СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ АНАЛИЗИРУЕМОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ Российский патент 2000 года по МПК C12Q1/68 C07H21/04 

Область техники
Изобретение относится к молекулярной биологии и может быть использовано для диагностики генетических и других заболеваний, в основе которых лежат изменения в структуре нуклеиновых кислот, включая труднодиагностируемые точечные мутации, а также для выявления вирусных нуклеиновых кислот при диагностике вирусных заболеваний.

Уровень техники
Наиболее близким к предлагаемому является способ выявления анализируемых последовательностей нуклеиновых кислот, содержащих точечные мутации, с помощью комплементарного анализируемому участку ДНК олигонуклеотидного зонда, полученного легированием в комплементарном комплексе двух олигонуклеотидов (длиной 8 и 14 звеньев), один из которых несет ³²P-метку. При наличии мутации в сайте комплементарного связывания олигонуклеотидов выход легированного в несовершенном комплексе олигонуклеотидного зонда уменьшается по сравнению со случаем образования правильного комплекса. Максимальный фактор дискриминации точечной мутации (3-5) наблюдается в том случае, когда несовершенный комплекс, образованный двумя олигонуклеотидами и ДНК, имеет один мисматч в точке легирования (Dan Y.Wu and R.Bruce Wallace. Specificity of the nick-closing activity of bacteriophage T4 DNK ligase. Gene (1989) 245-254.

Недостатком этого способа является низкая селективность легирования в случае образования неправильных комплексов при наличии точечной мутации в ДНК. Различие в количестве легированного продукта в случае "правильной" и "неправильной" ДНК (фактор дискриминации) составляет 3-5 раз.

Раскрытие изобретения
Задачей изобретения является разработка способа высокоселективной (с высоким фактором) диагностики вирусных, генетических и других заболеваний, в основе которых лежат изменения в структуре нуклеиновых кислот, включая точечные мутации.

Поставленная задача достигается тем, что в качестве олигонуклеотидного зонда используют короткий олигонуклеотид, длиной 4-6 звеньев, который легируют с двух сторон с соответствующими анализируемой последовательности комплементарными олигонуклеотидами или их производными, содержащими полициклические ароматические группировки. При определении мутации последовательность короткого олигонуклеотида выбирают таким образом, что определяемая мутация находится в сайте его связывания.

Суть предлагаемого подхода состоит в том, что в качестве олигонуклеотидного зонда используют короткий олигонуклеотид (тетра-, пента-, гекса-), который легируется с двумя фланкирующими его с двух сторон короткими олигонуклеотидами (или их производными, несущими полициклические ароматические группировки) в случае образования полного правильного комплементарного комплекса с анализируемой последовательностью ДНК. Обычно в качестве олигонуклеотидных зондов как при выявлении чужеродных нуклеиновых кислот методом гибридизации, так и при определении точечных мутаций с использованием лигазы, используют протяженные олигонуклеотиды, образующие прочные комплементарные комплексы с анализируемыми последовательностями НК. Однако такие олигонуклеотиды способны образовывать достаточно прочные несовершенные комплексы с НК, что приводит к снижению селективности выявления анализируемых последовательностей НК.

Короткие олигонуклеотиды, особенно тетрануклеотиды, в физиологических условиях обладают крайне низкими гибридизационными свойствами. В предлагаемом способе короткий олигонуклеотидный зонд (тетра- гекса- мер) фланкирован с двух сторон олигонуклеотидами или их производными, несущими стабилизирующий комплекс группами, что способствует образованию комплементарного комплекса олигонуклеотидного зонда с анализируемой последовательностью. Комплекс короткого олигонуклеотидного зонда (тетра- гекса- мера) стабилизируется кооперативными взаимодействиями между концевыми нуклеотидными остатками при образовании правильных тандемных комплексов. В случае наличия мутации в сайте связывания короткого олигонуклеотидного зонда стабильность его комплекса существенно снижается, что и является причиной высокой селективности данного подхода. Дополнительным фактором, способствующим повышению селективности легирования предложенных тандемов олигонуклеотидных зондов, является способность фермента узнавать неправильные комплементарные участки длиной в 2-3 нуклеотидных звена от точки легирования, как это было продемонстрировано в работе Kazuo Harada and Leslie E.Orgel "Unexpective substrate specificity of T4 DNA ligase revaled by in vitro selection. Nucleic Acids Research, 1993, 21, 2287-2291 при легировании модельных олигонуклеотидов, способных формировать шпилечные структуры.

