ПЕПТИДНАЯ СПЕЦИФИЧНОСТЬ АНТИТЕЛ К МВР (МИЕЛИНОВОМУ ОСНОВНОМУ БЕЛКУ), СОДЕРЖАЩАЯ ЕГО ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ И СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ РАССЕЯННОГО СКЛЕРОЗА Российский патент 2000 года по МПК C07K7/06 A61K38/08 A61P25/24 

ОБЛАСТЬ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
Данное изобретение касается некоторых полипептидов и их использования для иммунорегуляции антител к миелиновому основному белку человека. Изобретение также относится к новым фармацевтическим композициям, содержащим указанные полипептиды, и к способу использования этих пептидов для лечения рассеянного склероза.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Рассеянный склероз (MS) - это многоочаговое демиелинизирующее заболевание центральной нервной системы (ЦНС) человека, связанное с воспалением. Повышенный синтез lgG в пределах гематоэнцефалического барьера (intra-BBB) является признаком рассеянного склероза (Tourtelotte, W. W. J. Neurol Sci. 10: 279-304, 1970; Link, H. And Tibbling G., Scand. J. Clin. Lab. Invest. 37: 397-401, 1977; Tourtelotte, W. W. and Ma. B., Neurology 28: 76-83, 1978; Walsh, J. M. And Tourtelotte, W. W. In; Hallpike, J. F. Adams, C. W. M. And Tourtelotte, W. W. eds. Multiple Sclerosis. Baltimore. Williams & Wilkins, 1982: 275-358; and Warren. K. G. , and Catz, 1. Ann Neurol 17: 475-480, 1985).

Выработка lgG в пределах ВВВ в основном повышается у пациентов с клинически определенным заболеванием рассеянным склерозом (Schumacher, G. A., Beebe, G., Kibler R. E. et al. Ann NY Acad. Sci. 15: 266-272, 1965), как в случае активной, так и скрытой формы заболевания. Специфичность большинства lgG ЦНС неизвестна. Тогда как небольшая их часть обладает антивирусной активностью или выступает во взаимодействие с антигенами мозга, нуклеиновыми кислотами, эритроцитами или антигенами гладкой мускулатуры, другие неспецифические lg могут быть задействованы в поликлональной активации В-клеток (Tourtelotte, W. W., and Ma, В., Neurology 28: 76-83, 1978). В течение последнего десятилетия наблюдается значительный интерес к изучению антител, специфичных к миелиновым белкам.

Вслед за обнаружением циркулирующих иммунных комплексов, содержащих миелиновый основный белок (МВР) в качестве антигенного компонента (Dasgupta, М. К. Catz, I, Warren, К. G., et aL, Can. J. Neurol Sci. 10: 239-243, 1983), были выявлены повышенные титры антител к МВР (anti-МВР) в спиномозговой жидкости (CSF) больных с активной формой рассеянного склероза (MS) (Warren, К. G., and Catz, I., Ann Neurol 209: 20-25, 1986). Клиническая картина рассеянного склероза характеризуется фазами активного заболевания, такими как острые рецидивы или хроническое течение, и фазами клинической ремиссии.

Для активной формы рассеянного склероза характерны повышенные уровни внутриоболочечных анти-МВР (Warren, К. G., and Catz, I., Ann Neurol 209: 20-25, 1986, and Catz, I., and Warren, К. G., Can J. Neurol Sci. 13: 21-24, 1986). Эти антитела обнаруживаются преимущественно в свободной (F) форме во время острых рецидивов и преимущественно в связной (В) форме - когда болезнь незаметно прогрессирует (Warren, К. G., and Catz, I., Ann Neurol 209: 20-25, 1986). Во время острых рецидивов титры анти-МВР в спиномозговой жидкости (CSF) соответствуют активному развитию заболевания (Warren, К. G., and Catz, I. , Ann Neurol 21: 183-187, 1987). Уровни анти-МВР также повышаются у больных с первыми приступами оптического неврита и у большинства больных с начальными стадиями рассеянного склероза (MS) (Warren, К. G., Catz, I., and Bauer, С. , Ann Neurol 23: 297-299, 1988; Warren, К. G., and Catz, I., J Neurol Sci. 91: 143-151, 1989).

