больного).

- Возможность математического и графического выражения результатов исследования.

Возможность автоматизации постановки реакции и ее оценки.

Источники информации
1. Каруш Ф. Сродство антител: пределы изменчивости, роль поливалентности. //В кн. : "Иммуноглобулины". Под ред. Г.Линена и Р. Гуда. -М.: Мир, 1981, 121-163 с.

2. Стюард М. Аффинность реакции антиген-антитело и ее биологическое значение. //В сб. "Структура и функция антител". Под ред. Л. Глина, М. Стьюарда. -М.: Мир, 1983, 113-147 с.

3. Иммунология //Под ред. У.Пола, III том., -М.: Мир, , 1987, 350 с.

4. Иммунологические методы //Под ред. Г. Фремеля, Изд. "Медицина", 1987, 42-57 с.

5. Авт. cв. 603902, G 01 N 3354, 10.08.1978. Среда для титрования антител.

Способ относится к клинической иммунологии и может быть использован для определения функциональной активности В-системы иммунитета путем оценки авидитета секретируемых антител. В сыворотке крови и секретах в реакции пассивной гемагглютинации проводят определение титров нормальных антител к пептидгликанам и полисахаридам Грам+ и Грам-, и грамвариабельных бактерий с соответствующими эритроцитарными диагностикумами. При этом РПГА ставят в среде для выявления высокоавидных антител и среде для выявления низкоавидных и высокоавидных антител. При увеличении процента низкоавидных антител до 75 - 90% при одновременном снижении высокоавидных антител до 5 - 25% оценивают функциональную активность В-системы иммунитета, как наличие иммунологической недостаточности. В норме 80 - 100% антител к пептидгликанам и полисахаридам имеют высокий авидитет. Способ высоко чувствителен, позволяет быстро получить результаты и однозначно их трактовать. 5 табл.

Экспресс-способ оценки функциональной активности B-системы иммунитета, включающий определение титров антител в сыворотке крови и секретах в реакции пассивной гемагглютинации (РПГА), отличающийся тем, что проводят определение титров нормальных антител к пептидгликанам и полисахаридам Грам+ и Грам-, и грамвариабельных бактерий с соответствующими эритроцитарными диагностикумами с дифференциацией двух дискретных групп антител, для чего РПГА ставят в среде для выявления высокоавидных антител и среде для выявления низкоавидных и высокоавидных антител, и при увеличении процента низкоавидных антител до 75 - 90% при одновременном снижении высокоавидных антител до 5 - 25% оценивают функциональную активность В-системы иммунитета, как наличие иммунологической недостаточности, при этом в норме 80 - 100% антител к пептидгликанам и полисахаридам имеют высокий авидитет.