Способ идентификации галофильных вибрионов Советский патент 1984 года по МПК C12N7/00 

(Л

c

СПОСОБ ИДЕНТИФИКАЦИИ ГАЛОАИЛЬНЫХ ВИБРИОНОВ путем выращивания исследуемого материала на хштательной среде, отличающийся тем, что,с целью ускорения и упрощения способа, вьфащивание осуществляют в присутствии фага Vibrio alginolyticus 531,Vibrio alginolyticus 337 и/или Vibrio alginolyticus 532.

Ю

1 Изобретение относится к микробио .логин, в частности к лабораторной диагностике галофильных вибрионов. - Известен способ вдентификации галофильных вибрионов путем выращивания исследуемого материала на питательной среде с последующим перес TioM и идентификацией по биохимичес.КИМ тестам D J. Однако известный способ длителен и слржец в осуществлении, так как многоэтажен, требует набора индикаторных питательных сред. Цель изобретения - ускорение и упрощение способа. Цель достигается тем, что соглас но способу идентификации галофильны вибрионов путем вьтращивання исследу мого материала на питательной среде вьфащиваниё осуществляют в присутствии фага Vibrio alginolyticus 531 Vibrio alginolyticus 337 и/или Vibrio alginolyticus 532. Фаг Vibrio alginolyticus 531 выделен при исследований мидий, вьиоэ ленных в Севастопольской бухте. Фаг Vibrio alginolyticus 531 хранится в коллекции бактериофагов Тбилисского НИИВС МЗ СССР под номером Ф-107 и характеризуется следующими признака ми. Морфологические и культуральные свойства. Головка вибрионов фага Vibrio alginolyticus имеет в проекции гексагональную форму размером 806 А 1-18 X А. Дпина отростка 1271 431 А,его диаметр 277 ±18 А. Доверительные интервалы средних величин определены для уров ня достоверности, равного 99% (р 0,01). Фаг 531 с сокращающимся чехлом отростка, относится к 5-й морфологической группе по классификации А.С. Тихоненко. Фаг 531 активно репродуцируется на клетках индикаторного штамма Vibrio alginolyticus 434 в щелочном бульоне и бульоне Мартена с 3% NaCI при 37°С. При посевной дозе фага .2-10 мл и множественности инфекции - 10 в течение 6 ч в 1 мл среды накапливается 6-10 вибрионов Негативные колонии фага 531 воспроизводятся с помощью двуслойного метода Грациа, в качестве нижнего плотного слоя используют щелочной 2%-ный агар Мартена с 3% NaCI или 02 Другие среды для вьщеления вибрионов (изготовленные в Иркутском ПЧИ Сибири и Дальнего Востока или в Московском институте вакцин и сьгоороток им. Мечникова) с повышенной концентрацией соли. На пластинки плотного агара выливают вторым слоем смесь расплавленного и охлазкденного до 45 С 0,7%-ного агаpa Мартена с 2% NaCI, 2-3 часовой бульонной культуры индикаторного штамма и 50-100 вибрионов фага в 0,1 мл среды. Через 16-18 ч при 20-25°С фибрионы фага 531 образуют в мягком слое агара с индикаторной культурой Vibrio alginolyticus 4892 мутные колонии округлой формы диаметром 3-4 tot. При нанесении капли фага 531 на газон индикаторного штамма непосредственно на плотном агаре или в слое мягкого агара наблюдается неполный лизис. Фаг 531 полностью нейтрализуется гомологичной сывороткой и не нейтрализуется сыворотками к гетерологичным фагам галофильных и других вибрионов. Фаг Vibrio alginolyticus 531 в концентращш 8-10 лизирует 15% испытанных культзф галофильных вибрионов, нелйзирующихся фагами 337 и 532. Фаг обладает высокой специфичностью в отношении галофильных вибрионов и не лизирует вибрионы вида Vibrio cholerae 01 и не 01 группы, а также микроорганизмы других родов и семейств: Aeromonas, Anaerogenes, Escherichia coli, Pseudomonas. Aeruginosa. Ha зтом основании фаг может быть использован для индентификации галофильных вибрионов как в составе поливалентно-го препарата, так и для фаготипирования в качестве монофага. Штамм фага Vibrio alginolyticus 337 вьделен при исследовании краба, выловленного в Севастопольской бухте. Штамм фага Vibrio alginolyticus 337 хранится в коллекции бактериофагов Тбилисского НИИВС МЗ СССР под номером Ф-105 и характеризуется следующими признаками. Морфологические и культуральные свойства. Головка вибриона фага 337 в проекции имеет гексагональную форму, размерами 574 + 45 530 - 42 1. Дли.3

