Способ определения концентрации живых микроорганизмов Советский патент 1987 года по МПК C12N1/00 C12Q1/06 

Изобретение относится к микробиологии, а именно к анализу деионизо- ванной воды на содержание микроорганизмов, и может быть использовано в электронной промыишенности.

Цель изобретения является повышение точности определения концентрации микроорганизмов в денонизованной воде .

Способ определения концентрации живых микроорганизмов заключается в определении разности между общим числом клеток и числом мертвых клеток, основанном на селективном окрашивании мертвых клеток флуоресцирующим красителем, предусматривающим добавление к исследуемой суспензии клеток красителя, образующего с внутриклеточными компонентами флуоресцирующий комплекс, не способный проникать че- рез неповрежденную клеточную мембрану, подсчете флуоресцирующих частиц, причем после указанного подсчета к суспензии клеток добавляют органический растворитель, нарушающий барьерные свойства мембраны клеток по отношению к флуоресцентному красителю и вновь подсчитывают число флуоресцирующих частиц. Прирост их числа к результате добавления орга- нического растворителя принимают за число жизнеспособных микроорганизмов

Способ основан на том, что люминесцентный краситель не проникает в живую клетку из-за барьерных свойств клеточной мембраны. При добавлении красителя к суспензии клеток он окрашивает только мертвые клетки, число которых подсчитывают в качестве фона Затем к суспензии добавляют органический растворитель, делающий мембрану проницаемой для красителя, при этом дополнительно окрашиваются живы клетки, а затем подсчитывают общее число живых и мертвых. Вычитая из втрого результата первый, определяют число живых микроорганизмов.

Таким образом, при подсчете опре- целяется фон: число мертвых микроорганизмов и частиц, обладающих по какой-либо причине собственной характерной люминесценцией. При втором подсчете к ним добавляется число жи- 8ых микроорганизмов, прокрасившихся благодаря добавлению вещества, действующего, на мембрану. Вычитая первы счет из второго, вычитают фон. Это

5

5 0 0

5 0 5

0 5

обстоятельство повышает чувствительность и -точность способа.

Известно 1, что мембраны живых клеток непроницаемы для большинства цитологических красителей. Поэтому в большинстве цитологических методик окрашиванию предшествует операция фиксации, заключающаяся в обработке клеток кислотами и спиртами. Такая обработка разрушает мембрану и краситель окрашивает внутриклеточные компоненты. Фиксацию для рассматриваемой цели проводить нецелесообразно, так как, кроме того, что добавляется ряд операций, все клетки фиксации оказываются мертвыми и вопрос об определении живых не стоит. Окрасить клетки можно и непосредственно в анализируемом растворе, сделав мембрану проницаемой для красителя. Такой способ и вещества известны в лабораторной практике: для сохранения растворов от зарастания к ним обь1ч- но добавляют каплю толуола или хлороформа, микроорганизмы при этом погибают именно из-за повреждения данными растворителями мембран.

Для окрашивания клеток испытали указанные вещества. Окрашивание происходит, однако следы толуола и хлороформа вызывают значительное тушение люминесценции,, для ликвидации которого пробу нужно дополнительно нагреть, чтобы испарить эти вещества. Поэтому хотя применение толуола и хлороформа для окраи ивания возможно, но неудобно. Бензол не вызывает тушения люминесценции, поэтому он удобней. Сделать мембрану проницаемой для красителя можно, добавив к пробе примерно 10 М этилендиамин-тетраадетата (ЭДТА), который связывает ионы кальция и магния и тем самым разрушает структуру мембранных белков.

Пример 1. Пробы деионизован- ной воды объемом 100 мл отбирают в разных точках технологических установок: пробы 1-3 после фильтров онкой очистки, проба 4 до фильтра, п{жчем после промывки установки 3%-ной перекисью водорода с целью стерили;;ации. К каждой пробе добавляют по 0,1 мл водного раствора этидиум бромида (0,2 мг/мл). Каждую пробу разделяют пополам, к вторым половин ам добавляют по 1-2 капли бензола, тщательно встряхивают и оставляют обе половины стоять 1 ч. Пробы фильтруют через мем3130

бранные фильтры для люминесцентной микроскопии. Сканируя фильтр под люминесцентным микроскопом в красной области, подсчитывают число флуоресцирующих частиц. Каждую частицу иденти- фицируют визуально по морфологическим признакам, при необходимости переходя на большее увеличение. Концентрацию частиц подсчитывают по формуле

N ird 1

г 4 В„ -V

где N - подсчитанное число частиц;

Ё 100 мм - длинс. сканирования 1,6 мм (об.хЮ) - диаметр поля зрения объектива;

d 17 мм - диаметр зоны фильтрации на фильтре;

V 50 мл - объем пробы.