Продолжительные исследования кинетики уровней антител к МВР в CSF у пациентов, находящихся в стадии выздоровления после острого рецидива, показали постепенное падение титров анти-МВР в свободной (F) форме с соответствующим пропорциональным повышением (В)-фракций, т. е. анти-МВР в связанной форме (Warren, К. G., and Catz, I., J. Neurol Sci. 91: 143-151, 1989; Warren, К. G., and Catz, I., J. Neurol Sci. 88: 185-194, 1988). В стадии ремиссии анти-МВР в CSF могут не обнаруживаться, что позволяет предположить, что нейтрализация анти-МВР связана с неактивной стадией заболевания (MS) (Warren, К. G. , and Catz, I. , J. Neurol Sci. 88: 185-194, 1988). Наоборот, хронически прогрессирующий рассеянный склероз (MS), характеризующийся постоянным увеличением выработки анти-МВР в течение продолжительного периода времени, связан с ингибированием нейтрализации анти-МВР (Warren, К. G., and Catz, I., J. Neurol Sci. 88: 185-194, 1988). Недавно в IgG-фракции, полученной из CSF больных MS, были идентифицированы антитела к основному миелиновому белку, в том числе анти-МВР, антитела, нейтрализующие анти-МВР, и антитела, ингибирующие нейтрализацию анти-МВР (Warren, К. G., and Catz, I., J. Neurol Sci. 96: 19-27, 1990).

Предыдущие исследования авторов изобретения с учетом сведений о B-клеточных аутоантителах показывает, что существует по крайней мере две отличающиеся друг от друга формы рассеянного склероза (MS): первая - когда у большинства больных вырабатываются аутоантитела к миелиновому основному белку (анти-МВР), и вторая, когда у меньшего числа больных вырабатываются антитела к белку протеолипидной природы (анти-PLP) (Warren, К. G., et al., Ann Neurol 35: 280-289, 1994). При той форме заболевания (MS), для которой характерно наличие анти-МВР, острые рецидивы сопровождаются увеличением соотношения свободных (F) и связанных (В) анти-МВР, тогда как хронически прогрессирующая фаза характеризуется более низким соотношением F/B анти-МВР, а больные на стадии ремиссии редко имеют слегка повышенные титры анти-МВР (Warren, К. G., and Catz, I., J. Neurol Sci. 88: 185-194, 1989).

Было показано, что часть пролиферирующих Т-клеток у больных рассеянным склерозом направлена к МВР (Allegretta et al., Science, 718-721, 1990) и что Т-клетки человека могут узнавать множественные эпитопы на молекуле (Richert et al. , J. Neuroimmun 23, 55-66, 1989). МВР, по-видимому, также способом к активации некоторых Т-клеток без вовлечения антигенпрезентирующих клеток (Altman et al, Eur. J. Immunol. 17, 1635-1640, 1987). Похоже, что небольшие пептиды МВР могут распознаваться Т-клетками без внутриклеточного процессирования просто за счет их способности связывать антигены основного комплекса гистосовместимости класса II на поверхности презентирующих клеток.

Поскольку экспериментальный аллергический энцефаломиелит (ЕАЕ), признанный моделью рассеянного склероза (MS) на животных, может быть индуцирован введением чувствительным грызунам как МВР, так и PLP в сочетании с полным адьювантом Фрейнда, процесс демиелинизации при рассеянном склерозе, возможно, имеет аутоиммунный механизм (Fritz, R. В. et al., J. Immunol., 130, 1024-1024, 1983; Trotter, J. L. et al., J. Neurol Sci. 79, 173-188, 1987).

Принимая во внимание сведения о В-клеточных аутоантителах, эпитоп MВР, на который "нацелено" заболевание, локализован вблизи от трипролиловой последовательности (остатки - 99-100-101-) на участке между 80-м и 100-м остатком (Warren, К. G., et al, Ann Neurol 35: 280-289, 1994). Этот B-клеточный эпитоп частично перекрывает иммунодоминантный эпитоп Т-клеток, активных в отношении МВР, которые обнаружены в участках мозга, пораженных рассеянным склерозом (MS) (Oksenberg, g. R. et aL, Nature, 362, 68-70,1993).

Предыдущие исследования показали, что анти-МВР нейтрализуются МВР. Однако предварительные попытки лечения рассеянного склероза (MS) внутримышечным или подкожным введением гетерологичных МВР не привели к успеху (Campbell, В. , Vogel, R. J., Fisher, E. and Lorenz, R., Arch Neurol 29: 10-15, 1973; Gonsette, R. E., Delmotte, P. and Demonty, L., J Neurol 216: 27- 31, 1977; and Romine, J. S. and Salk, J., In: Hallpike, J. F., Adams, C. W. M. and Tourtelotte, W. W., eds. Multiple sclerosis. Baltimore, Williams & Wilkins, 1982: 621-630). Проблема использования нативного МВР имеет две стороны. Белок получают из образцов мозга человека и потому существует потенциальная опасность, что в нем присутствуют латентные нейровирусы.

Кроме того, несмотря на то, что, как правило, МВР не является иммуногенным, при введении лицам с нарушенной иммунной системой МВР может проявлять себя как антиген и вызывать выработку антител к МВР.

