СПОСОБ ПРЕДОТВРАЩЕНИЯ ИЛИ ИНГИБИРОВАНИЯ ИНФИЦИРОВАНИЯ Т-ЛИМФОЦИТОВ ЧЕЛОВЕЧЕСКИМ ВИРУСОМ ИММУНОДЕФИЦИТА (HIV) И РЕПЛИКАЦИИ IN VIVO Российский патент 2000 года по МПК A61K31/47 

Предпосылки к созданию изобретения
Это изобретение относится к использованию противомалярийных лекарств для ингибирования инфекции восприимчивых клеток вирусом человеческого иммунодефицита (HIV). Это изобретение относится также к методу ингибирования пролиферации HIV.

Приобретенный иммунный дефицитный синдром (AIDS) является настоящее время вопросом первостепенной важности в Северной Америке, Европе и Центральной Африке. Полагают, что случайным агентом AIDS является ретровирус. Сделанные в последнее время оценки предполагают, что приблизительно 1,5 миллиона американцев могут подвергнуться воздействию вируса AIDS. Затронутые этим вирусом люди выявляют сильное подавление иммунитета, что может сопровождаться началом дегенеративных и даже фатальных болезней.

Выделение и характеристика первого ретровируса AIDS, известного как LAV, были описаны в работе F. Barre-Sinoussi и др., Science, 220: 868 - 871 (1983). Использование некоторых экстрактов этого вируса и некоторых его белков для обнаружения антител против вируса описано в Патенте США N 4 708 818 Dr. Zuc Montagnier с сотрудн.

Впоследствии несколькими исследователями было сообщено о нескольких культурах ретровирусов AIDS и культуры упоминались в литературе под различными обозначениями. Сейчас ясно, что предложенные ранее вирусы - вирус, связанный с лимфаденопатией (LAV), вирус, связанный с иммунным дефицитом (JDAVI 1 и JDAVI 2), человеческий T-лимфотропный вирус типа III (HTLV-III) и вирус, родственный AIDS (ARV), - все являются вариантами одного и того же ретровируса. См., например, Nature, 313: 636 - 637 (1985).

Субкомитет, уполномоченный Международным Комитетом по систематике вирусов, в последнее время предложил, чтобы ретровирусы AIDS были официально обозначены как "Вирусы иммунодефицита человека", известные в форме аббревиатуры как "HIV". Культуры человеческих ретровирусов с явным, но ограниченным сходством по отношению к культурам HIV (например, более чем 20%, но менее чем 50% идентичности чередования нуклеиновой кислоты) не должны называться HIV, несмотря на то, что имеется непреодолимое сходство у существующих элементов групп в их биологических и структурных свойствах. Science, 232: 697 (1986).

Другой патогенный человеческий ретровирус, названный HIV-2, (по старому LAV-2) был недавно выделен у западно-африканского пациента с AIDS. Clavel с сотруд. , Science, 233: 343 - 346 (1986). HIV-2 инфекция связана с синдромом иммунодефицита, не отличающегося клинически от вызываемого прототипом вируса AIDS, HIV-1. HIV-2 является родственным, но при этом отличается от HIV-1. Guyader с сотруд., Nature, 326: 662 - 669 (1987).

Ретровирусы, генетически родственные и аналогичные в биологическом отношении HIV, были выделены от субчеловеческого подвида приматов. Эти ретровирусы обозначаются как образцы вируса иммунодефицита соответствующего носителя (хозяина), такого, например, как обезьяний вирус иммунодефицита (SIV). SIV был впервые выделен от пленной (содержащейся в неволе) резус макаки (Macaca mulatta) в областном исследовательском центре приматов в Новой Англии (NERPRC). Вскоре последовало сообщение о выделении SIV названного STLV-III от африканской зеленой обезьяны. Между HIV-2 и SIV существует обширное серологическое (иммунологическое) сходство в реакционной активности.

Передача HIV обычно происходит при сексуальном контакте, хотя люди, использующие наркотики внутривенно, также представляют собой группу высокого риска. Большое число людей было заражено также HIV после получения зараженной крови или кровяных продуктов.

