СПОСОБ ИНДИКАЦИИ БАКТЕРИАЛЬНЫХ АНТИГЕНОВ Российский патент 1999 года по МПК G01N27/02 G01N33/53 

Изобретение относится к области иммунологии и может быть использовано в экспрессной индикации бактериальных средств в реакции агломерации при возникновении очага бактериологического заражения.

Известны способы постановки реакций пассивной гемагглютинации /РПГА/, непрямой суспензионной агломерации /РНСА/, включающие титрование исследуемого материала в разводящей жидкости, внесение иммуносуспензионных диагностикумов на основе физических носителей эритроцитов или латексных /полиакролеиновых/ частиц и наблюдение за формированием типичной картины окончания реакции /Инструкция по применению серологических методов диагностики при эпизоотологическом обследовании природных очагов чумы. Саратов, 1974, с. 38-39; Современные аспекты природной очаговости, эпидемиологии и профилактики особо опасных инфекционных болезней. Тезисы докладов научной конференции. Омск, октябрь, 1993, Ставрополь, 1993, с. 214-215/.

Недостатком этих способов является длительность реакций /1,5-4 ч/ и недостаточная точность учета результатов, что обусловлено визуальным определением наличия феноменов образования "пуговок" или "зонтиков".

Известен ряд способов индикации бактериальных антигенов, которые с целью обеспечения экспрессной диагностики предусматривают ускорение процесса образования агглютинатов.

Например, при центрифугировании реакционной смеси при 7-9g агглютинат образовывается уже через 20-30 мин /Заявка N 94043032/13, G 01 N 33/569 от 20.02.97, Бюл. N 5/.

Известен способ, предусматривающий приготовление реакционной смеси, в которой в качестве разводящей жидкости используют электролит, проведение реакции в электрическом поле при напряженности 1000-1200 В/м и плотности тока 0,2-0,4 А/мм², при этом агглютинат образуется в течение 2-5 мин /Заявка N 95102335/13, C 01 N 33/569, от 10.02.97, Бюл. N 4/.

Однако при экспрессности образования агглютинатов учет результатов проводится визуально, что снижает точность диагностики. Кроме того, способы требуют использования специального оборудования, что затрудняет проведение экспрессных бактериологических исследований в очагах заражения.

В настоящее время в различных областях микробиологии для характеристики процессов взаимодействия антигенов микробных клеток и специфических антител, представляющих собой биомакромолекулы, широко используют различные физические единицы измерений /Ройт А. Основы иммунологии//М., Мир. - 1991. - С. 73/. В области молекулярной биофизики основу для понимания механизмов функционирования макромолекул составляют современные представления об электронно-конформационных взаимодействиях /ЭКВ/. Трансформация энергии и появление продуктов реакции в комплексах достигаются в результате внутримолекулярных взаимодействий отдельных частей макромолекулы. Макромолекулы можно рассматривать как своего рода молекулярные "машины" для преобразования одного вида энергии в другую /Рубин А.Б. Биофизика//М., Высшая школа, 1987. - С. 9/. Взаимодействие специфических антител и антигенов может быть определено как разница энергии компонентов и продуктов реакции /Ройт А. Основы иммунологии//М., Мир. - 1987. - С. 75; Мусил Я., Новакова О., Кунц К. Современная биохимия в схемах // М., Мир. - 1984. - С. 75/.

Наиболее близким к заявляемому способу является способ индикация антигенов, основанный на определении параметров энергии иммуносуспензионной реакции, проявляющихся при седиментации физических носителей в стандартных условиях /Заявка N 95105505/13, C 12 Q 1/04 от 20.02.97, Бюл. N 5/.

Способ осуществляется следующим образом. Исследуемый материал смешивают с иммуносуспензионным диагностикумом, например, на основе латексных частиц или эритроцитов в разводящей жидкости и через слой реакционной смеси высотой 1,0-2,0 мм пропускают лазерный луч денситометра, результаты реакции учитывают через 1-2 мин по увеличению пиков оптической плотности относительно базовой линии в 2-4 раза.

Способ обеспечивает экспрессность и повышает точность индикации.

Недостатком способа является необходимость использования специального оборудования, что затрудняет организацию экстренной индикации в чрезвычайных ситуациях.

Целью изобретения является упрощение способа индикации бактериальных антигенов, обеспечение экспрессности и высокой точности бактериологических исследований в чрезвычайных ситуациях.

Поставленная цель достигается тем, что исследуемый материал смешивают с иммуносуспензионным диагностикумом в разводящей жидкости, в качестве которой используют электролит, с последующим учетом результатов реакции по удельному сопротивлению реакционной смеси и при соотношении значений сопротивлений контрольной и исследуемой смесей, равному 0,5-0,7, индикацию оценивают специфической.

По отношению к прототипу заявляемый способ имеет следующие отличительные признаки.

Использование в качестве разводящей жидкости для приготовления реакционной взвеси электролита обеспечивает возможность учета специфических взаимодействий биомакромолекул, один из типов которых фиксирован на физических носителях, посредством измерения изменений наиболее чувствительного параметра - удельного сопротивления раствора.