Способ экономичен, методически прост, работает в широком диапазоне температур и концентраций олигонуклеотидов. Фактор дискриминации последовательностей, содержащих мутации, превышает 100.

Исследование проводили на нуклеиновых кислотах, являющихся продуктами симметричной амплификации ДНК (P0 - правильная мишень, P1-P4 - мишени, содержащие все двенадцать возможных точечных замен в центральной четырехнуклеотидной области) (см. схему в конце описания).

pN_n-олигонуклеотид или его производное, несущее полициклическую ароматическую группировку, (n ≥ 6).

Варианты осуществления изобретения
Пример 1. P0, концентрация от 10^-8 до 10^-5 M, последовательность тетрануклеотидного зонда и пары олигонуклеотидов (или их производных, несущих полициклические ароматические группировки) полностью комплементарна участку ДНК, концентрация зонда и олигонуклеотидов от 10^-8 до 10^-5 М. Зонд содержит ³²P-метку или олигонуклеотид II содержит остаток флюоресцеина. Реакцию легирования проводили в лигазном буфере в 15 мл при T = 20, 25, 37^oC в течение 15-30 мин. Анализ продуктов легирования проводили электрофорезом в 20% полиакриламидном геле в денатурирующих условиях.

Выход легированного продукта, по данным электрофореза, составлял 30- 40%.

Пример 1а. Эксперименты проводили, как описано в примере 1. В качестве олигонуклеотидного зонда использовали тетрануклеотид, который легировали с парой производных олигонуклеотидов, несущих группировки на основе феназина.

Выход легированного продукта, по данным электрофореза, составлял 35-40%.

Пример 2. Эксперименты проводили, как описано в примере 1. В качестве короткого олигонуклеотидного зонда использовали гексануклеотид. Выход легированного продукта составлял 50-60%.

Пример 3. Эксперименты проводили, как описано в примере 1. В качестве олигонуклеотидного зонда использовали додекануклеотид, который легировали с октануклеотидом (использовали олигонуклеотиды, близкие по длине к описанным в прототипе).

Выход легированного продукта составлял 60-70%.

Пример 4. Эксперименты проводили, как описано в примере 1. В качестве олигонуклеотидного зонда использовали тетрануклеотид, который легировали с одним октануклеотидом.

Выход легированного продукта составлял 0%.

Пример 5. P1 (X = A), концентрация от 10^-8 до 10^-5 M, комплементарный комплекс - P1 + олигонуклеотид 1 + тетрануклеотидный зонд + олигонуклеотид II (или производные олигонуклеотидов, несущие полициклические ароматические группировки). Концентрация зонда и олигонуклеотидов от 10^-8 до 10^-5 М. Зонд содержит ³²P-метку или олигонуклеотид II содержит остаток флюоресцеина. Реакцию легирования проводили в лигазном буфере в 15 мл при T = 20, 25, 37^oC в течение 15-30 мин. Анализ продуктов легирования проводили электрофорезом в 20% полиакриламидном геле в денатурирующих условиях.

Выход легированного продукта, по данным электрофореза, составлял 0%.

Пример 6. P1 (X = T), концентрация от 10^-8 до 10^-5 М, комплементарный комплекс - P1 + олигонуклеотид 1 + тетрануклеотидный зонд + олигонуклеотид II (или производные олигонуклеотидов, несущие полициклические ароматические группировки). Эксперименты проводили, как описано в примере 5.