Становится все более очевидным, что в передаче HIV важными являются другие факторы в виду наличия AIDS в области эпидемической малярии. Одним из факторов этиологической склонности к AIDS является недостаточность функции Fc-рецептора в ретикулоэндостелиальной (фагоцитовой) системе. B.S. Bender, J. Infect. Dis 152; 409 - 412 (1985). Недостаточность функции Fc-рецептора эритроцитов и последующая очистка иммуноглобулина эритроцитов клеток была продемонстрирована у пациентов с вирусом AIDS. Кроме того, было показано, что активность антитела ретровируса в отношении вируса AIDS выявляет значительную кросс-реактивную способность в отношении уровня антител против Plasmodium falciparum. R. J. Biggar с сотр. Zancet, 7 сентября 1985: 520 - 523. Хотя и остаются некоторые дебаты по вопросу о кросс-реактивности R.J. Biggar с сотр. , New Engl. J. Med. 315: 57-8 (1986), A.E. Greenburg и др., Zancet, 2 августа, 1986: 247 - 249, эта дискуссия не принимает во внимание возможность двойственной экспозиции (продолжительности) и очищения от инфекционного агента AIDS, разработкой антител в отношении вируса AIDS. Далее кросс-активность антител между AIDS и малярией выявляется эффективностью действия до некоторой степени специфичных антималярийных агентов в благоприятных инфекциях. Пириметамин-сульфадоксин в сочетании показали эффективность в воздействии на Pneumocystis carinii инфекции у пациентов с AIDS. R.D. Pearson и др. Ann. Int. Med. 106: 714 - 718 (1987).

Существование многочисленных человеческих вирусов иммунодефицита, таких как HIV-1 и HIV-2, создает сложную эпидемиологическую картину. Существует общее убеждение в том, что должна быть создана эффективная вакцина или фармацевтическая композиция против инфекции HIV для того, чтобы задержать распространение этих ретровирусов. Работа по созданию вакцины развивается, но эффективный агент пока еще не найден. Таким образом, в этой области существует необходимость в создании метода ингибирования активности HIV in vivo.

Изложение сущности изобретения
Данное изобретение помогает в осуществлении изложенной выше необходимости. Более конкретно, данное изобретение дает метод ингибирования активности человеческого вируса иммунодефицита (HIV) in vivo, и этот метод включает прием человеком-носителем антималярийных лекарств (средств), которые способны проявлять защитный эффект, целебный эффект или предотвращать передачу малярии у людей. Антималярийные средства выбраны из групп, содержащих
(a) алкалоиды;
(b) 9-аминоакридины;
(c) 4-аминохинолины;
(d) 8-аминохинолины;
(e) дигуаниды;
(f) ингибиторы дигидрофолаты редуктазы;
(g) сульфоны;
(h) сульфонамиды;
(i) мефлокуин;
(j) галоидфантрин;
(k) гидроксианилино-бензо-нафтиридины и
(l) (2/3) сескви-терпен-лактоны.

Антималярийные средства принимаются человеком в количестве, достаточном для предотвращения или по меньшей мере ингибирования T лимфоцитов HIV in vivo или для предотвращения или по меньшей мере ингибирования повторности HIV in vivo.

Неуловимость и отвлеченность (отклонение) HIV создает определенные трудности в воздействии на него. Предлагаемое здесь является средством и методом, способным предотвратить распространение и приобретение HIV-инфекции, и помогает в воздействии на эту инфекцию.

Подробное описание предложенных воплощений
Метод, предлагаемый данным изобретением, используется для воздействия на людей, или инфицированных HIV, или восприимчивых к HIV-инфекции. Выражение "HIV-инфекция" включает все типы инфекций, включенных в классификационную систему, опубликованную центрами по руководству болезнями, Атланта, Джорджия. Эти инфекции включают острую инфекцию HIV; бессимптомные условия; устойчивую распространенную лимфаденопатию; и другие болезни, такие как органические (общие) болезни, неврологические болезни, вторичные инфекции, вторичные (побочные) раковые заболевания и другие состояния, характерные для HIV-инфекции или иммунодепрессии.

Метод данного изобретения особенно полезен для ингибирования активности HIV-1 или HIV-2 у людей, инфицированных ими. Несмотря на то, что это изобретение дает описание в отношении человеческих культур, идентифицированных в литературе как LAV-1, HTLV-III и LAV-2, понятно, что это изобретение распространяется в такой же мере на эквивалентные ретровирусы. Полагают, что эти ретровирусы являются причиной заболевания AIDS и HIV.

