СПОСОБ ИНДИКАЦИИ БАКТЕРИАЛЬНЫХ АНТИГЕНОВ Российский патент 1998 года по МПК G01N33/569 G01N33/544 G01N33/545 C12Q1/04 

Изобретение относится к области иммунологии и может быть использовано для экспрессной индикации бактериальных средств при возникновении очага бактериального заражения.

Изобретением решается задача сокращения времени анализа и повышения точности индикации бактериальных антигенов в исследуемых материалах, которыми могут быть смывы с поверхности верхнего слоя почвы, растительности и т.д. а также материалы от больных или умерших людей или животных.

Известен способ постановки реакции пассивной гемаглютинации при индикации бактериальных средств, который включает титрование исследуемого материала в разводящей жидкости, внесение эритроцитарных диагностикумов и наблюдение за формированием эритроцитами диагностикумов на днищах емкостей типичной картины окончания реакции (Инструкция по применению серологических методов диагностики при эпизоотологическом обследовании природных очагов чумы. Саратов, 1974, с. 38 39).

Недостатком этого способа является затрачивание большого количества времени (2 4 ч) на формирование типичной картины окончания реакции.

Известен способ ускорения реакции агглютинации путем центрифугирования в течение 2 3 мин при частоте вращения 2000 об/мин и центробежном ускорении 1000 (Лабораторная иммунология, М. Медицина, 1967, с. 77). Положительный эффект способа основан на визуальном выявлении комплексов антиген-антитело, которые способны образоваться в течение нескольких минут ( Михайлов И.Ф. Дьяков С.И. В кн. Люминесцентная микроскопия. М. Медгиз, 1961, с.162). Масса этих комплексов незначительна по сравнению с более объемными комплексами антиген-антитело-эритроцит, и они легко удерживаются на поверхности днищ лунок, пробирок.

При использовании параметров этого способа при постановке реакции пассивной гемаглютинации не происходит формирования типичной картины окончания реакции за счет разрушения комплексов антиген-антитело-эритроцит. Кроме того, сами эритроцитарные диагностикумы обладают недостаточной стабильностью при длительном хранении, собственной антигенностью, нестандартностью физико-химический свойств, что снижает точность индикации бактериальных средств.

В последнее время в стране и за рубежом активно разрабатывают полимерные микрочастицы с заданными физико-химическими свойствами, на основе которых конструируются диагностические препараты.

Например, испытания лиофилизированного полимерного иммуноглобулинового диагностикума при обнаружении и идентификации возбудителя туляремии в объемных реакциях агломерации (РАО) по типу реакции непрямой гемаглютинации (РНГА) показали соответствующие медикобиологическим требованиям результаты по активности, специфичности и чувствительности препарата.

Реакция демонстративна, стабильна, легко учитывается за счет яркой окраски препарата. (Современные аспекты природной очаговости, эпидемиологии и профилактики особо опасных инфекционных болезней. Тезисы докладов научной конференции. Омск, октябрь 1993 г. Ставрополь, 1993, с. 214 215).

Однако учет результатов реакции осуществляется через 1,5 2,0 ч, что не обеспечивает экспрессность метода.

Наиболее близким по технической сущности к заявляемому изобретению является выбранный в качестве прототипа способ диагностики возбудителя чумы по обнаружению капсульного антигена в реакции агглютинации латексного антительного диагностикума (Рудник М.П. Гриднева Л.Г. Экспресс-диагностика возбудителя чумы с использованием реакции агглютинации латекса. Проблемы природно-очаговых и зоонозных инфекций в Сибири и на Дальнем Востоке. Тезисы докладов к региональной научно-практической конференции 16-17 сентября 1993 г. Чита, 1993, с. 134 135/.

Этот способ включает постановку двух отдельных серологических реакций, проводимых объемным и капельным методами и осуществляется следующим образом.

Серодиагностику капсульного антигена проводили путем постановки реакции агглютинации латекса, осуществляемой по типу РНГА объемным методом в лунках планшета для иммунологических реакций с микробными взвесями возбудителя чумы или с раствором антигена, с использованием диагностикума чумного иммуноглобулинового полиакролеинового. Учет результатов реакции проводили через 1,5 2 ч по формированию типичной картины окончания реакции ("зонтики", "пуговки").

Экспресс-диагностику проводили путем постановки реакции агглютинации диагностикума чумного иммуноглобулинового полиакролеинового капельным методом на стекле, осуществляя учет результатов реакции через 4 15 мин по видимым, хорошо сформированным агглютинатам с полным просветлением жидкости.

