Способ определения отторжения трансплантата культур островковых клеток поджелудочной железы Советский патент 1992 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к медицине, а именно к трансплантологии, и может быть использовано для выявления отторжения трансплантата.

Цель изобретения- повышение точности способа и сокращение сроков выявления отторжения трансплантата.

Способ осуществляют следующим образом.

Забор крови у реципиента проводят из локтевой вены в количестве 10 мл утром натощак. Цельную кровь центрифугируют в v течение 25 мин при 1500 оборотах в 1 мин в градиенте плотности фиколл-верографинз. Отбирают популяцию лимфоцитов и после трехкратного и-х отмывания в среде 199 (по 10 мин при 1500 об, в 1 мин) готовят суспензию, добавляя к осадку лимфоцитов 1 мл среды 199, механически гомогенизируют до однородной смеси, из которой микропипеткой отбирают 0,05 мл и переливают в стеклянную пробирку, содержащую 0,4 мл 3%-ной уксусной кислоты. Этой смесью заправляют камеру Горяева и проводят подсчет количества лимфоцитов в 5 рядах больших квадратов.

Полученное количество лимфоцитов в камере Горяева разводят в среде 199 до концентрации 2x10 лимфоцитов в 1 мл среды 199.

Рабочий раствор инсулина для обработки лимфоцитов готовят следующим образом: автоматической микропипеткой набирают 0,004 мл простого инсулина для инъекций и разводят в 100 мл 0,9%-ного ,раствооа хлорида натрия. Из полученного раствора набирают 0,1 мл и добавляют к нему 0,1 мл суспензии лимфоцитов в среде 199 (содержащий 2x105 лимфоцитов).

Смесь инкубируют 30 мин при 37° С, затем к ней добавляют 0,2 мл среды 199, центрифугируют 5 мин при 1500 оборотах, в

1мин, отбирают супернатант. Процедуру повторяют. Затем в осадку лимфоцитов добавляют 0,1 мл среды 199, суспендируют, добавляют 0,1 мл 0,05%-ной суспензии эритроцитов барана в среде 199, Инкубируют 10 мин при 37° С. Затем центрифугируют

2мин при 1500 об./мин, ставят в холодильЧ

ю

ник при 4° С на 12 ч. Затем в пробирку добавляют 0,4 мл 3%-ного раствора глута- рового альдегида в среде 199. Выдерживают 20 мин. Затем добавляют 0,5 мл дистиллированной воды и осаждают, центрифугированием 2 мин при 1500 об./мин. Отбрасывают супернатант, а осадок клеток гомогенизируют шприцем с длинной иглой и готовят мазки. Высохшие мазки фиксируют 10 мин метиловым спиртом, окрашивают по Романовскому, подсчитывают количество розеткообразующих клеток из 100 лимфоцитов. При показателях Ти m 27% и ниже устанавливают наступление иммуноконф- ликта.

Способ иллюстрируют следующими примерами.

П р и м е р 1. Больной А., 1971 г. рождения; поступил в клинику хирургических болезней № 1 18.111.86 г. с диагнозом: сахарный диабет, тип 1, тяжелая форма, диабетическая ретинопатия, полиневропатия, 19.111.86 г. сделана внутримышечная аллот- рансплантация культур островковых клеток из 6 поджелудочных желез трупов внутриутробных плодов человека 16-20-недельно- го срока развития. Культуру ткани из поджелудочных желез готовили согласно методических рекомендаций В.Н.Блюмки- на.

Перед трансплантацией количество Т- лимфоцитов обработанных инсулином (Гц) . 62%, через 10 сут после трансплантации уровень Ти - 60%, через 14 сут уровень Ти - 58%, через 21 сутки Ти-34%, через 1 месяц - Ти - 23%. Клинический эффект трансплантации проявлялся первые 3 недели: исчезли жажда, полидипсия, полиурия, уменьшились боли в ногах, снизился уровень глюкозы в крови с 17,6 мМоль/л до 6,8 мМоль/л, в связи с чем снижена доза экзогенио вводимого инсулина на 26 ЕД. Спустя три недели начала увеличиться гликемия (10,2-14,6 мМоль/л) и соответственно увеличилась потребность в экзогенно вводимом инсулине. Через месяц после трансплантации уровень Ти - 23% клинически эффект от трансплантации не наблюдался: больной вернулся к исходной потребности в инсулине (68 БД), появились полиурия и никтурия, что подтвердило диагностический вывод, что пересаженные островковые клетки поджелудочной железы перестали продуцировать инсулин, т.е. наступил иммуноконфликт.

Прим ер 2. Больная Ц., 1971 г. рождения, поступила в клинику 7.Y1.87 г. с диагнозом: иисулинозависимый сахарный диабет тяжелой степени, антигиопатия нижних конечностей, ретинопатия, неврит слухового нерва. 7.YI.87 г. произведена внутримышечная аллотрансплантация культур островковых клеток поджелудочных желез.

До пересадки уровень Ти составлял 57%, через три дня Ти - 52%, через десять дней - 27%, через 14 дней - 25%. Уровень Ти к 10-му дню после трансплантации резко снизился, сделан вывод о начале отторжения

трансплантата. Это подтверждается клиническим показателями: не снижался уровень глюкозы в плазме, удерживались жажда, полидипсия, боли в ногах, в связи с чем доза экзогенного инсулина не была снижена.

Предлагаемым способом по иммунологическим данным можно предсказать криз отторжения пересаженных островковых клеток поджелудочной железы за 5-7-е сут до клинического проявления криза отторжения, что не позволяет осуществить известный способ, .ак как согласно известному способу можно лишь констатировать наступивший криз отторжения по соотношению Т-лимфоцитов-супрессоров (Tj) к Т-лимфоцитам-хелперам(Ту«).

В предлагаемом способе представлены данные о возможности раннего выявления отторжения на 10 больных со статистической обработкой результатов. Всего предлагаемым способ был апробирован на 62 больных, которым ранее была сделана аллотрансплантация культур островковых клеток поджелудочных желез. У 50 больных наступило приживление пересаженных островковых клеток поджелудочной железы.

При использовании предлагаемого способа возрастает точность диагностики на 26% (точность при использовании предлагаемого способа составляет 90%, а по известному 64%).

Формул а изобретени я

Способ определения отторжения транс- плантата культур островковых клеток поджелудочной железы, включающий забор крови, выделение лимфоцитов,-инкубацию их с эритроцитами барана с последующим определением количества розеткообразую-. щих клеток, отличающийся тем, что, с целью повышения точности способа, перед инкубацией лимфоцитов с эритроцитами барана их дополнительно инкубируют с инсулином и при количестве розеткообразующих клеток 27% и ниже определяют отторжение трансплантата культур островковых клеток поджелудочной железы.

Изобретение относится к медицине, а именно к трансплантологии, и может быть использовано для диагностики отторжения трансплантата культур островковых клеток поджелудочной железы. Цель изобретения - повышение точности диагностики. У больного производят забор крови, выделение лейкозвеси, инкубацию ее с инсулином и эритроцитами барана, с последующим определением розеткообразующих клеток и при их количестве 27% и ниже диагносциру- ют отторжение трансплантата. По сравнению с прототипом увеличивается точность способа на 26%.