В цели данного открытия вирус рассматривается как то же самое или как эквивалент LAV/HTLV-III, если он в основном соответствует следующим критериям:
(a) Вирус является тропическим для T-лимфоцитов, особенно для кооперирующих T-клеток (CD4⁺);
(b) Вирус является цитопатическим для инфицированных CD4⁺ клеток;
(c) Вирус кодирует RNA-депендент (аргумент) DNA полимеразы (обратная трансциптаза), который является Mg²⁺-депендентом и может использовать олигомер (dT)_12-18 в качестве основы для обратной транскрипции (перехода) из его 3'LTR;
(d) Вирус в основном является иммунологически кросс-реактивным по отношению к белкам (протеинам), закодированным как qaq и env области LAV/HTLV-III; и
(e) Вирус в значительной степени принимает участие в нуклеотидной гомологии (приблизительно 75-100%) и в последующей аминокислотной гомологии (приблизительно 75-100%) с LAV или HTLV-III.

Основной фармацевтически активный компонент, применяемый в способе данного изобретения, представляет собой антималярийное средство. Как здесь указывалось, термин "антималярийное средство" включает средства, которые имеют защитное (профилактическое) действие против малярийной инфекции, целительное (терапевтическое) действие против малярийной инфекции или предотвращает передачу малярии у людей. Таким образом, антималярийные средства включают средства, используемые перед заболеванием малярией или перед тем, как малярийная инфекция становится очевидной с целью предотвращения или распространения инфекции или любых ее симптомов. Антималярийные средства включают также средства, которые используются терапевтически для воздействия на установленную малярийную инфекцию. Далее, антималярийные средства включают средства, используемые для предотвращения заражения людей возбудителями малярии, сюда входят также средства, вмешивающиеся или причиняющие вред циклу жизни малярийных паразитов у человека.

Антималярийные средства, которые могут быть применены при практическом осуществлении способа данного изобретения, выбраны из групп, состоящих из алкалоидов, таких как хинин и хинидин; 9-аминоакридины, такие как мепакрин; 4-аминохинолины, такие как хлорохин и амодиахин; и 8-аминохинолины, такие как примахин, памахин и хиносид. Дигуаниды, такие как прогуанил (хлоргуанид), также могут быть использованы. Примерами других подходящих антималярийных средств являются диаминопиримидины, такие как пириметамин или другие редуктазные ингибиторы-производные дигидрофолиевой кислоты, такие как триметоприн сульфоны, такие как диаминодифенилсульфон (DDS или дапсон) и диформилдифенилсульфон; и сульфонамиды, такие как сульфадиазин, сульфаметоксипиразин, сульфамонометоксин, сульфадоксин и сульфаметоксазол.

Могут быть применены также мефлохин, галофантрин; гидроксианилино-бензо-нафтиридины, такие как пиронаридин; и сесквитерпен лактоны, такие как артемизинин. Эти антималярийные средства и способы их приготовления известны в данной области.

При практическом осуществлении метода данного изобретения могут использоваться комбинации одного или большего числа антималярийных средств помимо комбинации пириметамин-сульфадоксин. Так, например, может быть использована комбинация пириметамина и хлорхина. Аналогично, амодиахин может быть использован вместе с примахином, приметамин может сочетаться с дапсоном, хлорохин может быть использован с примагуанином или хлоропрогуанином, пириметамин или другое средство - антифолат может быть скомбинирован с сульфадоксином и пириметамин может быть использован вместе с сульфаленом или сульфадиазином или сульфаметоксипиразином.

Найдено было, что использование одних антибиотиков по способу данного изобретения в качестве антималярийных средств не является эффективным. Таким образом, выражение "антималярийное средство", использованное здесь, предполагает исключить антималярийные антибиотики при использовании только одних антибиотиков в процессе осуществления метода данного изобретения. Однако понятно, что антималярийные антибиотики, такие как тетрациклин и клиндамицин (диоксициклин, линкомицин) могут применяться в комбинации с одним или с большим числом упомянутых выше антималярийных средств.

Понятно также, что способ данного изобретения может быть осуществлен соединениями, которые замещаются in vivo на один из приведенных выше антималярийных препаратов, а также и соединений, которые образуют метаболиты (продукты обмена) in vivo аналогично метаболитам, образованным из упомянутых выше антималярийных средств.

Антималярийные средства могут применяться в форме свободных оснований или в форме фармацевтически приемлемых кислых присоединенных солей. Примерами подходящих солей являются хлориды, гидрохлориды, сульфаты, фосфаты и дифосфаты. Могут быть использованы также другие водорастворимые нетоксичные неорганические и органические соли.

При осуществлении способа изобретения антималярийное средство принимается большинством людей с применением одного из обычно используемых методов приема антималярийных агентов. Так, например, лекарство может быть введено большинству людей оральным способом или парентерально, путем внутривенных или внутримышечных инъекций. Для целей инъекций описанные выше соединения могут быть приготовлены в форме растворов, суспензий или эмульсий в средах, удобных в применении для этой цели. Могут использоваться также и другие методы приема.