У прототипа и заявляемого способа имеются следующие сходные существенные признаки.

Проведение реакции агглютинации внесением иммуноглобулинового полиакролеинового диагностикума в исследуемый материал с последующим учетом результатов реакции.

Недостатком прототипа является недостаточная точность экспресс-диагностики. Учет результатов реакции, выполняемой капельным методом на стекле, возможен только в течение 4 15 мин с момента ее постановки, поскольку через 30 мин появляется спонтанные агглютинаты в отрицательных контролях. Кроме того, постановка серологической реакции капельным методом на стекле сопряжена с необходимостью отдельного проведения раститровки исследуемого материала, с возможностью растекания капель на поверхности стекла и смешиванию с соседними каплями, что приводит к нестандартным условиям образования и учета комплексов. Учет более точных результатов объемной реакции возможен через 1,5 2 ч, что не обеспечивает экспрессность метода.

Целью изобретения является обеспечение экспрессной индикации бактериальных средств с требуемой точностью результатов реакции за счет ускорения процесса формирования типичной картины окончания реакции.

При этом результаты реакции непрямой суспензионной агглютинации (далее РНСА) отмечаются знаками (+). Точность результатов характеризуется наибольшим разведением исследуемого материала, сопровождающегося снижением концентрации антигена, при котором оценивали результат реакции на +++ или ++++. Разведение выражается через цифру 2 в отрицательной степени, например 2^-3, что означает разведение исходного материала до титра 1/8, при этом символ +++ соответствует образованию "зонтика", занимающего не менее 2/3 площади днища лунки.

Поставленная цель достигается тем, что способ индикации бактериальных антигенов в реакции агглютинации включает внесение иммуноглобулинового полиакролеинового диагностикума в исследуемую жидкость и центрифугирование смеси при 7 9g в течение 20 30 мин.

По отношению к прототипу у заявляемого способа имеются следующие отличительные признаки.

Центрифугирование смеси иммуноглобулинового полиакролеинового диагностикума и исследуемого материала при 7 9g в течение 20 -30 мин, что позволяет в продолжение заявленного времени сформировать типичную картину окончания реакции для учета ее результатов с требуемой точностью определения.

Необходимость контроля процесса центрифугирования показателями ускорения вызвана тем, что число оборотов ротора учитывается очень неточно, так как допускаемые отклонения значений частоты вращения у большинства электродвигателей составляет ±10% Партнеры центробежного ускорения являются функцией значений угловой скорости и радиуса вращения, которые при точной стабилизации оборотов ротора могут быть точно рассчитаны по формуле:
ω = (2πγ)²R
где ω центробежное ускорение;
g угловая скорость;
R радиус вращения.

(Савельев И.В. Курс общей физики, ч. 1, М. Наука, 1973, с.41).

Формирование типичной картины агглютинации под действием центрифугирования основано на способности иммуноглобулинового полиакролеинового диагностикума (носителя) под действием силы центробежного ускорения опускаться к поверхности днищ лунок, что происходит за счет различий в плотности носителей и жидкой среды, в которой он находится. При этом носители, принявшие участие в образовании комплексов антиген-антитело-носитель, приобретают новые свойства в гравитационном поле, которые позволяют им с определенной скоростью опускаться и удерживаться на наклонной поверхности вогнутых днищ ячеек. Специфические силы взаимодействия антигенов и антител в сумме противодействует скатывающей силе и несколько ее превосходят, т.е. силы специфического взаимодействия обладают запасом прочности, в результате чего дозированные в определенных границах перегрузки не приводят к разрушению комплексов антиген-антитело-носитель и нарушению картины окончания реакции. Кроме того, в первую очередь проявляется взаимодействие более "тяжелых" комплексов, у которых выше плотность эритроцитов.

На чертеже показана зависимость времени седиментации комплексов в РНСА от величины прикладываемого центробежного ускорения при различных критериях оценки (кривая 1 +++, кривая 2 ++++).

Возможность осуществления заявляемого способа с использованием полной совокупности заявляемых признаков подтверждается примерами конкретного выполнения.