Соответственно, настоящее изобретение направлено на решение вопроса: могут ли анти-МВР, выделенные из спиномозговой жидкости (CSF) больных рассеянным склерозом (MS) в стадии острого рецидива нейтрализоваться определенными пептидами МВР человека (h-MBP). Для этой цели синтетические пептиды, соответствующие полной длине h-MBP, использовали для определения возможной эпитопной области на h-MBP, которая нейтрализует анти-МВР, полученные от указанных больных. Следовательно, выбранные пептиды, которые нейтрализуют анти-МВР, могут использоваться для лечения рассеянного склероза (MS) более эффективно, чем МВР полной длины. Эти пептиды получены искусственным путем и потому не несут потенциальной угрозы, связанной с нейровирусами. Кроме того, в связи с малым размером эти пептиды не проявляют себя в качестве иммуногенов. Следовательно, использование указанных пептидов как средства лечения рассеянного склероза поможет решить проблемы, возникающие при использовании нативного белка.

Кроме того, пептиды, полученные согласно настоящему изобретению, исследуют для определения эффективности их связывания или модуляции выработки анти-МВР рассеянного склероза (MS) in vivo.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В соответствии с изобретением заявлены пептиды, последовательность которых в основном гомологична части аминокислотной последовательности миелинового основного белка человека. Эти пептиды способны нейтрализовать или модулировать выработку анти-МВР. В соответствии с настоящим изобретением заявляются пептиды формулы:
R₁-Val-His-Phe-Phe-Lys-Asn-Ile-R₂
и их соли, где Val-His-Phe-Phe-Lys-Asn-Ile - аминокислотные остатки 87-93 SEQ ID NO:1 и R₁ и R₂ независимо выбраны из группы, включающей водород, гидрокси, остаток аминокислоты и остаток полипептида, причем R₁ и R₂ не являются водородом или гидроксилом одновременно. Пептид может содержать замещения, делеции или добавления, причем его функция нейтрализации или модулирования выработки анти-МВР сохраняется.

Примеры указанных пептидов:
МВР 75-95 (аминокислотные остатки 75-95 of SEQ ID NO: 1)
Lys Ser His Gly Arg Thr Gln Asp Glu Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn Ile Val Thr
MBP 64-78 (аминокислотные остатки 64-78 of SEQ ID NO: 1)
Ala Arg Thr Ala His Туr Gly Ser Leu Pro Gln Lys Ser His Gly
MBP 61-75 (аминокислотные остатки 61-75 of SEQ ID NO: 1)
His His Pro Ala Arg Thr Ala His Tyr Gly Ser Leu Pro Gln Lys
MBP 69-83 (аминокислотные остатки 69-83 of SEQ ID NO: 1)
Tyr Gly Ser Leu Pro Gln Lys Ser His Gly Arg Thr Gln Asp Glu
MBP 80-97 (аминокислотные остатки 80-97 of SEQ ID NO: 1)
Thr Gln Asp Glu Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn Ile Val Thr Pro Arg
MBP91-106 (аминокислотные остатки 91-106 of SEQ ID NO: 1)
Lys Asn Ile Val Thr Pro Arg Thr Pro Pro Pro Ser Gln Gly Lys Gly
MBP 84-93 (аминокислотные остатки 84-93 of SEQ ID NO: 1)
Asn-Pro-Val-Val-His-Phe-Phe-Lys-Asn-Ile
MBP 85-94 (аминокислотные остатки 84-94 of SEQ ID NO: 1)
Pro-Val-Val-His-Phe-Phe-Lys-Asn-Ile-Val
MBP 86-95 (аминокислотные остатки 86-95 of SEQ ID NO: 1)
Val-Val-His-Phe-Phe-Lys-Asn-Ile-Val-Thr
MBP 87-96 (аминокислотные остатки 87-96 of SEQ ID NO: 1)
Val-His-Phe-Phe-Lys-Asn-Ile-Val-Thr-Pro
Далее, согласно настоящему изобретению, заявлена фармацевтическая композиция, содержащая в качестве активного ингредиента пептид из числа описанных выше, индивидуально или в композиции, смеси с фармацевтически приемлемым носителем.

Кроме того, в соответствии с настоящим изобретением заявляется способ лечения рассеянного склероза, предусматривающий введение эффективного количества пептида из описанных выше, как индивидуально, так и в сочетании для эффективной нейтрализации или модулирования выработки антител к МВР человека.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Фиг. 1 показывает локализацию восемнадцати синтетических пептидов по отношению к интактной молекуле МВР человека. Пептиды представлены в виде вертикальных полос и размещены после соответствующего им участка на молекуле МВР. Шкала показывает аминокислотные остатки на молекуле МВР человека.

Фиг. 2 показывает кривые ингибирования антител к МВР, очищенных и полученных от 10 различных больных рассеянным склерозом, при введении МВР человека и МВР-пептидов.

Фиг. 3 показывает нейтрализацию анти-МВР, полученных от одного больного рассеянным (MS) МВР человека и пептидами МВР 80-97, МВР 91-106 и МВР 75-95.