Антималярийные лекарства применяются в соответствии со способом данного изобретения в количестве, достаточном для обеспечения адекватной концентрации лекарства для прекращения действия или по меньшей мере для ингибирования инфекции Т-лейкоцитов вируса HIV in vivo или для предотвращения или по меньшей мере ингибирования повторности HIV in vivo. Количество лекарства, таким образом, зависит от абсорбции, локализации и выведения из человеческого организма. Конечно, эффективность антималярийных лекарств определяется дозой. Дозировка антималярийного лекарства должна быть достаточной для создания минимального заметного эффекта, при этом доза должна быть меньше, чем установленная летальная доза. Дозировка принимаемого антималярийного лекарства для носителя (инфекции) может варьироваться в широких пределах. Соединения могут приниматься в минимальном количестве, дающем терапевтический эффект, и доза может быть увеличена в случае необходимости до максимальной величины дозировки, переносимой пациентом. Антималярийное лекарство может приниматься с относительно высокими весовыми дозировками при более низком содержании основного вещества или лекарство может приниматься в виде однородной дозировки.

Дозировка и частота приема будет меняться для применяемого антималярийного средства в соответствии с методом изобретения. Антималярийные средства по данному изобретению могут быть применены в количествах вплоть до 6-кратных максимальных доз, рекомендуемых для лечения малярии. Обычно доза не превышает 5-кратной величины максимальной дозы, рекомендуемой для лечения малярии, и наиболее часто она составляет величину, не превышающую 4-кратную максимальную величину дозы, рекомендуемой для лечения малярии. Далее следуют примеры подходящих уровней дозировки.

Дигидрохлорид хинина или сульфат могут приниматься орально в таблетках, содержащих 300-650 мг лекарства, 2-3 таблетки ежедневно. При приеме этого лекарства в виде жидкости путем инъекции может быть рекомендовано использование растворов, содержащих 300-500 мг/мл лекарства в течение периода времени 3-4 часа, вплоть до 600 мг, и прием может быть повторен 2-3 раза в течение 24 часов.

Антималярийное лекарство хлорхининфосфат и хлорхининсульфат могут приниматься орально в виде таблеток (100 мг, 150 мг и 300 мг) до 300-600 мг в одну неделю. Растворы этих антималярийных лекарств могут использоваться в виде внутримышечных или внутривенных инъекций в виде 5%-ных растворов при дозировке 200-300 мг - внутримышечно при повторении каждые шесть часов или внутривенно (капельница) 300-600 мг в 500 мл солевого раствора.

Амодиакуаин гидрохлорид или свободное основание может приниматься орально в виде таблеток, содержащих 200 мг лекарства при норме 400-2000 мг в одну неделю. В качестве другого примера примакуин дифосфат может приниматься орально в виде таблеток, содержащих 5 мг - 7,5 мг лекарства при норме 2-3 таблетки в день.

Прогуанил может приниматься орально в виде таблеток по 100 мг каждая при норме 1-2 таблетки ежедневно. Хлорпрогуанин может приниматься перорально в виде таблеток, содержащих 20 мг лекарства при норме 1 таблетка в неделю. Аналогичным образом, таблетки, содержащие пириметамин (25 мг), могут приниматься, исходя из нормы 1 таблетка в неделю.

Мефлокуин также рекомендуется для орального приема. Таблетки, содержащие 250 мг лекарства, могут приниматься в виде единичного приема или раздельными дозами в 1500 мг.

Доза антималярийного лекарства определяется с учетом величины среднего веса. Таким образом, понятно, что дозировка будет изменяться в пределах 20-25% для пациентов с более легким или более тяжелым весом. Аналогичным образом, дозировка для детей будет регулироваться с использованием хорошо известных для этой цели расчетных формул.

Примакуин вследствие его более эффективного экстраэритроцитового воздействия на ретикулоэндотелиальную систему и на распространение вируса является более предпочтительным антималярийным средством для использования по методу данного изобретения. Доза для взрослого человека составляет около 15 мг/день основания (26 мг/день соли) орально или около 45 мг/неделю основания (79 мг/неделю соли) орально. Для детей доза составляет около 0,3 мг/кг основания в день (0,5 мг/кг в день соли) орально или около 0,9 мг/кг основания в неделю (1,5 мг/кг соли в неделю) орально.