Пример 1. Исследуемый материал смыв с поверхности, зараженный клетками вакцинного штамма Y. pestis EV, обеззараживали 2% формалином. В U-образные лунки (вместимостью 2 мл каждая) планшета для иммунологических реакций (далее планшет) вносили по 0,4 мл рабочего раствора белкового стабилизатора (далее белковый стабилизатор). В начальную лунку титратором вносили 0,4 мл смыва с поверхности и титровали в пяти лунках. В каждую лунку с раститрованным смывом с поверхности вносили по 0,05 мл 0,1 0,2% взвеси иммуноглобулинового полиакролеинового диагностикума. Для контроля диагностикума в одну лунку с 0,4 мл белкового стабилизатора вносили 0,05 мл 0,1 0,2% взвеси последнего. Содержимое лунок дополнительно суспендировали путем легких встряхиваний планшета. Планшет центрофугировали с ускорением 7g в течение 30 мин. Учет РНСА производили через 30 мин. При учете в первых двух лунках отметили положительный результат с оценкой на (++++). Положительный результат в третьей лунке с оценкой (+++) соответствовал концентрации микробных клеток в ней 125 тыс. мк/мл. При этом полиакролеиновые частицы диагностикума равномерно покрывали более 2/3 площади поверхности днища лунки. При центрифугировании с ускорением 7g менее 20 мин положительный эффект не отмечали.

Для контроля предлагаемого способа с указанным параметром центробежного ускорения 7g поставили РНСА с вышеуказанным исследуемым материалом. В U-образные лунки планшета вносили по 0,4 мл раствора блокового стабилизатора. В начальную лунку титратором вносили 0,4 мл смыва с поверхности и титровали в 5 лунках. В каждую лунку с ратитрованным смывом с поверхности вносили по 0,05 мл 0,1 0,2% диагностикума. Для контроля диагностикума его 0,1 0,2% взвесь в объеме 0,05 мл вносили в лунку с 0,4 мл белкового стабилизатора. Содержимое лунок дополнительно суспендировали путем легких встряхиваний планшета. Учет РНСА производили через 3 ч. При учете в первых двух лунках отметили положительный результат с оценкой на (+++). При этом полиакролеиновые частицы диагностикума равномерно покрывали более 2/3 площади поверхности днища лунки. Положительный результат во второй лунке с оценкой (+++) соответствовал концентрации микробных клеток в ней 250 тыс. мк/мл.

Таким образом результаты эксперимента демонстрируют повышение точности индикации в 2 раза (обнаружили 125 тыс. мк/мл), при сокращении сроков учета РНСА с 3 ч до 30 мин.

Пример 2. Выполнялся аналогично примеру 1, за исключением того, что планшет центрифугировали с ускорением 8g в течение 25 мин, при этом повышение точности индикации в 2 раза (обнаружили 125 тыс. мк/мл) при сокращении сроков учета с 3 ч до 25 мин.

Пример 3. Выполнялся аналогично примеру 1, за исключением того, что планшет центрифугировали с ускорением 9g в течение 20 мин, при этом точность индикации повысилась в 4 раза (обнаружили 62 тыс. мк/мл) при сокращении сроков учета РНСА до 20 мин.

В таблице приведены результаты экспериментов на различных исследуемых материалах в зависимости от параметров процесса с использованием в качестве носителя полиакролеиновых иммуноглобулиновых диагностикумов.

Как показали результаты экспериментов, при уменьшении значений центробежного ускорения и времени центрифугирования ниже заявленных пределов не успевает произойти формирование типичной картины окончания реакции.

Увеличение же центробежного ускорения и времени центрифугирования выше заявляемых пределов приводит к разрушению комплексов антиген-антитело-носитель и искажению процесса образования типичной картины окончания реакции.

Таким образом, изобретение реально осуществимо, и его использование обеспечит возможность организации экспрессной индикации бактериальных средств при возникновении очагов бактериального заражения.

Использование: микробиология, иммунология, экспрессная индикация бактериальных средств, очаг бактериального заражения. Сущность изобретения: для сокращения времени анализа и повышения точности индикации бактериальных антигенов в реакции агглютинации вносят иммуноглобулиновый полиакролеиновый диагностикум в исследуемый материал и центрифугируют смесь при 7 - 9g в течение 20 - 30 мин. Это позволяет сформулировать типичную картину окончания реакции для учета ее результатов с требуемой точностью определения. 1 табл., 1 ил.

Способ индикации бактериальных антигенов в реакции агглютинации, включающий внесение иммуноглобулинового полиакролеинового диагностикума в исследуемый материал, отличающийся тем, что после внесения диагностикума смесь центрифугируют при 7 9 g в течение 20 30 мин.