СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ И ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ ФАГА VIBRIO MIMICUS Российский патент 2009 года по МПК C12N1/00 C12Q1/02 

Предлагаемое изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано в лабораторной диагностике Vibrio mimicus.

Vibrio mimicus (V. mimicus) является представителем нового вида рода Vibrio (открытого в 1981 г.), последний обнаруживается в объектах внешней среды и вызывает у людей главным образом диареи. V. mimicus обладает сходством по целому ряду фено- и генотипических признаков с холерным вибрионом. Для идентификации Vibrio cholerae используют различные диагностические фаги. Что же касается бактериофагов V. mimicus, то до настоящего времени они не были известны из-за отсутствия приемов их обнаружения, включающего фагочувствительную индикаторную культуру.

Известен способ идентификации Vibrio Albensis (см. авт. св. СССР №1778188 А1, кл. С12Q 1/04, С12N 1/20, 30.11. 1992 г., БНИ), заключающийся в том, что к клеточной суспензии фагочувствительного индикаторного штамма светящихся вибрионов засевают лизогенный штамм гомологичного вида вибрионов (V. albensis) и через 20-24 часа инкубации при 37°С инактивируют бактерии, затем взвесь наносят на газон индикаторного штамма V. albensis КМ-41, посев повторно инкубируют и идентификацию проводят по наличию фаголизиса.

Однако использование известной технологии обнаружения для фага V. mimicus, а именно с применением лизогенного штамма V. mimicus гомологичного вида вибрионов, не дает результатов, что свидетельствует о необходимости нового подхода к точному обнаружению фага V. mimicus.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является разработка способа, позволяющего с высокой точностью выделить фаг V. mimicus.

Указанный технический результат достигается разработкой способа выделения фага Vibrio mimicus, включающего инкубирование лизогенного штамма и использование индикаторного штамма, причем в качестве последнего используют Vibrio cholerae eltor KM 199, трехчасовую бульонную культуру которого в количестве 0,2 мл вносят в смесь инкубированного лизогенного штамма, 1 мл последнего соединяют с 5 мл 0,7% агара Мартена, затем взвесь высевают на агаровую пластину 1,5% агара Мартена, культивируют при 37°С в течение 24-48 часов и по литической реакции делают вывод о наличии фага Vibrio mimicus Ф-19.

Культурально-морфологические признаки микроорганизма вида V. mimicus

В мазках из агаровых и бульонных культур, окрашенных по Граму, клетки имеют вид грамотрицательных палочек. Подвижные при выращивании в 0,3% щелочном агаре, наблюдается помутнение столбика агара. Штамм не ферментирует сахарозу и арабинозу, утилизирует маннозу, не образует ацетилметилкарбинола, чувствителен к полимиксину (50 мкг/мл). Штамм не лизируется холерными диагностическими фагами, классическим холерным и эльтор, ctx⁺ и ctx^-, ТЭПВ 1-7. Штамм не агглютинируется O-холерной сывороткой и типоспецифическими сыворотками Инаба, Огава. Штамм не содержит ctx-ген. Штамм продуцирует бактериофаг I морфогруппы (по классификации А.С.Тихоненко, 1968), обозначенный Ф-19.

Биохимическая активность штамма фага V.mimicus

Штамм фага Ф-19 обладает узким спектром литического действия на вибрионы эльтор. Микроорганизмы близкородственных видов, родов и семейств, резистентных к лизису фагом Ф-19. При нанесении капли фага Ф-19 на газоны культур V.mimicus 13351, 13352, 13353, 15843, 16474, 15842, засеянных в 0,7%-ный агар двухслойным методом, обнаруживается фагоустойчивость всех исследуемых культур.

Из таблицы 1 видно, что из 6 тест-штаммов гетерологичных видов вибрионов (V. eltor, V. cholerae О139 серовара, V. parahalmolytraus, V. albensis, V. metschnikovii) и 6 штаммов вибрионов гомологичного вида V. mimicus (13351, 13352, 13353, 15842, 15843, 16474) репродукцию фага Ф-19 обеспечивает только индикаторный штамм V. cholerae eltor KM 199 (штамм KM-199 депонирован в ГКПБ института «Микроб»).

Кроме того, что V. mimicus 13353 является лизогенным штаммом, с выделением фага подтвердилось также путем серологического метода антигенное родство выделенного фага с холерным фагом XII серотипа (в реакции нейтрализации).

Для этого смесь фага Ф-19 в объеме 0,1 мл с титром n·10⁸ БОЕ/мл с 0,9 мл холерной антифаговой сывороткой (14863 - XII серотипа) в разведении (1:50) выдерживают 20 мин при 37°С. Затем на подготовленный газон культуры V. eltor КМ 199 наносят капли смеси в виде дорожки. Результат учитывают через 18 часов выращивания. Наблюдают рост культуры в месте нанесения смеси фага с антифаговой сывороткой. Таким образом, отсутствие лизиса подтверждает родство фага V. mimicus с холерным фагом.

В таблице 2 представлены результаты реакции нейтрализации бактериофага Ф 19 гомологичной антисывороткой и гетерологичной антифаговой сывороткой типовой.