Как отмечалось ранее, любое из антималярийных лекарств может быть использовано по данному изобретению при уровнях дозировки, в несколько раз превышающих дозировки, рекомендуемые для лечения малярии. Так, например, взрослая доза примакуина может быть увеличена до 250 мг/неделю основания. В качестве другого примера хлорокуин может быть применен в соответствии с данным изобретением с уровнем взрослой дозировки около 1800 мг/неделю.

Из-за риска гемолиза, в особенности для индивидуумов с дефицитов глюкоза-6-P-дегидрогеназы, существуют и другие альтернативы. Они включают менее токсичные 8-аминохинолины или другие носители, связывающие примакуиновые агенты. I. Hofsteenge и др., J. Med. Chem., 29: 1765-1769 (1986).

Существует много предположений в отношении механизма действия антималярийных средств при использовании их для предотвращения и лечения малярии. D. A. A. Akintonwa, J. Theor. Biol., 106: 78-87 (1984). R. Deslauriers и др. Biochimica et Bioph sica Acta, 931: 267-275 (1987). Предполагаемые механизмы включают ингибирование лизосомных катепсинов, протонирование в пределах кислого внутриклеточного отдела, стабилизацию мембран и энзимное возбуждение. Непосредственное действие антималярийных средств в предотвращении и лечении малярии состоит в ингибировании спорозоидной инвазии (приступа) ретикулоендотелиальных клеток. A.L. Schwartz и др., Molec. and Biochem. Parasit. 14: 305-311 (1985). Во всех случаях механизм, по которому антималярийные средства ингибируют активность HIV in vivo по методу данного изобретения, не до конца понятен. В действительности механизм может быть обусловлен одним фактором или комбинацией факторов, таких как изменение генотипного или фенотипного (симптомного) признаков ретровирусов или изменение виральных или клеточных процессов. Таким образом, антималярийное лекарство может ингибировать инфекцию восприимчивых CD⁴⁺ клеток, нарушением функции рецепторов клеток или виральной оболочки рецепторов или изменением природы механизма связи. Очевидно, что вирус подвергается транслокации в клетку. Таким образом, антималярийное средство может изменять процесс транслокации. Далее, геномные элементы, которые регулируют образование продуктов, необходимых для виральной воспроизводительности (повторяемости), могут быть изменены или антималярийные средства могут затронуть их функции. Так, например, антималярийные средства могут действовать как ингибиторы обращения транскриптазы или могут изменять природу оболочки гликопротеина ретровируса или ингибировать образование tat гена, или воздействовать на уровень образования детерминантов env гена на поверхности клетки. Антималярийные средства могут также действовать непосредственным вмешательством в функционирование ретикулоендотелиальной системы либо до, либо после того, как произошло заражение (инфицирование) HIV. Например, антималярийные средства могут усиливать выделение Fc-рецептора или функцию in vivo в мононуклеарно-фагоцитной системе. Это может привести к снижению восприимчивости к условно-патогенным инфекциям, связанным с AIDS. Антималярийные средства могут также ингибировать протиферацию (разрастание) HIV в инфицированных фагоцитовых клетках. Понятно, что антималярийные средства могут действовать любым из указанных способов или их комбинированием или другими, в настоящее время еще не распознанными способами. Во всех случаях антималярийные средства могут приниматься пациентом в количествах, достаточных для достижения одного или большего числа из перечисленных эффектов.

Эффективность антималярийных средств в предотвращении или ингибировании инфекции клеток демонстрируется с использованием стандартных in vivo испытаний. Так, ингибирующий эффект антималярийных средств на инфекцию HIV или на воспроизводимость может быть продемонстрирован культивированием вируса или зараженных вирусом клеток в присутствии или в отсутствии антималярийных средств с последующим сравнением результатов.

Один из методов включает культивирование нормальных периферических мононуклеарных клеток крови или других культур клеток, подвергающихся действию вируса. Испытания на инфективность могут использовать или свободные вирусы или инфицированные вирусом клетки, которые сокультивированы с чувствительной индикаторной клеткой. Вирус воспроизводится в реципиентной индикаторной клетке. Ингибирующее действие лекарства на HIV может быть продемонстрировано сравнением вирального воспроизводства в отсутствии антималярийного средства с виральным воспроизводством в присутствии его.

