СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МОЛЕКУЛЯРНЫХ МАСС ИНДИВИДУАЛЬНЫХ БЕЛКОВ БАКТЕРИАЛЬНЫХ КЛЕТОК Российский патент 1999 года по МПК G01N33/68 

Изобретение относится к области получения протеинов микроорганизмов электрофорезом и может быть использовано при изучении индивидуальных белков бактериальных клеток.

При выделении протеинов большое значение имеет качество фракционирования бактериальных клеток при условии их полной денатурации и исключением протеолиза.

В результате многочисленных исследований в области молекулярной и клеточной биологии отработаны наиболее эффективные методы фракционирования путем электрофоретического разделения, в частности гель-электрофорез.

При денатурации белков в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН) размеры молекул пропорциональны их заряду. Это явление используют для определения молекулярных масс фракционированных белков путем построения калибровочных кривых изменения логарифма молекулярной массы относительно скорости движения макромолекул в геле (Зенгбуш Л. Молекулярная и клеточная биология. -М.: Мир, 1982, т.1, с. 223-224).

Однако для исследования индивидуальных белков в каждом эксперименте требуется построение стандартной кривой на белках с известными молекулярными массами, причем для каждой гелевой пластины. При электрофорезе в полиакриламидном геле компоненты разделяются одновременно и по размеру, и по заряду. Поэтому для достижения более точных результатов необходимо проводить исследование, используя разделение белков в гелях с вариациями концентраций и условий проведения эксперимента.

Наиболее близким к заявляемому является способ определения молекулярной массы белков путем их фракционирования в гель-электрофорезе при условиях, снижающих влияние заряда на электрофоретическую подвижность белков до такой степени, что их миграция в полиакриламидном геле зависит только от размеров молекул (Гааль Э., Медьеши Г., Верецкеи Л. Электрофорез в разделении биологических макромолекул. -М.: Мир, 1982, с. 217-224).

Способ включает гель-электрофорез исследуемой пробы с ДСН в полиакриламидном геле в восстановленных условиях, построение калибровочных кривых зависимости логарифмов молекулярных масс стандартов белков от их относительной подвижности в геле и определение молекулярных масс исследуемых белков по калибровочной кривой.

Установлено, что различные белки связывают практически одинаковое количество ДСН на единицу массы. Белки, содержащие ковалентные связи, связывают меньше ДСН, чем те белки, которые их не содержат, но это различие устраняется при разрыве связей восстановлением дисульфидных мостиков. Поэтому перед электрофорезом проводится обработка исследуемых проб при температуре 98-100^oC в восстановленных условиях.

Недостатком прототипа является то, что для каждой исследуемой пробы требуется набор белков с известной молекулярной массой (стандарт белков). Построение калибровочной кривой для каждой гелевой пластины соответственно, подбор стандартных белков приводит к недостаточной точности при изучении бактериальных культур и не обеспечивает возможности унифицирования результатов, что особенно важно в бактериологических исследованиях.

Целью изобретения является расширение информативности биофизических и биологических исследований, унифицирование результатов исследований.

Поставленная цель достигается тем, что способ определения молекулярных масс индивидуальных белков бактериальных клеток включает электрофорез пробы в ДСН-ПААГе в восстановленных условиях, в качестве стандарта используется протеинограмма коммерческой живой сухой вакцины штамма ЕВ чумного микроба в логарифмической фазе роста и сопоставление со стандартом по конституитивности индивидуальных белков в протеинограмме и его калибровочной шкалой.

По отношению к прототипу заявляемый способ имеет следующие отличительные признаки. Использование калибровочной шкалы штамма ЕВ чумного микроба снижает погрешности определения молекулярных масс белков и упрощает сам процесс.

Использование в качестве стандарта протеинограммы вакцинного штамма ЕВ чумного микроба имеет ряд преимуществ - высокоинформативность, наиболее полный белковый спектр и доступность.

Проведение электрофореза исследуемой и стандартной проб на одной гелевой пластине обеспечивает чистоту эксперимента и унифицирование результатов исследований. Сопоставление по конституитивности индивидуальных белков в протеинограмме позволяет не только достаточно точно идентифицировать их по молекулярной массе, но и различать по биофизическим свойствам, а в сочетании с другими методами характеризовать белки по иммунологическим свойствам.