08

После подстановки указанных значений формула для определения концентрации приобретает вид

С 0,028N,

Поскольку источником погрешности определения является малость числа N и то, что измерение проводят один раз, само число определяют со средней квадратичной погрешностью , Поэтому погрешность определения концентрации микроорганизмов следующая:

С|. tO,,,

.с,-с,

- г 1 - -1 г В таблице даны примеры подсчета по видам микроорганизмов, их концентрации в первой (С,) и второй пробах (С,) и концентрации живых микро- огранизмов (,).

Зависимость, представленная в фор,

муле определения концентрации флуо-

ресцирующих частиц ,выведена впервые, носит частный характер - подсчет частиц на фильтре под микроскопом - и касается конкретного примера осуществления предлагаемого способа, кроме того, она очевидна.

а)концентрация частиц

,

V

где Q - число частиц; V - объем пробы.

б).. -,

где п - плотность расположения тиц на фильтре;

- площадь фильтрации;

d - диаметр зоны фильтрации.

Таким образом,

N

в)

.

где N - число сосчитанных частиц; S - площадь сканирования.

N 7d2 1 Таким образом,.

.D,S,

где С - длина сканирования;

Dp- - диаметр поля зрения объектива.

N 7d2 1 Таким образом ;--- -.

оъ Для сравнения чувствительности

и точности прототипа и предлагаемого способа рассматривают анализ деиони- зованной воды, загрязнения в которой установлены другими независимыми способами .

Деионизованная вода высшей очистки марки А содержит, :

Частицы (сч) 0,5 мкм До 300

Живые микроорганизмы

(Ж м/о)Примерно 1

Мертвые микроорганизмы

(М м/о)Примерно Г

Флуоресцирующие частицы (фч)0,5

Определение по известному способу.

1-й подсчет Ж м/о+М м/о + .

Ц-й подсчет М м/о+фч 1+0,5 1,5 .

1-11 302-1 ,5 2гЗОО ,

т.е. для принятых условий погрешность определения составляет

(300-)|00 1

Определение по предлагаемому способу .

1-й подсчет М м/о+фч 1+0,5 1,5 мл- .

30000%.11-подсчет Ж м/о+М м/о+фч 2,5

мл

,5-1, мл .

Этот анализ сделан без учета статистических погрешностей. Реальные погрешности для определений по предлагаемому способу приведены в таблице .

Формула изобретения

1. Способ определения концентрации живых микроорганизмов, предусматривающий добавление к суспензии микроорганизмов красителя, образующего с внутриклеточными компонентами флуоресцирующий комплекс, не способный промембрану, подсчет окрашенных частиц, отличающийся тем, что, с целью повышения точности определения микроорганизмов в деиониэованной воде, после подсчета окрашенных частиц к.суспензии клеток добавляют органический растворитель, вновь подсчи- зол или толуол, или хлороформ.

4

20

ющие

8

32

30

9

ющие

39

1

15

35

ющие

10

61

20

186

635

центрацию живых микроорганизмов определяют по разности между вторым и первым подсчетами.

2. Спо.соб по п. 1,отличаю- щ и и с я тем, что в качестве органического растворителя используют бен

70 9

10 .2 99 4 6 120 12

1

.2133 3

20

70 0.0

6

.2 99

26

170

686

0.06 0.2 2.0 0.3

0.3

2.8±0.3 1.9+0.4

0.1

0.2

3.4

0.3

0,03

3,. 7±0.3 2.6±0.4

О,.08

0„6

2.0

0.0

0.2

2.8±0.3 1.1+0.4

Кокки140

Флуоресцирующие

частицы Всего:

54 1035

Редактор М.Бандура

Составитель Л.Борисова

Техред А.Кравчук Корректор М.Демчик

Заказ 1497/23 Тираж 500Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР

по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г.Ужгород, ул.Проектная, 4

161

48 2±0.9 1091

3t0.9 111.3

Изобретение относится к микробиологии, а именно к анализу деионизованной воды на содержание микроорганизмов, и может быть использовано в электронной промышленности. Целью изобретения является повышение точности определения концентрации микроорганизмов. Способ основан на том, что люминесцентный краситель не проникает в живую клетку из-за барьерных свойств клеточной мембраны. При добавлении красителя к суспензии клеток он окрашивает только мертвые клетки, число которых подсчитывают в качестве фона. Затем к суспензии добав-- ляют органический растворитель, делающий мембрану проницаемой для красителя, при этом дополнительно окрашиваются живые клетки, а затем подсчитывают общее число живых и мертвых клеток. Вычитая из второго результата первый, определяют число живых микроорганизмов. 1 з.п. ф-лы, 1 табл. (Л 00 о (35 (Х