Виральное воспроизводство может быть определено наблюдением активности обратной транскриптазы (RT). Образование вируса может быть определено также электронно-микроскопическим наблюдением частиц вируса и различных виральных белков. Различные протоколы обнаружения для виральных белков могут использовать стандартные антитела, приготовленные против вируса у многих разновидностей животных. Иммунофлуоресценция может быстро обнаружить виральные белки, и могут быть приготовлены чувствительные гипериммунные сыворотки. Могут быть использованы также радиоиммунный и ELISA анализы для измерения присутствия виральных белков конкуренцией в системе, где радиоизотопная (меченная) или калориметрически определяемая система антиген-антител может быть нарушена добавлением активных антигенов.

Другой подход для демонстрации эффективности антималярийных средств включает обнаружение вируса определением необъединенных и объединенных виральных DNA, а также и виральных mRNA, Nature, 312: 166-169 (1984). В определении относительных количеств виральных DNA и RNA в вирус-поврежденных клетках и тканях полезными являются южные и северные методы меченной гибридизации. Science 227: 177-182 (1985). Может быть проведено зондирование для определения суммарного количества провирусов с использованием молекулярно клонированной меченной провиральной DNA, и затем можно определить в DNA-передаточном эксперименте, появляется ли провиральный интегральный геном в клеточной DNA при гибридизации. Если провирус содержит только несколько клеток, может быть предпринята гибридизация на месте.

В особенности, в типичном эксперименте клетки подвергаются воздействию клеточно-свободных вирионов при множественности виральных частиц на клетку и культивируются в присутствии и в отсутствии антималярийных средств. DNA с высокой молекулярной массой экстрагируется при различных временах и анализируется содержание виральной DNA с использованием меченных радиоактивных испытаний HIV. Nature, 312: 166-169 (1984). При отсутствии антималярийных средств в условиях культивирования определяется виральная DNA. В противоположность этому в DNA из тех клеток, которые были полностью защищены антималярийными средствами, не обнаружено ни дезинтегрированной, ни интегрированной DNA.

Возможно также проследить виральные репликации определением количества виральной RNA в сигнальных Т-клетках, подверженных действию вируса и культивированных без и с антималярийными средствами. В этих опытах клетки подвергаются действию HIV, и RNA извлекается из клеток. Выделенная RNA затем анализируется на содержание виральной mRNA методом северной меченной гибридизации с использованием радиоактивного меченного HIV антисенсорного RNA испытания. Science, 227: 177-182 (1985). В отсутствии дидеоксинуклеоксидов виральная mRNA обнаруживается. Когда эти культуры выдерживаются в течение значительного периода времени в присутствии антималярийных средств, виральная RNA в клетках не выявляется, или, если выявляется, присутствует в существенно сниженных количествах. Такая система анализа делает возможной оценку способности антималярийных средств в отношении ингибирования синтеза HIV нуклеотида и в определении mRNA в Т-клетках, подвергшихся действию вируса.

Кроме того, инфицированные HIV-1 клеточные линии MT2 и MT4 являются чувствительными к цитопатическому действию вируса. Таким образом, эти клетки могут быть использованы в анализе образования тромбоцитов для демонстрации ингибирующего действия антималярийных средств на HIV инфекцию или пролиферацию. Science, 229: 563-566 (1985).

Эффективность антималярийных средств в ингибировании HIV инфекции демонстрируется также in vivo определением ингибирующего эффекта средства на виральное содержание p24 qaq белка в H9 клетках, частично резистентных к действию цитопатического эффекта HIV. M. Popovic и др., Science, 224: 497-500 (1984). После воздействия вируса на H9 клетки определяется антиген p24 непрямым иммунофлуоресцентным анализом с использованием муринных моноклональных антител. Клетки H9 относительно устойчивы к циклопатическому воздействию HIV и содержание белка (протеина) p24 qaq после воздействия HIV может быть использовано в качестве показателя инфективности и репликации in vivo. В таком случае возможна оценка антивирусного воздействия соединений выражением количественного содержания HIV p24 qaq белка в H9 клетках, которые были подвергнуты воздействию вируса, но были культивированы в присутствии лекарственных средств. Proc. Natl. Aca. Sci. USA, 82: 4813-4817 (1985).