Соотношение значений сопротивлений контрольной и исследуемой смесей, равное 0,5-0,7, является необходимым и достаточным условием для фиксации начала процесса специфического взаимодействия биомакромолекул, что коррелирует с результатами реакций, получаемыми вследствие седиментации физических носителей, при выполнении анализов по обычной методике.

Кроме того, за счет регистрации значимых изменений сопротивления реакционной взвеси в лунках с эквимолярными соотношениями ингредиентов, показывающих отрицательный результат при седиментации, чувствительность заявляемого способа при выявлении биомакромолекул и антигенов возрастает в 2-4 раза.

Изменение величины удельного сопротивления реакционной взвеси происходит при нормальных условиях без приложения поля электрического воздействия - напряженности и тока при конститутивных концентрациях диагностикумов /30 мкл 2,5% эритроцитарного диагностикума на 500 мкл электролита/ и стандартных условиях.

Возникновение процесса изменения удельного сопротивления реакционной взвеси с начала реакции агломерации и возможность его измерения в емкостях различных объемов /50-5000 мкл/ доступными средствами, например, тестером обеспечивают экспрессность, точность, повышение чувствительности и простоту индикации бактериальных антигенов и биоматериалов, содержащих определенные иммуноглобулины, в чрезвычайных ситуациях.

Возможность применения заявляемого способа в практических эпидемиологических исследованиях подтверждается примерами его конкретного выполнения с использованием полной совокупности заявляемых признаков изобретения.

Пример 1. Исследуемый материал - смыв с поверхности /в дальнейшем смыв/ заразили клетками чумного вакционного штамма Y. pestis EV в концентрации 0.2•10⁷ мк/мл и обеззаразили формалином. Смыв с поверхности в объеме 0,5 мл вносили в начальную лунку полистироловой пластины, содержащей 0,5 мл разводящей жидкости, в качестве которой использовали электролит - трис-ацетатный буферный раствор с pH 8,0 /в дальнейшем электролит/ и титровали в шести - восьми лунках с удалением 0,5 мл из последней. В одну контрольную лунку вносили только 0,5 мл электролита. В лунки с раститрованным смывом и в контрольную вносили 0,05 мл 2,5% взвеси чумного эритроцитарного диагностикума /в дальнейшем диагностикум/ в растворе электролита, который путем легкого встряхивания пластины равномерно суспендировали в реакционной смеси.

Контрольную реакцию в электролите ставили в соответствии с вышеописанной методикой с использованием в качестве исследуемого материала гетерологичного штамма E.coli C600 в такой же концентрации.

Затем зафиксированными в определенном положении электродами тестера замеряли сопротивление электролита, сопротивление реакционной взвеси в контрольных и во всех 8 опытных лунках и определяли их соотношение.

В течение первых 5-10 секунд результаты соотношений сопротивлений контрольного и опытного ряда лунок с эквимолярной концентрацией составили 0,5-0,7.

Для подтверждения достоверности заявляемого способа ставили реакцию пассивной гемагглютинации с использованием тех же исследуемых материалов, но в качестве разводящего материала физраствора.

Отмечена корреляция результатов индикации бактериальных антигенов, полученных с помощью заявляемого способа с картинок седиментации агломератов в РПГА по обычной методике через 4 часа. При этом достоверные для специфической индикации значения соотношений сопротивлений отмечались и в двух лунках, содержащих антиген в количествах, недостаточных для образования "зонтика" с площадью в 2/3 днища лунки.

На чертеже графически показаны значения сопротивлений реакционных взвесей в лунках опытного /кривая 1/ и контрольного рядов /кривая 2/ при различных концентрациях антигенов, анализ соотношений которых показывает, что достоверная индикация специфичности реакции обеспечивается до 62-31 тыс. м.к. /мл.

Таким образом, сопоставление результатов решения поставленной задачи по заявляемому и известным способам показывает, что при его использовании чувствительность индикации повышается по сравнению с традиционным с 250-120 тыс. м. к. /мл до 62-31 тыс.м.к./мл, что соответствует аналогам с ускоренной агломерацией, наблюдаемой визуально и прототипу, время индикации сокращается с 4 ч по традиционной методике и 30-60 сек по прототипу до 5-10 сек, при этом способ значительно проще известного, что обеспечивает возможность его использования в экстремальных условиях.

Изобретение относится к области иммунологии и может быть использовано в экспрессной индикации бактериальных средств в реакции агломерации в очаге бактериологического заражения. Для упрощения способа, обеспечения экспрессности и высокой точности бактериологических исследований в чрезвычайных ситуациях способ включает смешивание исследуемого материала с иммуносуспензионным диагностикумом в разводящей жидкости, в качестве которой используется электролит с последующим учетом результатов реакции по удельному сопротивлению реакционной смеси и при соотношении значений сопротивлений контрольной и исследуемой смесей, равном 0,5 - 0,7, индикацию оценивают специфической. 1 ил.

Способ индикации бактериальных антигенов в реакции агглютинации, включающий смешивание исследуемого материала с иммуносуспензионным диагностикумом в разводящей жидкости с последующим учетом результатов реакции по физическому показателю реакционной смеси, отличающийся тем, что в качестве разводящей жидкости используют электролит, а физического показателя реакционной смеси - ее удельное сопротивление и при соотношении значений сопротивлений контрольной и исследуемой смесей, равном 0,5 - 0,7, индикацию оценивают специфической.