Выход легированного продукта, по данным электрофореза, составлял 0%.

Пример 7. P1 (X = C), концентрация от 10^-8 до 10^-5 М, комплементарный комплекс - P1 + олигонуклеотид 1 + тетрануклеотидный зонд + олигонуклеотид II (или производные олигонуклеотидов, несущие полициклические ароматические группировки). Эксперименты проводили, как описано в примере 5.

Выход легированного продукта, по данным электрофореза, составлял 0%.

Пример 8. P1 (X = A), концентрация от 10^-8 до 10^-5 М, комплементарный комплекс - P1 + олигонуклеотид 1 + гексануклеотидный зонд + олигонуклеотид II (или производные олигонуклеотидов, несущие полициклические ароматические группировки). Эксперименты проводили, как описано в примере 5.

Выход легированного продукта составлял 5-7%.

Пример 9. P1 (X = A), концентрация от 10^-8 до 10^-5 М, комплементарный комплекс - P1 + додекануклеотид + октануклеотид (использовали олигонуклеотиды, близкие по длине к описанным в прототипе). Эксперименты проводили, как описано в примере 5 (X = A).

Выход легированного продукта составлял 30-40%.

Пример 10. P2 (X = A), концентрация от 10^-8 до 10^-5 М, комплементарный комплекс - P2 + олигонуклеотид 1 + тетрануклеотидный зонд + олигонуклеотид II (или производные олигонуклеотидов, несущие полициклические ароматические группировки). Концентрация зонда и олигонуклеотидов от 10^-8 до 10^-5 M. Зонд содержит ³²P-метку или олигонуклеотид II содержит остаток флюоресцеина. Реакцию легирования проводили в лигазном буфере в 15 мл при T = 20, 25, 37^oC в течение 15-30 мин. Анализ продуктов легирования проводили электрофорезом в 20% полиакриламидном геле в денатурирующих условиях.

Выход легированного продукта, по данным электрофореза, составлял 0%.

Пример 11. P2 (X = T), концентрация от 10^-8 до 10^-5 М, комплементарный комплекс - P2 + олигонуклеотид 1 + тетрануклеотидный зонд + олигонуклеотид III (или производные олигонуклеотидов, несущие полициклические ароматические группировки). Эксперименты проводили, как описано в примере 10.

Выход легированного продукта, по данным электрофореза, составлял 0%.

Пример 12. P2 (X = G), концентрация от 10^-8 до 10^-5 М, комплементарный комплекс - P2 + олигонуклеотид 1 + тетрануклеотидный зонд + олигонуклеотид II (или производные олигонуклеотидов, несущие полициклические ароматические группировки). Эксперименты проводили, как описано в примере 10.

Выход легированного продукта, по данным электрофореза, составлял 0%.

Пример 13. P3 (X = A), концентрация от 10^-8 до 10^-5 М, комплементарный комплекс - P3 + олигонуклеотид 1 + тетрануклеотидный зонд + олигонуклеотид II (или производные олигонуклеотидов, несущие полициклические ароматические группировки). Концентрация зонда и олигонуклеотидов от 10^-8 до 10^-5 М. Зонд содержит ³²P или олигонуклеотид II содержит остаток флюоресцеина. Реакцию легирования проводили в лигазном буфере в 15 мл при T = 20, 25, 37^oC в течение 15-30 мин. Анализ продуктов легирования проводили электрофорезом в 20% полиакриламидном геле в денатурирующих условиях.

Выход легированного продукта, по данным электрофореза, составлял 0%.

Пример 14. P3 (X = C), концентрация от 10^-8 до 10^-5 М, комплементарный комплекс - P3 + олигонуклеотид 1 + тетрануклеотидный зонд + олигонуклеотид II (или производные олигонуклеотидов, несущие полициклические ароматические группировки). Эксперименты проводили, как описано в примере 13.

Выход легированного продукта, по данным электрофореза составлял 0%.