Анти-HIV активность может быть продемонстрирована также выявлением ингибирующего действия антималярийных средств на цитопатический эффект HIV. Был описан клон антилетального хелпера-возбудителя Т-клетки (ATH8), и он показывает цитопатический эффект вируса. При культивировании ATH8-клеток в испытательной пробирке (на питательной среде) эти клетки образуют шарики (гранулы) на дне пробирки, и размер (количество) этих шариков отражает количество жизнеспособных целевых Т-клеток. В этих условиях цитопатический эффект подвержен прямому визуальному наблюдению. При воздействии HIV в отсутствии защитных антималярийных средств вирус оказывает глубокое цитопатическое воздействие на целевые Т-клетки. При добавлении антималярийного средства в культуру в начале испытания целевые ATH8 клетки защищены против цитопатического воздействия вируса и могут продолжать рост. Эти наблюдения могут быть доказаны и подтверждены количественно подсчетом числа жизнеспособных клеток по методу исключения красителя. Таким образом, это испытание ингибирующего действия цитопатического эффекта HIV позволяет одновременно оценить потенциальную антивирусную активность и токсичность выбранных соединений. См. Hiroaki M. и др., Science, 240: 646-649 (1988), для дополнительных подробностей такого испытания.

Окончательно, активность антималярийных средств может быть показана нормальными Т-клетками in vivo. В этих опытах для наблюдения эффекта воздействия лекарственных средств на индуцированную антигенную пролиферативную реакцию использовались нормальные клонированные хелпер-индукторные Т-клетки, такие как нормальные столбнячные токсид-специфичные хелпер/индукторные клональные Т-клетки (TMI-1). Детали этого метода описаны H. Mitsuya и др. Science, 240: 646-649 (1988).

Эффективность антималярийных средств в предотвращении или ингибировании HIV инфекции или репликации может быть подтверждена in vivo на шимпанзе. У этих приматов была продемонстрирована стойкая инфекция HIV, хотя болезнь, аналогичная AIDS, не выявлена. Эффективность действия антималярийных средств была продемонстрирована сравнением между собой шимпанзе, на которых не было оказано воздействия и тех, на которых воздействовали сывороточным введением антигенов HIV, с последующим выделением инфицированного вируса из организма животных с демонстрацией лимфаденопатии, с изменением в уровнях T4 или T8 лейкоцитов или сочетанием этих факторов.

HIV, требуемые для осуществления этих анализов, могут быть получены из стандартных источников с использованием стандартных методов. Например, мононуклеарные клетки, приготовленные из периферической крови, костного мозга и других тканей пациентов и доноров, могли быть стимулированы (раздражены) митагеном (фитогемагглютинин-P) в течение от 48 до 72 часов и помещались в клеточную культуру, использующую для роста питательную среду, содержащую фактор роста Т-клетки (TCGF). Вирус может быть определен следующим образом: (1) наблюдением отстоявшихся жидкостей с точки зрения активности виральной обратной транскриптазы; (2) передачей вируса свежим нормальным человеческим Т-лимфоцитам (например, амбилической пуповинной крови, взрослой периферической крови или костно-мозговым лейкоцитам) или восстановленным линиям Т-клетки; M. Popovic и др. Science, 224: 497 (1984); (3) электронно-микроскопическим наблюдением фиксированных (постоянных) и разделенных клеток; и (4) исследованием количества антигенов непрямой иммунофлуоресценцией или западным меченным методами с использованием сыворотки от доноров с положительной серологической реакцией. Определение (обнаружение) вирус-положительных клеток и характеристика и сравнение виральных культур может проводиться с использованием HIV-специфичных иммунологических реагентов и исследования нуклеиновой кислоты. F.Barre-Sinoussi и др., Science, 220: 868-871 (1983); R. C.Gallo и др., Science 220: 865-867 (1983).

Многие установившиеся клеточные линии были испытаны в качестве цели для проникновения HIV-I инфекции. Одна неопластичная (опухолевая) анеуплоидная линия Т-клетки, извлеченная у взрослой особи с лимфоидной лейкемией и обозначенная HT, является восприимчивой к инфекции HTLV-III. HT клетки непрерывно образуют HTLV-III после повторного выдерживания родительских клеток в концентрированной жидкой культуре клеток, взятых от кратковременных культивированных Т-клеток (выращенных в TCGF), которые первоначально принадлежали пациентам с синдромом лимфоденопатии или AIDS. Когда клеточная пролиферация спадает, обычно это происходит через 10-20 дней после ее пребывания в жидкой культуре, к культуре добавляются свежие (не подвергшиеся инфекции) HT парентальные клетки. Для того, чтобы улучшить разрешимость для HIV и предотвратить постоянный рост и непрерывное образование вируса, HT клеточные популяции были в значительной степени (широко) клонированы. Некоторые их этих клонов HT клеток были помещены в клеточную культуру.