Фиг. 4 - длительный мониторинг титров анти-МВР в спинномозговой жидкости у пациента с хроническим рассеянным склерозом (MS):
уровни F (свободных) и В (связанных) анти-МВР были стабильно повышенными при исследовании 26 проб в течение 11-летнего периода с 1983 по 1993 г.

cpm: счет в минуту

- о - связанные (В) анти-МВР, определенные после кислотного гидролиза иммунных комплексов в спинномозговой жидкости (CSF).

-•- - свободные (F) анти-МВР.

Фиг. 5 - контрольные больные: уровни анти-МВР CSF в 2 временных контролях (1F56, Фиг. 5А и 3М66, Фиг. 5В) и 2 двух временных контролях при использовании физиологического раствора. У всех четверых больных уровень (F)- и (В)-анти-МВР остается устойчиво повышенным по отношению к базовому уровню, когда CSF отбиралась для анализа каждые 30 мин в течение первых двух часов, так же, как и 24 часами позже. Обозначения такие же, как на фиг. 4.

Фиг. 6 - сравнительные исследования пептидов от разных больных: уровни анти-МВР в спинномозговой жидкости в группе из четырех больных (10F38, Фиг. 6а; 13F43, Фиг. 6С; 5М59, Фиг. 6D; и 3М66, Фиг. 6G), получивших увеличенные количества (1, 2.5, 5 и 10 мг соответственно) несвязанного контрольного синтетического пептида МВР-35-58 и в группе из четырех других больных (6F53, Фиг. 6В; 8М41, Фиг. 6D; и 4М45, Фиг. 6F; и 1F56, Фиг. 6Н), которые получали повышенные количества (1, 2.5, 5 и 10 мг соответственно) анти-МВР, связывающих синтетический пептид МВР 75-95. CSF (F)- анти-МВР были связаны в дозозависимом соотношении пептидом МВР 75-95, и они не вступали во взаимодействие с пептидом МВР 35-58. Связанные анти-МВР оставались фактически нереакционноспособным.

Фиг. 7 - сравнительные исследования пептидов от разных больных: когда больные MS подвергались временному контролю (1F56, Фиг. 7С и 3М66, Фиг. 7D) или временному контролю при использовании физиологического раствора (5М59, Фиг. 7А и 4М45, Фиг. 7В), а также, когда они получали несвязанный контрольный пептид МВР 35-58 (5М59 и 3М66), уровни их (F)-анти-МВР и (В)-анти-МВР оставались постоянно неизмененными. Напротив, когда те же больные 4М45, 1F56 и 3М66 позже получили 5-10 мг анти-МВР, связанных с пептидом МВР 75-95, их (F)-анти- МВР переставали обнаруживаться в течение периода до 7 дней и возвращались на уровень базовой линии между 10 и 21 днем.

Фиг. 8 - повторяемые внутрикожные инъекции синтетического пептида: больной с хронически прогрессирующим MS получал 10 еженедельных инъекций 10 мг МВР 75-95, вводимых непосредственно в спинномозговую жидкость; титры (F) и (В)-анти-МВР измерялись до (обозначенные кружками) и спустя 30 мин после инъекции (обозначенные квадратами). Свободные (F)-анти-МВР (заштрихованные квадраты и кружки) становились неопределяемыми в течение 10 недель, несмотря на то, что уровень связанных (В)-антител оставался существенно неизмененным (незаштрихованные квадраты и кружки).

Фиг. 9. Внутривенное введение синтетического пептида: уровни анти-МВР в спинномозговой жидкости соответствуют одной внутривенной инъекции 500 мг МВР 75-95; уровни связанных (В)- и свободных (F)- анти-МВР существенно снижаются при исследованиях спустя 10, 16 и 30 дней после инъекции. Обозначения - такие же, как на Фиг. 4.

Фиг. 10. Дальнейшее изучение МВР эпитопа для анти-МВР MS с использованием группы из 41 декапептида, которые перекрывают участки между 61 и 110 остатками.

Описание:
полосы обозначают процент ингибирования =100 - единицы радиоактивности;
МВР и пептид МВР 75-95 были использованы в качестве позитивного контроля и обеспечили 100% ингибирование как свободных (F)-, так и связанных (В)-антител;
пептиды МВР 51-60 и МВР 111-120 были использованы в качестве негативного контроля и привели к незначительному ингибированию (0-10%) связанных (В)- и свободных (F)-анти-МВР;
декапептиды МВР 84-93, МВР 85-94, МВР 86-95 и МВР 87-96, которые обеспечили максимальное ингибирование (90-100%) как свободных (F)-, так и свободных (В)-антител, тесно ассоциируются с МВР эпитопом;
пунктирная линия: 95%-ный достоверный интервал исследования по ингибированию.

ДЕТАЛЬНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение касается пептидов, аминокислотная последовательность которых практически гомологична части аминокислотной последовательности миелинового основного белка человека. Термин "практически гомологична" означает, что небольшие различия между аминокислотной последовательностью миелинового основного белка человека и пептидами могут существовать при условии, что пептиды с небольшими различиями в аминокислотной последовательности способны функционировать в соответствии с изначально присущим назначением, т. е. способны нейтрализовать или модулировать выработку антител к миелиновому основному белку человека (анти-МВР). Проведенные в настоящем изобретении разъяснения делают очевидным для специалистов в данной области тот факт, что эмпирически небольшие вариации в аминокислотной последовательности указанных пептидов могут быть произведены без ущерба для их функции.

В соответствии с настоящим изобретением на основе исследований по конкурентному ингибированию при использовании набора из 41 декапептида было установлено, что МВР эпитоп для анти-МВР MS локализован на участке между аминокислотой 82 и аминокислотой 98 (более 40% ингибирования связанных анти-МВР и более 60% ингибировния свободных анти-МВР).

С учетом самого высокого уровня ингибирования МВР эпитоп анти-МВР вероятно находится между аминокислотой 84 и аминокислотой 96.

Наименьший общий участок эффективных декапептидов располагается между 87 и 93 аминокислотами. Таким образом, в соответствии с настоящим изобретением пептиды могут описываться следующей формулой:
R₁-Val-His-Phe-Phe-Lys-Asn-Ile-R₂,
включающей и их соли, где Val-His-Phe-Phe-Lys-Asn-Ile- остатки аминокислот 87-93 SEQ ID NO 1 и где R₁ и R₂ - независимо друг от друга выбраны из группы, включающей водород, гидрокси, остаток аминокислоты и остаток полипептида; при условии, что R₁ и R₂ не являются водородом или гидроксилом одновременно. Участок аминокислотной последовательности, соответствующий семи аминокислотам, занимающим положение 87-93, вероятно, не слишком велик, чтобы эффективно связывать анти-МВР. Поэтому R₁ и R₂ не могут одновременно быть водородами или гидроксилами.

Когда R₁ или R₂ - аминокислота, то она может быть выбрана из природных аминокислот. R₁ или R₂ не ограничены аминокислотами, расположенными в положении "upstream" и "downstream" по отношению к Val 187 и Ile 93 в миелиновом основном белке человека, как показано в SEQ ID NO:1. Могут использоваться различные модификации, включая замещения, добавления и делеции в последовательностях, расположенных в положениях "upstream" и "downstream" по отношению к R₁ и R₂. Кроме того, такие же модификации, включая замещения, добавления и делеции, могут быть произведены и в последовательности -Val-His-Phe-Phe-Lys-Asn-Ile-, при условии, что полученные таким образом пептиды сохраняют предназначенную им функцию, т. е. нейтрализуют или модулируют выработку антител к миелиновому основному белку человека.

Термин "остаток пептида" или "полипептидный остаток" обозначает полипептид, состоящий из двух, трех и более аминокислотных остатков, включая белки и их фрагменты. Как сказано выше, когда R₁ или R₂ - полипептидный остаток, R₁ и R₂ не ограничиваются пептидами, расположенными в положении "upstream" и "downstream" по отношению к Val 187 и Ile 93 миелинового основного белка человека. Может быть использован любой остаток полипептида.

R₁ и/или R₂ могут быть повторами последовательности -Val-His-Phe-Phe-Lys-Asn-Ile или ее модификациями, включая замещения, дополнения или делеции. Таким образом, пептид может содержать многочисленные повторы сайта связывания анти-МВР (эпитопа).

Соединения, заявленные согласно настоящему изобретению, могут быть получены в соответствии с общепринятыми и хорошо известными методами синтеза полипептидов. Под термином "пептид" подразумевают пептиды, полученные из природных миелиновых основных белков человека в результате контролируемого гидролиза, осуществляемого до образования пептидов, относящихся к данному изобретению. Указанное понятие также включает и пептиды, полученные с помощью технологии рекомбинантных ДНК. С учетом известной последовательности заявленных пептидов в объем настоящего изобретения включено также установление соответствующей последовательности ДНК, кодирующей заявленную аминокислотную последовательность. Соответствующая последовательность ДНК может быть получена общепринятыми хорошо известными методами синтеза ДНК последовательностей. Полученные таким образом последовательности ДНК могут быть клонированы в соответствующих клонирующих векторах и использованы для трансформации подходящей клетки-хозяина с целью получения рекомбинантного пептида. Все изложенные выше подходы являются общепринятыми и хорошо известными для специалистов в данной области.