Пример 15. P3 (X = G), концентрация от 10^-8 до 10^-5 М, комплементарный комплекс - P3 + олигонуклеотид 1 + тетрануклеотидный зонд + олигонуклеотид II (или производные олигонуклеотидов, несущие полициклические ароматические группировки). Эксперименты проводили, как описано в примере 13.

Выход легированного продукта, по данным электрофореза, составлял 0%.

Пример 16. P4 (X = A), концентрация от 10^-8 до 10^-5 М, комплементарный комплекс - P4 + олигонуклеотид 1 + тетрануклеотидный зонд + олигонуклеотид II. Концентрация зонда и олигонуклеотидов от 10^-8 до 10^-5 М. Зонд содержит ³²P или олигонуклеотид II содержит остаток флюоресцеина. Реакцию легирования проводили в лигазном буфере в 15 мл при T = 20, 25, 37^oC в течение 15-30 мин. Анализ продуктов легирования проводили электрофорезом в 20% полиакриламидном геле в денатурирующих условиях.

Выход легированного продукта, по данным электрофореза, составлял 0%.

Пример 17. P4 (X = T), концентрация от 10^-8 до 10^-5 М, комплементарный комплекс - P4 + олигонуклеотид 1 + тетрануклеотидный зонд + олигонуклеотид II (или производные олигонуклеотидов, несущие полициклические ароматические группировки). Эксперименты проводили, как описано в примере 16.

Выход легированного продукта, по данным электрофореза, составлял 0%.

Пример 18. P4 (X = C), концентрация от 10^-8 до 10^-5 М, комплементарный комплекс - P4 + олигонуклеотид 1 + тетрануклеотидный зонд + олигонуклеотид II (или производные олигонуклеотидов, несущие полициклические ароматические группировки). Эксперименты проводили, как описано в примере 16.

Выход легированного продукта, по данным электрофореза, составлял 0%.

Эффективность метода выявления точечных мутаций в последовательностях нуклеиновых кислот определяют по фактору дискриминации, который рассчитывают как отношение выхода легированного продукта в случае полной комплементации с последовательностью, не содержащей точечную мутацию, к выходу легированного продукта в случае последовательности, содержащей точечную мутацию. Чем выше фактор дискриминации, тем эффективнее метод выявления мутации, тем точнее определение последовательности НК.

Как видно из приведенных в таблице данных, использование короткого тетрануклеотидного зонда дает наиболее высокий фактор дискриминации, во много раз превышающий фактор дискриминации, полученный в прототипе или в условиях, описанных в прототипе. Это обеспечивает надежность выявления заранее заданных последовательностей в нуклеиновых кислотах, в том числе содержащих точечные мутации.

Изобретение относится к молекулярной биологии и может быть использовано для диагностики генетических заболеваний. Проводят гибридизацию короткого олигонуклеотидного зонда длиной 4-6 звеньев с фланкирующими олигонуклеотидными последовательностями или их производными, несущими полициклические ароматические группировки с комплементарной ему анализируемой последовательностью нуклеиновых кислот. Последовательность может содержать точечные мутации. Определяемая мутация должна находиться в сайте связывания зонда. Изобретение позволяет проводить высокоселективную диагностику заболеваний, в основе которых лежат изменения в структуре нуклеиновых кислот. 2 з.п.ф-лы, 1 табл.

1. Способ выявления анализируемой последовательности нуклеиновых кислот, включающий гибридизацию комплементарной анализируемой последовательности олигонуклеотидного зонда, несущего репортерную группу, отличающийся тем, что детекция любой последовательности осуществляется по факту лигирования короткого олигонуклеотида (длиной 4 - 6 звеньев) с фланкирующими олигонуклеотидными последовательностями или их производными, несущими полициклические ароматические группировки. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что выявляют последовательности нуклеиновых кислот, включающие точечные мутации. 3. Способ по пп. 1 и 2, отличающийся тем, что при определении мутации последовательность короткого олигонуклеотида выбирают таким образом, что определяемая мутация находится в сайте его связывания.