на отростка 1034 22 А. Доверительные интервалы средних величин определены для уровня достоверности, равного 99% (р 0,01). Фаг 337 с коротким отростком и относится к 3-й морфологической группе по классификации А.С. Тихоненко.

Фаг 337 активно репродуцируется в щелочном бульоне Мартена (рН 7,67,8) с 3% NdCI на клетках индикаторного штамма Vibrio alginolyticu N 26.2. При посевной дозе фага 5-10 и множественности инфекции 5 через 3,5 ч при 35-37°С в 1 мл среды накапливается 2 10 вибрионов. Негативные колонии фага 337 воспроизводятся с помощью двуслойного метода Грациа. В качестве нижнего плотного слоя используют щелочной 2%-ный агар Мартена с 3% NaCI или. другие щелочные среды для вьщеления вибрионов (изготовленные в Иркутском ПЧИ Сибири и Дальнего Востока или в Московском институте вакцин и сывороток им. Мечникова). На пластинки плотного агара вьшивают вторым слоем смесь расплавленного и охлажденного до 45С 0,7%-ного Мартена с 2% NaCI, с 0,2 мл 2-3 часовой бульонной культуры индикаторного штаима и 50100 вибрионов фага в 0,1 мл бульон Через 16-18 ч при 20-25°С вибрионы фага 337 образуют в мягком слое агара с индикаторной культурой Vibrio alginolyticus 262 негативны колонии округлой формы с прозрачным центром и узким мутным ободком по периферий.

При нанесении капли фага 337 на газон- индикаторного штамма непосредственно на плотном агаре или в слое мягкого агара происходит полны лизис культуры.

Фаг Vibrio alginolyticus 337 полностью нейтрализуется гомологичной сьюороткой и не нейтрализуется сыворотками к гетерологичным фагам галофильных и других вибрионов, обладает узким диапазоном и лизирует 3% культур галофильных вибрионов, не лизирующихся другими фагами. Фаг специфичен и не лизирует представителей вида Vibrio cholerae 0,1 01 группы, а также микроорганизмы других родов и семейств: Aeromonas anaerogenes, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa. Ha этом основании фаг

может бьпь использован для идентификации галофильных вибрионов как в составе поливалентного препарата, так и для фаготипирования в качестве монофага.

Штамм фага Vibrio al|inolyticas 532 вьщелен при исследовании мидий, вьтовленных в Севастопольской бухте.

Фаг Vibrio alginolyticus 532 хранится в коллекции бактериофагов Тбилисского НИИВС МЗ СССР под номером Ф-105 и характеризуется следующими признаками.

Морфологические и культуральные свойства.

Головка вибрионов фага 532 имеет в проекции гексагональную форму, размером 1138 ±65 X -1062164 А Дпина отростка 2599 i162 X, ширина 270 ±11 А. Доверительные интервалы средних величин определены для уровня достоверности, равного 99% (р 0,01). Фаг 532 с сокращающимся чехлом отростка относится к 5-й морфологической группе по Т.Н. Тихоненко.

Фаг 532 активно репродуцируется на клетках индикаторного штамма . Vibrio alginolyticus 532 с щелочном бульо.не Мартена с 2-3% NaCI при 35-37С. При посевной дозе фага 1-10 мл среды и множественности инфекции 1/15 в течение 3,5 ч в 1 мл среды накапливается 1,5-10 вибрионов фага.

