ках Silufol (ЧССР). Для хроматографии аналога энкефалина используют стеклянные пластинки с закрепленным слоем силикагеля Silika Gel 60 F-254 фирмы Merck (ФРГ) в следу о- щих системах: хлороформ - этанол - уксусная кислота (АсОН), 85;10г5 (А); н-бутанол-пиридин-АсОН-Н 0 30г 20:4:6 (Д), Удельное оптическое вращение пептидов измеряют на поляриметре Perkin-Elmer 141М (ФРГ). Кислотный гидролиз проводят при 20 с в течение 24 ч о Аминокислотный состав определяют на анализаторе , Для всех соединений данные элементного анализа удовлетворительно совпадгшт с вычисленным содержанием С, И, N,
Пример, К-трет-Бутилоксирсар- бонил-глицил-фенилаланин (7).
6j6 г (40 ммоль) L-фешшаланина растворяют в 40 мл J н, раствора гидроокиси натрия, добавляют г бикарбоната натрия 50 мл диметял- формамида (ДМФА) и 16,94 i (40 ммоль) пентахлорфенилового эфира трет-бутил оксикарбонил-глицина5 растворенного в 20 мл ДМФАв Смесь перемешивают в течение нескольких часов. После завершения реакции (хроматографический контроль)- реакционную массу разбавляют этилацетатом и водой (до разделения слоев) 5 охлаясдают до 0°С и подкисляют 0,5 Не соляной кислотой до рН 3, Этилацетатный слой отделяют, водн: ю фазу экстрагир тот повторно о Объединенный этилацетатньш про- мьшают водой, насьщенным раствором хлористого натрия и сушат над безводным сульфатом натрия. Кристаллический осадок, полученный после отгонки растворителя, перекристаллизовьшагот из этйлацетата с небольшой добавкой петролейного зфирао Выход дипептида (7) 11,4 г (88%)5 т.пл. 133-135°С; ,7° (с„ 1, ДМФА), R 0,73 (А), 0,80 (Д). ,
N -трет-бутилоксикарбониЛд N - бензилоксикарбон1 л Б-орнит| Шглицил- фешшаланин (9), 10,9 г ( ммоль) дипептида (7) растворяют в 50 мл 70%-ного раствора трифторуксуской кис лоты (TFA) в дихлорметане и выдерзкива ют 30 мин. Растворитель отгоняют, остаток растирают с эфиром, отфильт- ровьшаюТ; промывают эфиром на фильтре и сушат в вакууме над гидроокисью калия а Получают 10,4 г ( )трифтор- ацетата дипептида (8), Rj. (Д)
5,2 г (15,р5 ммоль) трифторацетата
(8)растворяют в 50 мл ДМФА, охлаждают до и„при охлаждении добавляют
2,65 мл (1555 ммоль) диизопропилзтшт- амина в 5 мл ДМФА и 8,2 г (15,5 ммоль) пентафторфенилового эфира М -трет- бутилоксикарбонил, N бензилоксик9р- бонил-В-орнитинаJ растворенного в
15 МП даФА. Реакционную массу перемешивают несколько часов и после завершения реакции обрабатывают аналогично соединению 7, Продукт получен- ньш после отгонки растворителя, очищают на колонке с силг-жагелем фирмы Merck. Элюирование проводят в системе хлороформ . - этанол - этилаце- тат-АсОН-Н О 285:5:8:2:0,25, Соответствующие фракции собирают, упаривают и суиат в вакууме. Получают г (67%) масла защищенного трипептида
(9)с R 0,65 (А), 0,72 (В).
N.0-ди-трет-бутилоксикарбонил-тиЯрозил-N -бензилоксшсарбонил-В-орни-,
тил-глицил-фенилаланин (11),
20,0 г (35 ммоль) трипептида (9) растворяют в 100 мл 50%-ного раствора TFA в дихлорметане и вьщерживают в течение 20 мин. Растворитель отгоняют остаток растирают с эфиром. Образовавшийся осадок отфильтровьшают, вновь промывают эфиром и высзгазива- ют в тзакууме над гидроокисью калия. Получают 19,2 г (94%) трифторацетата
трипептида (10) J R. 0,62 (Д) .