Пептиды, заявленные согласно настоящему изобретению, в основном гомологичны по своей аминокислотной последовательности части аминокислотной последовательности миелинового основного белка человека. Понятие "часть аминокислотной последовательности" означает, что последовательность может быть любой длины при условии, что она достаточно длинна для того, чтобы нейтрализовать или модулировать выработку антител к МВР, но имеет не такую длину, которая приводит к известным ранее проблемам, когда пептиды используются in vivo для лечения рассеянного склероза. В одном примере настоящего изобретения описаны пептиды, включающие от ~ 10 до ~ 25 аминокислотных остатков. Если заявленные пептиды используются как часть белков слияния, общий размер пептида может быть гораздо больше.

В соответствии с одним вариантом осуществления изобретения было установлено, что заявленные пептиды, соответствующие в значительной мере аминокислотной последовательности человеческого МВР, эффективны в отношении нейтрализации и модулирования выработки анти-МВР. Эти пептиды соответствуют аминокислотной последовательности человеческого МВР в интервале от 61 до 106 аминокислотного остатка. В одном примере эти пептиды соответствуют участку 75 - 106 аминокислотной последовательности человеческого МВР, когда пептиды используются для нейтрализации свободных анти-МВР. В последующем примере эти пептиды соответствуют участку 82 - 99 аминокислотной последовательности человеческого МВР, когда пептиды используются для нейтрализации и модулирования выработки связанных анти-МВР. Поэтому выбираются пептиды, состоящие из 10 - 25 аминокислотных остатков, из сплошной аминокислотной последовательности в пределах последовательности, показанной ниже (аминокислотные остатки SEQ ID NO:1), при условии, что указанная последовательность может нейтрализовать или модулировать выработку антител к миелиновому основному белку человека.

Аминокислотные остатки 61-106 SEQ ID NO:1
61 His His Pro Ala Arg Thr Ala His Туг Gly Ser Leu Pro Gln Lys Ser His
Gly Arg Thr Gln Asp Glu Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn Ile Val Thr Pro
Arg Thr Pro Pro Pro Ser Gln Gly Lys Gly 106
Ниже приведены примеры пептидов, выбранных из группы, включающей:
MBP 61-75 (аминокислотные остатки 61-75 SEQ ID NO: 1)
His His Pro Ala Arg Thr Ala His Туr Gly Ser Leu Pro Gln Lys
MBP 64-78 (аминокислотные остатки 64-78 SEQ ID NO: 1)
Ala Arg Thr Ala His Tyr Gly Ser Leu Pro Gin Lys Ser His Gly
MBP 69-83 (аминокислотные остатки 69-83 SEQ ID NO: 1)
Tyr Gly Ser Leu Pro Gln Lys Ser His Gly Arg Thr Gln Asp Glu
MBP 75-95 (аминокислотные остатки 75-95 SEQ ID NO: 1)
Lys Ser His Gly Arg Thr Gln Asp Glu Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn Ile Val Thr
MBP 80-97 (аминокислотные остатки 80-97 SEQ ID NO: 1)
Thr Gln Asp Glu Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn Ile Val Thr Pro Arg
MBP 91-106 (аминокислотные остатки 91-106 SEQ ID NO: 1)
Lys Asn Ile Val Thr Pro Arg Thr Pro Pro Pro Ser Gln Gly Lys Gly
Один аспект настоящего изобретения касается пептидов, представленных формулой:
R₁- Val-His-Phe-Phe-Lys-Asn-Ile-R₂
и их солей, где R₁ и R₂ независимо друг от друга выбраны из группы, включающей водород, гидрокиси, остаток аминокислоты и остаток полипептида; при условии, что R₁ R₂ не являются одновременно водородом или гидроксилом. Пептид может содержать замещения, добавления или делеции при условии сохранения пептидом своего свойства нейтрализовать или модулировать выработку антител к МВР человека.