Негативные колонии фага 532 воспроизводятся с помощью двуслойного метода Грациа. В качестве нижнего плотного слоя используют щелочной 2%-ный агар Мартена с 3% NaCI или другие плотные щелочные среды для вБиеления вибрионов (изготовленные в Иркутском ПЧИ Сибири и Дальнего Востока 1ти в Московском институте вакцин и сывороток им. Мечникова) с повьш1енной кон центрацией соли. На пластинки плотного агара выливают вторым слоем смесь расплавленного и охлажденного до 45 ° С 0,7%-ного агара Мартена с 2% NaCI, 0,2 мл 2-3-часовой бульонной культуры индикаторного штамма и 50-100 вибрионов фага в П,1 мл среды. Через 16-18 ч при 20-25 С вибрионы фага 532 образуют в мягком слое агара с индикаторной культурой Vibrio alginolyticus 532 колонии округлой 5 формы с прозрачным центром и мутной периферией, диаметром 2-3 мм. При нанесении капли фага 532 на газон индикаторного штамма непосред ственно на плотной среде или в мягком слое агара наблкщается лизис культуры. Фаг Vibrio alginolyticus 532 полностью нейтрализуется гомологичной сывороткой и не нейтрализуется сыворотками к гетерологичным фагам галофильных и других вибрионов. Фаг Vibrio alginolyticus 532 лизирует 40% испытанных культур Vibrio alginolyticus и обладает вы сокой специфичностью в отношении гальфильных вибрионов. Он не лизирует вибрионы вида Vibrio cholerae 01 и не 01 группы, а .также микроорганиз 6 1 других родов и семейств: Aeromonasanaerogenes, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, В свя зи с этим он может, быть использован для идентификации галофильных вибри онов как в составе поливалентного препарата, так и для фаготипирования в качестве мопофага. Пример 1. Использова.ние фа га Vibrio alginolyticus 531 для иде тификации культур галофильных вибрионов. Из испражнений больного острой кишечной инфекцией, подозрительйой по клиническому течению на забо левание вызванное галофильными вибрионами, была вьделена культура грамотрицательных бактерий. Ццентификащто этой культуры с помощью фага Vibrio alginolyticus 531 прово дят следующим образом. Культуру засевают в бульон Мартена с 3% NaCI и помещают в термостат на 3 ч.(0,2 мл вьфосшей культу ры смешивают с 5 мл расплавленного 06 и охлажденного до 0,7%-ного агара Мартена с 2% NaCI и наливают вторым слоем на пластинки 2%-ного аг,ара Мартена с 3% NaCI в чашках Петри. После подсушивания на поверхность мягкого агара с культурой наносят .стерильной пипеткой каплю фага Vibrio alginolyticus 531. Посевы оставляют при комнатной температуре. Через 18 ч на месте нанесения капли фага наблюдают просветление газона культуры, свидетельствующее о ее растворении. Лизис изучаемой культуры под действием фага Vibrio alginolyticus 531 позволяет идентифицировать ее как галофильный вибрион. Пример 2. Вьаделенная культура не лизировалась фагом Vibrio alginolyticus 531. По методике, описанной в примере 1, быпа определена ее чувствительность к фагу 337. Лизис изучаемой культуры под действием фага Vibrio alginolyticus 337 свидетельствует о ее принадлежности к галофильным вибрионам. Пример 3. Вьщеленная культура не лизируется ни одним из фагов Vibrio alginolyticus (531 и 337). По методике, описанной в примере 1, была определена ее чувствительность к фагу Vibrio alginolyticus 532. Лизис иззгчаемой культуры под действием фага Vibrio alginolyticus 532 свидетельствует о ее принадлежности к галофильным вибрионам. Аналогичным образом были идентифицированы кзльтуры, вьщеленные из морской воды и гидробионтов, а также определена чувствительность музейных культур к фагам 531, 337,532. Использование предложенного спо- . соба позволит в короткие сроки ироводить идентификацию галофильных вибрионов менее трудоемким способом.