Следовательно, из таблицы видно, что бактериофаг Ф 19 в реакции нейтрализации подтверждает свое родство с холерным фагом XII серотипа, а с холерными фагами I-XI серотипов связи отсутствуют.

Штамм фага Ф-19 V. mimicus хранится в коллекции фагов Центра по депонированию фагов патогенных бактерий Ростовского-на-Дону научно-исследовательского противочумного института.

Для выделения фага V. mimicus проводят следующие технологические операции.

Первоначально осуществляют посев лизогенного штамма V. mimicus 13353 в 4 мл бульона Мартена, рН 7,6. Затем проводят инкубирование, для этого взвесь бактерий выращивают при температуре 37°С в течение 20-24 часов, после смесь фильтруют через фарфоровые бактериальные фильтры марки Ф-5.

Полученный фильтрат в количестве 1 мл добавляют к 5 мл 0,7% агара Мартена, с предварительно расплавленного и охлажденного до 45°С. После чего туда же вносят 0,2 мл трехчасовой бульонной культуры индикаторного штамма гетерологичного вида вибрионов V. eltor KM-199 и высевают на агаровую пластину 1,5% агара Мартена в чашке Петри методом Граца.

После застывания нанесенного слоя чашку переворачивают и культивируют при 37°С в течение 20-24 часов. Учет результатов проводят по формированию мутных негативных колоний на газоне штамма КМ-199. Наличие зон лизиса культуры в виде негативных колоний свидетельствует о наличии фага V. mimicus.

Использование предложенного способа позволяет в лабораторной диагностике:

- выделять лизогенные штаммы V. mimicus;

- применять для генетического обмена информацией в экспериментах по передаче генов от V. mimicus к V. cholerae eltor с помощью фага Ф-19 V. mimicus;

- проводить типирование V. cholerae eltor фагом Ф-19, устойчивых к диагностическим холерным фагам.

Таблица 1
Изыскание штамма, способного выявлять фаг V. mimicus Фильтраты V. mimicus Индикаторные штаммы V. mimicus 13351,13352,13353, 15842,15843, 16474 V. eltor KM 199 V. cholerae O139 KM 152 V. parahalmolytraus V. albensis KM 41 V. metschnikovii KM 185 KM 97 KM 184 13351 - - - - - - - 13352 - - - - - - - 13353 - + - - - - - 15843 - - - - - - - 16474 - - - - - - - 15842 - - - - - - - Обозначения: + наличие негативных колоний - отсутствие лизиса

Таблица 2
Нейтрализация бактериофага Ф 19 гомологичной антисывороткой и гетерологичной антифаговой сывороткой типовой Фаги Сыворотка анти-Ф19 Сыворотки антифаговые типовые холерные Серотип фага I-XI XII Ф-19 + - + XII Холерный фаг 14070 (контроль) + - + XII Обозначения: + наличие нейтрализации - отсутствие нейтрализации

Предлагаемое изобретение относится к биотехнологии. В качестве индикаторного штамма используют Vibrio cholerae eltor KM 199. Его трехчасовую бульонную культуру в количестве 0,2 мл вносят в смесь инкубированного, отфильтрованного лизогенного микроорганизма. 1 мл последнего соединяют с 5 мл 0,7% агара Мартена. Затем взвесь высевают на агаровую пластину 1,5% агара Мартена и культивируют при 37°С в течение 20-24 часов. По литической реакции делают вывод о наличии фага Vibrio mimicus Ф-19. При этом дифференциацию его от холерного фага ФБ О139 серогруппы проводят с помощью штамма Vibrio cholerae 1322-69-037 серовара. Готовят 0,2 мл четырехчасовой бульонной культуры последнего, добавляют 5 мл 0,7% агара и выливают на агаровую пластину в чашку Петри. После застывания на одну дорожку наносят фаг Ф-19, а на вторую - холерный фаг ФБ. Затем их размещают в термостате и выращивают в течение 24-48 часов при температуре 37°С. По регистрации лизиса на одной из дорожек судят о присутствии на ней фага Vibrio mimicus. 2 табл.

Способ выделения и дифференциации фага Vibrio mimicus, включающего инкубирование лизогенного штамма и использование индикаторного штамма, отличающийся тем, что в качестве индикаторного штамма используют Vibrio cholerae eitor KM 199, трехчасовую бульонную культуру которого в количестве 0,2 мл вносят в смесь инкубированного, отфильтрованного лизогенного микроорганизма, 1 мл последнего соединяют с 5 мл 0,7%-ного агара Мартена, затем взвесь высевают на агаровую пластину 1,5%-ного агара Мартена, культивируют при 37°С в течение 20-24 ч и по литической реакции делают вывод о наличии фага Vibrio mimicus Ф-19, при этом дифференциацию его от холерного фага ФБ О139 серогруппы проводят с помощью штамма Vibrio cholerae 1322-69-037 серовара, для этого готовят 0,2 мл четырехчасовой бульонной культуры последнего, добавляют 5 мл 0,7%-ного агара и выливают на агаровую пластину в чашку Петри, после застывания на одну дорожку наносят фаг Ф-19, а на вторую - холерный фаг ФБ, размещают в термостате и выращивают в течение 24-48 ч при температуре 37°С, по регистрации лизиса на одной из дорожек подтверждают присутствие на ней фага Vibrio mimicus.