Ниже приведены примеры пептидов, выбранные из группы, включающей:
МВР 84-93 (аминокислотные остатки 84-93 SEQ ID NO: 1)
Asn-Pro-Val-Val-His-Phe-Phe-Lys-Asn-Ile
MBP 85-94 (аминокислотные остатки 84-93 SEQ ID NO: 1)
Pro-Val-Val-His-Phe-Phe-Lys-Asn-Ile-Val
MBP 86-95 (аминокислотные остатки 84-93 SEQ ID NO: 1)
Val-Val-His-Phe-Phe-Lys-Asn-Ile-Val-Thr
MBP 87-96 (аминокислотные остатки 84-93 SEQ ID NO: 1)
Val-His-Phe-Phe-Lys-Asn-Ile-Val-Thr-Pro
Возможная роль анти-МВР в патогенезе рассеянного склероза продолжает исследоваться. О повышенных титрах анти-МВР у больных активной формой рассеянного склероза впервые сообщили Panich et al. (Panitch, H. S., Hooper, С. S., and Johnson, K. P., Arch Neurol 37: 206-209, 1980), которые использовали твердофазный радиоиммунологический анализ с МВР морской свинки. Пациенты с острым рецидивом заболевания, как правило, имели повышенное содержание анти-МВР, в основном, в свободной форме, тогда как некоторые больные в стадии клинической ремиссии могли иметь необнаруживаемые уровни анти-МВР. Во время переходного периода от острой дозы к ремиссии титры свободных анти-МВР прогрессивно снижались за период от нескольких недель до нескольких месяцев, в то время как уровень связанных антител был сравним с первоначальным. У других больных на стадии ремиссии можно было наблюдать низкие титры свободных и связанных анти-МВР, обычно с соотношением F/B меньше 1. Это позволяет предположить, что антитела (антитело), нейтрализующие анти-МВР, связываются с анти-МВР. Иногда больные, которые точно соответствовали критериям клинически определяемого рассеянного склероза, или больные с нейропатологически выявленным рассеянным склерозом имели неопределяемый уровень анти-МВР в период активной стадии заболевания. Возможно, такие пациенты имеют антитела к другим миелиновым белкам. Отсутствие схемы выработки специфических антител не уменьшает потенциальной возможной роли анти-МВР в механизме демиелинизации у большинства больных рассеянным склерозом.

Недавно различные антитела к МВР были обнаружены во фракции lqG, выделенной из спинномозговой жидкости больных рассеянным склерозом (Warren, К. G. and Catz, I., J Neurol Sci 96: 19-27, 1990). Первичные антитела к МВР как в свободной, так и в связанной форме оказались связанными с активной фазой заболевания: F/B > 1 у пациентов с острой формой и < 1 - у пациентов с хронически прогрессирующей формой рассеянного склероза (Warren, К. G. and Catz, I. , Ann Neurol 209: 20-25, 1986; Catz, I., and Warren, К. G. Can J Neurol Sci 13: 21-24, 1986; and Warren, К. G. and Catz, I., Ann Neurol 21: 183-187, 1987). Вторичные антитела, которые нейтрализуют анти-МВР, появляются, когда заболевание переходит в неактивную форму. Третичные антитела, которые ингибируют нейтрализацию анти-МВР, обнаруживаются, когда заболевание становится хронически прогрессирующим и переходит в неактивную форму. Тот факт, что каскад антител к МВР ассоциирован с фазами (MS), позволяет предположить, что образование таких антител, возможно, играет важную роль в развитии данного заболевания. Несмотря на то, что анти-МВР могут быть определены в CSF больных с активной формой рассеянного склероза (MS), их главная роль в патогенезе демиелинизации остается неподтвержденной. Участие анти-МБР в механизме развития рассеянного склероза (MS) лучше всего может быть установлено их нейтрализацией in vivo, возможно, при введении заявленных пептидов и мониторингом клинического течения заболевания. Если анти-МВР являются только первичными антителами, связанными с демиелинизацией при рассеянном склерозе (MS), вероятно, возможно блокировать димиелинизацию внутриоболочечным, и/или внутривенным, и/или оральным введением заявленных МВР пептидов, которые нейтрализовали бы анти-МВР и обеспечивали бы толерантность к МВР in situ. Другие миелиновые белки человека, возможно, также участвуют в димиелинизации при рассеянном склерозе (MS) и, в соответствии с этим, в объем настоящего изобретения включено использование пептидов, в значительной мере гомологичных по аминокислотной последовательности части аминокислотной последовательности указанных других миелиновых белков, для того, чтобы нейтрализовать соответствующие антитела. Несмотря на то, что предыдущие попытки лечения рассеянного склероза (MS) внутримышечным или подкожным введением гетерологичного МВР не оказались в полной мере успешными (Campbel, В., Vogel, R. J., Fisher, Е. and Lorenz, R., Arch. Neurol 29: 10-15, 1973; Gousette, R. Е., Delmotte, P. and Demonty, L. J Neurol 216: 27-31, 1977; and Romine, J. S. and Salk; J. , In: Halpike, J. F., Adams, C. W. M. and Tourtelotte, W. W., eds. Multiple Sclerosis. Baltimore, Williams & Wilkins, 1982: 621-630), внутриоболочечное и/или внутривенное введение МВР пептидов, которые нейтрализуют или модулируют выработку анти-МВР, в соответствии с изобретением, продемонстрировало более успешные результаты.