IBjl г (31 ммоль) трифторацетата трипептида (0) растворяют в 100 мл ,ЦМФА охлаждают до О С, добавляют при перемешивании 5|,3 мл (31 ммоль)
диизопропилэтиламина в 10 мл ДМФА и 16.,6 г .(31 ммоль) пентафторфенипово- го эфира N,0-ди-Boc-L-тиpoзинa. Реакционную массу перемешивают 1, (хроматографический контроль) и после завершения реакции обрабатывают аналогично соединению 7. Продуктj полученный после отгонки этйлацетата j. размешивают с эфиром и охлаждаютв Выпавший осадок отфильтровывают, промывают эфиром и сушат в эксикаторе Выход-16,0 г (63%) загцищениого тетра- пептида (П); R 0,75 (А); (В,
Merck); Из -b (с. 1, .ЦМФА),
Н,.0-ди т рет-бутилоксикарбонил-тирозил-N (1ч бензшюксикарбониласпа рагинш1)-В-орнитил-глицш1-фенилала- нип (13) с, К 18 г (22 ммоль) защищенного тетрапептида (И) в 150 мл
метанола, 15 мл АсОН и 20 мл Н,0 до- .бавляют палладиевую чернь и гидри- pjTOT в течение нескольких часов. Кя- тализатор отфильтровывают, фильтрат упаривают. Остаток растирают с эфиром и фильтр пот, затем дважды пере- осаж,цают из спирта эфиром, вновь про- мьгоают эфиром и сушат в вакууме над гидроокисьЕо калия. Получают 3,8 г (91%) тетрапептида 12)j R, 0,15 (А) 0,72 (Д, Merck); 0,77 (С, Merck),
5,1 г (6,8 мoль) тетрапепткда (12) растворяют в 100 мл ДМФА и при перемешивании и охлаждении добавляют 1,16 мл (6,8 ммоль) диизопропилзтил амина в 3 мл ДМФА и 3,3 г (6,8 ммоль) нитрофенилового эфира М бенз1-шокси- карбонил-Ь-аспарагииа, растворенного в 15 мл ДМФА, Через 2-3 ч реакционную массу обрабатывают аналогично соединению 7, Продукт, полученный после отгонки растворителя, очшцают на колонке с силикагелем фирмы .Merck, Элюированиё провод5 т. в системе хлороформ - этанол - этилацетат - AcOH-HjQ 185:5:8:,2:0,25. Соот- .ветствующие фракции собирают, упаривают и сушат в вакууме. Получают 4,6 г (70%) разветвленного пентапептида энкефалина (13) с М +8,2°, (с. 1, . 0,72 (А) j 0,83 (D),
N,0-ди-трет-бутилоксикарбонил- тиpoзил- N -(трибензилоксикарбонил- аргннил-аспарагинил) -D-орнитил- глицил-фенилаланин (15), Из 2 г i (2,28 ммоль) пентапептида (13) и 1,69 г (2,28 моль) пентафторфенилово- го эфира трибензилоксикарбонил-Ь-ар- гинина получают гексапептид (15) аналогично соединению (13), Очистка продукта, полученного после отгонки растворителя, не проводится ввидз плохой растворимости полученного соединения. Выход 2,7 г защищенного гексапепти- да (15),
К,0-ди-трет-бутилоксикарбонш1-ти- розил- Н--(трибензил-оксикарбонил- аргинил-аспарагинил) -D-орнитил-гли- цилфенилаланинамид (16)„ К раствору 0,514 г (0,373 ммоль), соединения (15) в 10 мл ДМФА добавляют 0,050 г (0,373 ммоль) аммониевой соли 1-окси- б ензотриазола и 0,076 г (0,373 г-шоль)
0,352 г (68%) Зй1чи1денного амрода. гекс пептида (16); R, 0,75 (А), Вследствие плохой растворимости хроматогра- фическую очистку соединения (16) непроводят. js
Тирозил-N -(аргинил-аспарагикил- D-орнитил-глкцилфенилаланинамид (1), К раствору 0,352 г (0,256 ммоль) за10 щищенного гексапептида (16) в 15 мл метанола, 1,5 мл АсОН и-0,5 нл воды добавляют пэлладиевуто чернь и гидрируют в течение 2-3 ч. Катализатор отфильтровывают, фильтрат упариj вают. Остаток растирают с эфиром и сушат в вакууме над. гидроокисью калия о Пол,енный продукт растворяют в 5 мл 70%-ного раствора TFA в хлористом метилене и выдерживают 30 мин,
20 Растворитель отгоняют и остаток растирают с зфиром. Образовавшийся осадок отфильтровывают,.промывают эф ром и cyiuaT в вакууме. Полученный продукт очищают высокоэффективной
25 жидкостной хроматографией на колонке Lorbax Cg, Элюированиё осуществляют смесью этанол - О,1 М раствор ацетата аммония 5:95, Соответствующи фракции собирают и лиофилизуют, Вы30 ход 0,076 г (38%) разветвленного ами да гексапептида (1) .р +45 (с. ; 0,2 н-АсОН); R 0,43 (В, Merck 0521 (Д, Merck); аминокислотный со став: Туг 0,93; Gly 1,00; Phe 1,07; Orn 0,97; Asn 1,03; Arg 1,00,
Биологическая активность описываемого энкефалина исследована в опытах in vivo по методу Узда на беспородных мышах-самцах массой 18-22 г, Анальгетический эффект изучен по сравнению с таковым морфина, природных энкефалинов (Leu и Met энкeфaли- нов), структурного аналога описываемого энкефалина.
