Способ внутривидовой дифференциации штаммов стафилококков Советский патент 1988 года по МПК C12Q1/04 C12Q1/70 C12Q1/04 C12R1/445 

Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано при диагностике стафилококковой инфекции.

Цель изобретенр1я - повышение точности способа за счет расширения числа типируемых штаммов стафилококков.

Для осуществления способа при фа- готипировании наряду с 22-я типовыми диагностическими бактериофагами используют новые штаммы бактериофагов № 413, 729 н 13676.

Штаммы стафилококковых бактериофагов выделяют из лизогенных штаммов стафилококков с помощью УФ-индукции депонированы в Государственной коллекции бактериофагов под номерами Ф-122, Ф-121, иФ-113 соответственно.

Фаги № 413 (Ф-122) и № 729 (Ф-121) формируют мутные бляшки диаметром 0,2 - 1,0 мм. Негативные колонии фага № 13676 (Ф-113) диаметром 0,5-1,0 мм имеют ясное прозрачное дно. Фаги имеют бинальньй тип симметрии,т.е. отно сятся к 1 типу. Фаги № 413 и .729 имеют цилиндрическую головку, фаг № 13676 - гексагональную, размером 950x950 А.

I

При изучении фаз взаимодействия фагов с клеткой хозяина выявлено, что фаг № 413 отличается по скорости адсорбции и латентному периоду от фагов № 729 и 13676. Средний урожай на одну бактериальную клетку у фагов № 413 и 13676 низкий и составляет 5,3 и 7,8 частиц соответственно. Фаг № 729 продуцирует 69,5 частиц. Зависимости выхода фага от скорости адсорбции не отмечено. Фаги № 729 и 13676 с константой скорости адсорбци 1,6-1,7x10 млн/мин в среднем продуцируют разное количество инфекционных частиц (69,5 и 7,8).

Материалы изучения основных при- знаков бактериофагов № 413, 729 и 13676 представлены в таблице.

Антигенные свойства бактериофагов № 413, 729, 13676. Для изучения антигенных свойств бактериофагов используют антифаговые сыворотки.

Проверка антифаговых сывороток, полученных к каждому из селекционированных фагов в перекрестной реакци нейтрализации с гомологичньп 1И, гете- рологичными фагами, включая фаги Международного набора различных серологических групп (А,В,Г,1), показывает что селекционированные фаги отличают

о

0 Q

д

5

0

ся от фагов Международной коллекции, а также между собой, причем в большей степени это можно отнести к бактериофагу № 13676.

Антифаговые сыворотки в перекрестных реакциях нейтрализации используют в разведении, при котором наблюдается инактивация не менее 90% частиц гомологичного фаза при 37 С в течение 5 мин (рабочий титр).

Бактериофаги № 413, 729, 13676 лиофилизированы с использованием 5% пептона, сохраняют свои свойства в течение четырех лет (срок наблюдения) .

Внутривидовую дифференциацию стафилококков осуществляют при использовании коллекции фагов Международного набора, в которую дополнительно включают фаги № 413, 729 и 13676, отличающиеся специфическим литическим спектром.

П р и м е р. Приготовление фагов для типирования.

Лиофилизированные в объеме 0,1 мл бактериофаги № 413, 729 и 13676 стерильно растворяют в 1 мл щелсгчного бульона Хоттингера (рН 7,6) с 0,4% глюкозы и 0,02% CaCl. Из этого разведения (10 ) готовят два рабочих разведения, соответствующие 1-тест- разведению (ТР) и 100 ТР и используют их для типирования стафилококков вместе с фигами Международной коллекции.

Подготовка штаммов для типирования. Суточную агаровую куль.туру испытуемого штамма засевают в пробирку ; с 4,5 мл бульона Хоттингера (рН 7,2-7,4) и выращивают 3-4 ч при 37 С (до появления заметной мути). Одновременно готовят чашки Петри с 1,2%- ным агаром, приготовленным на бульне Хоттингера, с добавлением свежей мясной воды (рН 7,6), добавляют в него 0,4% глюкозы и 10%-ньй раствор CaCl из расчета 0,2 мл на 100 мл расплавленного агара (перед розли- вом чашек), Чашки с агаром после застывания подсушивают 30-40 мин при 37 С и засевают сплошным газоном 3- . 4-часовой бульонной культурой. Избыток культуры удаляют пастеровской пипеткой. Чашки подсушивают 30-40 мин при 37°С,

Проведение внутривидовой дифференциации стафилококков (фаготипи- рование), Дно засеянной чашки расчерчивают по 25 квадратов (по числу

314425424

фагов: 22 фага Международной коллек- ным фагам, их фаговариант устанавлн- ции и 3 предлагаемых фага № 413, 729, вают с помощью последних. Например: 13676) и в каждый квадрат наносят штам № 5371. 1 ТР 729++; № 187 1 ТР

каплю соответствующего фага: 413 729 13676

29

52 52А

79 80

ЗА

ЗС 55

71

42Е 47 53

54 75

77

83А 84

85 42Д

81 187

Фаготипирование штаммов начинают рабочим разведением фагов (ТР). Штам- мы, с которыми получен отрицательный результат, на следующий день типиру- ют повторно первым разведением фагов (разведение 10).

Учет результатов типирования. Степень лизиса разными разведениями фага регистрируют по следующей схеме; ++++ - сливной (полный лизис); +++ - полусливной лизис (незначительный рост культуры в зоне лизиса); ++ - наличие в месте нанесения капли фага свыше 50 колоний (первые три реакции относятся к учитываемым реакциям и регистрируются одним обозначением ++); + - 20 - 50 колоний фага; - полное отсутствие лизиса.

В случае, если штаммы стафилококка чуствительны только к дополнитель

413/729/13676++ и т.д.

Применение стафилококковых бактериофагов № 413, 729, 13676 вместе с коллекцией фагов Международного набора для дифференциации 98 штаммов

стафилококка, выделенных из различного материала при различных формах заболеваний, увеличивает процент дифференцируемых культур в среднем от 46,9 до 86,5%. Использование предлагаемых селекционированных бактериофагов вместе с фагами Международного набора позволяет выявлять источник и пути передачи инфекции, вызванной новыми фаговариантами стафилококка.

Формула изобретения

Способ внутривидовой дифференциа- Ции штаммов стафилококков путем посева исследуемой культуры стафилококков на плотную питательную среду с последующим нанесением на газон культуры типовых диагностических стафи- лококковых бактериофагов, инкубированием посевов и учетом результатов по степени лизиса культуры, отличающийся тем, что, с целью повышения точности способа за счет расширения числа типируемых штаммов стафилококков, дополнительно используют штаммы диагностичеоких стафилококков бактериофагов Ф-113, Ф-121 и Ф-122.

Изобретение относится к медицинской микробиологии. Цель изобретения - повышение точности способа за счет расширения числа типируемых штаммов стафилококков. Для осуществления способа дополнительно к Международному набору типовых диагностических бактериофагов используют три новых стафилококковых бактериофага Ф-121, Ф-122 и Ф-113. Для осуществления способа исследуемую культуру засевают на поверхность плотной среды и на газон культуры после подсушивания капельно наносят типовые фаги. По степени лизиса стафилококков прово- дят внутривидовую дифференцию метал- § лов стафилококков. 1 табл. СЛ