В дополнение к HT существуют и некоторые другие T или пре-T человеческие клеточные линии, которые могут подвергнуться действию инфекции при продолжении образования HIV. Примерами таких клеточных линий являются H4, H9, HUT78, CEM, Molt3 и Ti7.4. Gallo и др., Патент США 4652599. Кроме того, некоторые B-лимфобластовые (лимфозлокачественные) клеточные линии также могут быть значительно инфицированы HIV. L. Montagnier и др. , Science, 225: 63-66 (1984).

Антималярийные средства и их фармацевтически приемлемые соли могут использоваться млекопитающими, включая человека, но не ограничиваясь им, лечение проводится в форме пилюль, таблеток, лепешек, пастилок, капсул, суппозиториев, вводимых инъекцией или принимаемых желудочным путем растворов и тому подобное - при воздействии на цитопатические и патологические состояния у людей и у восприимчивых нечеловекообразных приматов, вызываемые нарушениями в функции иммунных систем, в частности в отношении снижения уровня CD4⁺T лимфоцитов.

С описанными здесь антималярийными соединениями могут быть скомбинированы соответствующие фармацевтически допустимые носители, разбавители и адъюванты (вспомогательные вещества) - для того, чтобы приготовить фармацевтические композиции, используемые при лечении патологических расстройств у млекопитающих. Фармацевтические композиции данного изобретения содержат активное соединение в сочетании с твердым или жидким фармацевтически допустимым нетоксичным носителем. Такие фармацевтические носители могут быть стерильными жидкостями, такими как вода и масла, включая масла нефтяного, животного, растительного или синтетического происхождения. Примерами подходящих жидкостей являются масло земляного ореха, масло соевых бобов, минеральное масло, кунжутовое масло и тому подобные. Вода является предпочтительным носителем в тех случаях, когда фармацевтическая композиция используется посредством внутривенного приема. Физиологические солевые растворы и водные растворы глицерина и декстрозы также могут использоваться в качестве жидких носителей, в частности для растворов, вводимых посредством инъекции. Подходящие фармацевтические наполнители включают крахмал, глюкозу, лактозу, сахарозу, желатин, солод, рис, муку, мел, силикагель, карбонат магния, стеарат натрия, моностеарат глицерина, тальк, хлористый натрий, высушенные молочные сливки, глицерин, пропиленгликоль, вода, этанол и тому подобное. Эти композиции могут иметь форму растворов, суспензий, таблеток, пилюль, капсул, порошков, форм, поддерживающих секрецию (выделение) и т.п. Подходящие фармацевтические носители описаны в работе E.W.Martin "Remington's Pharmaceutical Scinces". Фармацевтические композиции содержат эффективное терапевтическое количество активного соединения в сочетании с подходящим количеством носителя так, чтобы обеспечить соответствующую форму приема организму-носителю (болезни).

В заключение, антималярийные средства особенно полезны как антивиральные агенты при терапевтическом лечении людей. Они проявляют потенциальную антивиральную активность против вирусов AIDS, что является высоко необычным с точки зрения очень ограниченной и специфичной антивиральной активности, характерной для ранее существующих в данной области антивиральных агентов. Антималярийные средства выявляют значительное подавление HIV-мультипликаций и вирус-индуцированных клеточных повреждений в системах культур клеточных тканей животных и человека. Антималярийные средства могут снижать проявления летальности и заболеваемости у человека, включая снижение в распространении благоприятных инфекций, связанных с AIDS, а также снижение в нарастающих эффектах вырождения, обусловленных действием HIV на центральную нервную систему.

Изобретение относится к медицине, в частности к вирусологии, и касается предотвращения или ингибирования инфицирования Т-лимфоцитов HIV и репликации HIV in vivo. Для этого используют 4-аминохинолины в дозе 300-2000 мг в течение недели. Способ повышает качество профилактики и лечения HIV-инфицирования. 5 з.п. ф-лы.

1. Способ предотвращения или ингибирования инфицирования Т-лимфоцитов человеческим вирусом иммунодефицита (HIV) in vivo и репликации (HIV) in vivo, отличающийся тем, что вводят 4-аминохинолин в дозе 300 - 2000 мг в течение недели. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что 4-аминохинолином является хлорохин. 3. Способ по п.1, отличающийся тем, что 4-аминохинолином является хлорохин фосфат. 4. Способ по п.1, отличающийся тем, что 4-аминохинолином является хлорохин сульфат. 5. Способ по п.1, отличающийся тем, что 4-аминохинолином является амодиахин. 6. Способ по п.1, отличающийся тем, что 4-аминохинолином является гидроксихлорохин.