Пример. Готовят суспензию исследуемой бактериальной массы концентрацией 50 млрд микробных клеток (м.к.)/мл. К пробе добавляют диссоциирующую смесь в количестве 1/4 от объема образца и прогревают при 98-100^oC. Диссоциирующую смесь готовят следующим образом: в 90 мл дистиллированной воды растворяют 1,68 г ТРИС, доводят до pH 6,8 концентрированной соляной кислотой и разбавляют дистиллированной водой до 100 мл. Затем 15 мл приготовленного раствора смешивают с 5 мл β-меркаптоэтанола (МЭ) и 2 г ДСН. ДСН-ПААГ электрофорез проводят по стандартной методике Лэмли. Для этого готовят блок-пластину полиакриламидного геля толщиной 1 мм, состоящую из 10% разделительного геля высотой 120 мм и 5% фокусирующего геля высотой 60 мм. Обработанные диссоциирующей смесью пробы наносят на полиакриламидный гель и проводят электрофорез в ТРИС-глициновом буфере pH 8,3 (электродный буфер). Напряжение на электродах составляет 100 вольт при силе тока 10 мА. Экспозиция в течение 17 часов. При приготовлении разделительного геля смешивают 7 мл раствора мономеров и 14 мл буфера разделительного геля. В полученной смеси растворяют 10 мг персульфата аммония с добавлением 0,1 мл N,N,N,'N-тетраметилэтилендиамина (ТЕМЕД), разведенного 1:10. Сразу после внесения ТЕМЕДа смесь перемешивают и заливают в пластину для электрофореза. Сверху осторожно наслаивают дистиллированную воду и оставляют при 20-24^oC до завершения полимеризации, о чем судят по появлению четкой линии раздела между гелем и водой. После полимеризации воду сливают. Для приготовления фокусирующего геля смешивают 1 мл раствора мономера 9 мл буфера для фокусирующего геля, приготовленного смешиванием 1,68 г ТРИС с 0,1 г ДСН растворением в 90 мл воды. pH 6,8 устанавливают добавлением соляной кислоты, после чего объем доводят дистиллированной водой до 100 мл. Раствор фильтруют. В полученной смеси растворяют 6 мг персульфата аммония и добавляют 0,06 мл ТЕМЕДа, разведенного 1:10. Смесь перемешивают и заливают на разделительный гель, вставляя тефлоновую гребенку для формирования ячеек под пробы. После завершения полимеризации гребенку удаляют.

В качестве стандарта белков на одной гелевой пластине с исследуемыми пробами используют коммерческий препарат сухой живой вакцины штамма ЕВ чумного микроба в концентрации 50 млрд м.к./мл. По окончании электрофоретического разделения белков полученную гелевую пластину окрашивают раствором Кумасси R-250 и фотографируют. Раствор Кумасси R-250 готовят в смеси 50% этанола и 12% ледяной уксусной кислоты на дистиллированной воде. В полученной смеси из расчета на 1000 мл растворяют 1-2 г Кумасси R-250. Все последующие манипуляции проводят с фотографическим отпечатком. Анализ белков пробы проводят по калибровочной шкале молекулярных масс методом сопоставления полученного отпечатка с предлагаемой шкалой (см. чертеж). Учет основан на конституитивности индивидуальных белков стандарта в протеинограммах.

На чертеже слева представлена калибровочная шкала, включающая в себя протеинограммы: стандарта белков с молекулярными массами 14, 20, 30, 39, 67, 94 килодальтон (кД) (1); коммерческого препарата сухой живой вакцины штамма ЕВ чумного микроба, предлагаемого в качестве стандарта белков бактериальных клеток в концентрациях 50 млрд м.к./мл (2) и 20 млрд м.к./мл (3); рисунок-схема распределения бактериальных белков в протеинограммах с указанием молекулярных масс (4). Справа представлены протеинограммы штамма ЕВ чумного микроба (5) и вирулентного штамма чумного микроба N 675 (6). Стрелкой обозначен белок, молекулярная масса которого определена по калибровочной шкале.

Таким образом, заявляемый способ практически доступен и осуществим, его использование значительно расширит возможности изучения бактериальных культур на уровне индивидуальных белков.

Способ может быть использован в медицине, а именно при изучении индивидуальных белков бактериальных клеток. Способ включает электрофорез пробы в ДСН-ПААГе в восстановленных условиях и сопоставление полученной протеинограммы со стандартной протеинограммой белков с известными молекулярными массами, в качестве которой используется протеинограмма коммерческой сухой живой вакцины штамма ЕВ чумного микроба в логарифмической фазе роста. Определение молекулярных масс ведется по калибровочной шкале стандарта исходя из конституитивности индивидуальных белков в протеинограммах штамма ЕВ чумного микроба. Способ расширяет информативность биофизических и биологических исследований молекулярных масс индивидуальных белков бактериальных клеток. 1 ил.

Способ определения молекулярных масс индивидуальных белков бактериальных клеток, включающий электрофорез пробы в ДСН-ПААГе в восстановленных условиях и сопоставления полученной протеинограммы со стандартной протеинограммой белков с известными молекулярными массами, отличающийся тем, что в качестве стандарта белков используют протеинограмму коммерческой сухой живой вакцины штамма ЕВ чумного микроба в логарифмической фазе роста, а определение молекулярных масс исследуемых белков ведут по калибровочной шкале стандарта, исходя из конституитивности индивидуальных белков в протеинограммах штамма ЕВ чумного микроба.