При интрацистернальном введении исследуемые соединения, растворенные в стерильном физиологическом растворе, в объеме 10 мкл вводят при помощи J-обраэной иглы в cisterna manga моз50 га неанестезированным мьшам Исследовали диапазон доз от 0,0005 до 0,01 мкг/животное„ Контрольным живот нын вводят 10 мкл стерильного физио- ,1огического раствора. При внутривен35
40
45
дициклогексилкарбодиимида (ДЦГК), Ре- 55 P введении препарат вводят в хвосакциошгую смесь оставляют на ночь. После завершения реакции реакционную массу отфильтровьшают и обрабатьшают аналогично соединению 7, Получают
3419706
0,352 г (68%) Зй1чи1денного амрода. гекса- пептида (16); R, 0,75 (А), Вследствие плохой растворимости хроматогра- фическую очистку соединения (16) непроводят. js
Тирозил-N -(аргинил-аспарагикил- D-орнитил-глкцилфенилаланинамид (1), К раствору 0,352 г (0,256 ммоль) за10 щищенного гексапептида (16) в 15 мл метанола, 1,5 мл АсОН и-0,5 нл воды добавляют пэлладиевуто чернь и гидрируют в течение 2-3 ч. Катализатор отфильтровывают, фильтрат упариj вают. Остаток растирают с эфиром и сушат в вакууме над. гидроокисью калия о Пол,енный продукт растворяют в 5 мл 70%-ного раствора TFA в хлористом метилене и выдерживают 30 мин,
20 Растворитель отгоняют и остаток растирают с зфиром. Образовавшийся осадок отфильтровывают,.промывают эфиром и cyiuaT в вакууме. Полученный продукт очищают высокоэффективной
25 жидкостной хроматографией на колонке Lorbax Cg, Элюированиё осуществляют смесью этанол - О,1 М раствор ацетата аммония 5:95, Соответствующие фракции собирают и лиофилизуют, Вы30 ход 0,076 г (38%) разветвленного амида гексапептида (1) .р +45 (с. ; 0,2 н-АсОН); R 0,43 (В, Merck) 0521 (Д, Merck); аминокислотный состав: Туг 0,93; Gly 1,00; Phe 1,07; Orn 0,97; Asn 1,03; Arg 1,00,
Биологическая активность описываемого энкефалина исследована в опытах in vivo по методу Узда на беспородных мышах-самцах массой 18-22 г, Анальгетический эффект изучен по сравнению с таковым морфина, природных энкефалинов (Leu и Met энкeфaли- нов), структурного аналога описываемого энкефалина.
При интрацистернальном введении исследуемые соединения, растворенные в стерильном физиологическом растворе, в объеме 10 мкл вводят при помощи J-обраэной иглы в cisterna manga моз50 га неанестезированным мьшам Исследовали диапазон доз от 0,0005 до 0,01 мкг/животное„ Контрольным живот нын вводят 10 мкл стерильного физио- ,1огического раствора. При внутривен35
40
45
товую вену мышеи в диапазоне доз от 5 до 20 мг/кг массы животного. Каждая экспери :ентальна,я группа состоит из 10 мышей. Анальгетический эффект ,
соединений оценивают по тесту tail pinch при помощи артериального зажима, который накладывают на основание хвоста. Определение болевой реакции проводилось через 5, 15, 30, 60, 90 мин после введения и затем каждые 30 мин до исчезновения аналь- гетической реакции.
Результаты выражают альтернативным методом в проценте мышей, показавших анальгетическую реакцию. При вычислении ЕДзо используют метод Литчфиль- да и Уилкоксона,,Анальгетическая ак- тивность и продолжительность действия
соединений приведены в табл,1 и 2,
1
Новьй аналог энкефалина проявляет выраженную анальгетическз о активность. Максимальный эффект наблюда- ется на 5 мин после введения. Как видно из табЛо, анальгетическая активность аналога энкефалина (1) при интрацистернальном введении мышам значительно превышает анальгетическую активность природных энкефалинов (соединения 3, 4) ив 12,5 раз активность соединения 2 (аналога), Описываемое соединение 1 в 300 раз активнее морфина (соединение 6), в 25 раз активнее природного длинного опиоидно го пептида-В -эндорфина (соединение 5 и в 3 раза активнее известного сильнодействующего аналога энкефалина FK-33 824 (соединение 7),
Анальгетическая активность аналогов энкефалина при интрацистернальном введении мышам (метод tail pinch)
Tyr D-Orn Gly-Phe NH
Arg-Asn-J Tyr-D-Orn-Gly-Phe
Arg-Asn-J
(аналог-сравнение) ;Leu-энкефалин iMet-энкефапин Вп-эндорфин
В отличие от природных энкефалинов описываемое соединение активно при-внутривенном введении (таблица 2) Анальгетическая активность нового разветвленного,гексапептидамина 1 составляет 150% активности морфолина при внутривенном введении, кроме того, он в 3 раза активнее аналога (соединение 2) при этом способе введения.
Терапевтический индекс нового соединения (1) составляет величину бо1Q /200. лее чем 18 vГГ) поскольку дозы до
200 мг/кг (соединение 1) еще не вызывают каких-либо токсических эффектов или летального исхода при внутривенном введении.
Таким образом, описываемое соединение 1 обладает вьфаженной анальгети ческой активностью, превосходя природные анальгетики и известные аналоги по структуре и при этом обладает низкой токсичностью,
Формула изобретения
Аналог энкефалина формулы
Arg-Asnобладающий анальгетической активностью,
Таблица 1
0,004(0,,005)
300
0,05(0,03-0,10)
24
174 (102-281) 134 (90-261) 0,096(0,058-0,157)
33-824)
5-151,2 (0,6-2,2)
0,013
Примечание, - эффективная доза, вызывающая анальгетическую реакцию у 50% подопытньпс животньк. В работе использовался морфин гидрохлорид в ампулах производства Ташкентского ХФЗ.
Таблица 2
Анальгетическая активность аналога энкефалина при внутривенном введении мьшам
Arg-Asti J Морфин
18(15-22) 5-15
Примечаниео При ЕД д
1 92
60
100
V
Редактор Л.Народная Техред М.Ходанич
Заказ 997Тираж 319Подписное
ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, , Раушская наб,, Де 4/5
Производственно-издательский комбинат Патент, г, Ужгород, ул, Гагарина, 101
etf
W
Корректор О,Кравцова
Изобретение касается производных пептидов, в частности аналога знкефалина формулы Tyr-D- grn Gly Phe Изобретение относится к аналогу энкефалина I Туг - D Огп - Gly - Phe - NH Arg - Asn-l, новому биологически активному соединению, обладающему анальгетической активностью, которое может найти применение в медицине. Цель изобретения - поиск в ряду пептидов-аналогов анквфалинов, обладающих низкой токсичностью и более высокой анальгетической активностью Описываемый аналог энкефалина (смосхену на чертеже), синтезируют известными методами пептидной химии в растворе, согласно приведенной схемы с использованием активированных эфиров трет-бутилоксикарбониламиноNH , который обладает биологической активностью и может найти применение в медицине Цель создание более активных веществ указанного класса. Получение ведут с использованием активированных зфиров трет- бутилоксикарбониламинокислот с защитой аминогрупп. Испытания показьшают, что новый аналог энкефалина малотоксичен и при внутреннем введении в 1,5 раза активнее морфина, в 3 раза активнее аналога: ()-- , а при интрацистернальном введении мышам - в 3 раза активнее морфина,в 12,5 раз активнее аналога. 1 ил. 2 табл. кислот. J-Аминофункцию Б орнитина защищают бензилоксикарбонильной группой, гидроксил тирозина трет-бутилокси- карбонильной группой. Установлено, что амидирование карбоксильной группы в гексапептиде приводит к неожиданному резкому увеличению анальгетической активности полученного нового аналога энкефалина как при интрацнс- тернальном,так и при внутривенном введении в опытах на животных Для синтеза аналога энкефалина (I) используют аминокислоты и их производные фирмы Реанал (Венгрия). Все аминокислоты, кроме D-орнитина, имеют L-конфигурацию. Температуру плавления веществ определяют в капилляре (без коррекции). Индивидуальность промежуточных соединенит контролируют с помощью тех на пластинS М ш,
| Аналог энкефалина, обладающий анальгетической активностью | 1984 |
|
SU1182796A1 |
| Способ восстановления хромовой кислоты, в частности для получения хромовых квасцов | 1921 |
|
SU7A1 |