Моделью MS на животных служит экспериментальный аллергический энцефаломиелит (EAE), представляющий собой опосредованное Т-клетками демиелинизирующее заболевание. Симптомы EAE могут быть скорригированы введением мышам синтетических пептидов МВР (Gaur, A. et al, Science, 258, 1491-1494, 1992). Более того, введение высоких доз МВР делегировало аутореактивные Т-клетки и аннулировало клинические и патологические симптомы EAE у мышей (Gritchfield, J. М. et al., Science, 263, 1139-1143, 1994). Даже оральное введение МВР модулировало течение EAE за счет индукции периферической толерантности (Chen, W. et aL, Science, 265, 1237-1240, 1394). Недавно на основании сдвоенных пробных экспериментов было высказано предположение, что толерантность может быть индуцирована у больных MS оральным введением миелиновых антигенов (Weiner, Н. L. et al. Science 259, 1321-1324, 1993). Комбинация миелиновых антигенов и синтетических пептидов указанных антигенов, введенная оральным, и/или внутривенным, и/или внутриоболочечным путем, возможно, необходима для модулирования Т- клеток, В-клеток и макрофагов, участвующих в деструкции миелина у больных рассеянным склерозом (MS).

Соответственно, изобретение также касается фармацевтической композиции, содержащей в качестве активного ингредиента пептид, описанный выше, отдельно или в композиции, в смеси с фармацевтически приемлемым носителем. Примеры фармацевтически пригодных носителей хорошо известны и включают, например, физиологический раствор.

Пептиды, заявленные в настоящем изобретении, могут назначаться людям для лечения или модулирования MS. Терапевтическая доза для внутривенного и/или орального введения при лечении MS может составлять от примерно 1.0 мг на 1 кг веса тела до примерно 10.0 мг на 1 кг веса тела. Если введение осуществляется внутриоболочечно, доза может составлять от около 1 до около 10 мг. В одном из примеров изобретения пептид применяется либо внутривенно, либо внутриоболочечно или сочетанием данных методов. Если требуется, пептиды могут назначаться как однократной дозой, так и последовательно в виде нескольких доз.

В то время как в описании изобретения детально и подробно изложены предпочтительные варианты его осуществления, нижеследующие примеры иллюстрируют, но не ограничивают изобретение.

Пример 1.

Нейтрализация антител к МВР человека in vitro.

Фиг. 1 показывает локализацию 18 пептидов человеческого МВР, используемых в этом опыте, по отношению к молекуле интактного МВР. Нативный МВР был выделен из ткани мозга, не пораженного рассеянным склерозом (MS) (Diebler, О. Е., Martenson, R. Е., Kies, W. W. Prep Biochem 2: 139-165, 1972) и далее очищен гель-фильтрацией. Конечные антигенные препараты были проверены на чистоту SDS-электрофорезом в полиакриламидном геле. В дальнейших исследованиях использовались только те препараты, которые перемещались соответственно молекулярному весу 18.5 кД. Очищенный МВР был использован в антиген-специфичной аффинной хроматографии, в опытах по нейтрализации и в твердофазном радиоиммуноисследовании при использовании анти-МВР.

Восемнадцать пептидов, перекрывающих МВР человека и содержащих от 8 до 25 аминокислотных остатков, были синтезированы F_moc-методом, как было описано ранее (Groome, N. P., Dawkes, A, Barry, R. et al. J. Neurommun 19: 305-315, 1988). Чистота пептидов проверялась обратнофазовой жидкостной хроматографией высокого давления на колонке С 18 и при градиенте вода/ацетонитрил (0.1% Т А). Аминокислотный анализ пептидов был также осуществлен с помощью стандартных приемов. Многие пептиды, использованные в этом опыте, содержали остаток неприродного цистеина, т. к. они были синтезированы, чтобы функционировать в качестве иммуногенов. Маловероятно, чтобы это повлияло на сделанные выводы.

Спинномозговая жидкость была получена в течение недели от момента появления начальных симптомов у 35 больных с острыми рецидивами (MS), и уровни IgG определялись нефелометрически. Для этого опыта отбирались образцы CSF с первоначально абсолютно высокими уровнями IgG (≥80 г/л) и повышенными титрами анти-МВР (F/B отношение > 1.0). Все больные имели клинически определенное заболевание.

IgG был выделен из концентрированной спинномозговой жидкости больных с острым рассеянным склерозом на протеин А-сефарозе (Pharmacia^TM) аффинной хроматографией, как описано ранее (Warren, К. G., and Catz, I. J. Neurol Sci 96: 19-27, 1990). Чистота каждого препарата IgG проверялась электрофорезом в полиакриламидном геле и изоэлектрическим фокусированием. Когда повышенные уровни анти-МВР из очищенного IgG были абсорбированы МВР до нулевого значения, полученные после абсорбции супернатанты содержали остаточные количества IgG.

Очищенный МВР связывали с активированной BrCN сефарозой 4В (Pharmacia) в соответствии с инструкцией производителя. Очищенный IgG из CSF от 35 больных с острой формой рассеянного склероза (MS) использовался как исходный материал для выделения несвязанных анти-МВР с помощью аффинной хроматографии на МВР-сефарозе (Warren, К. G., and Catz, I. J. Neurbl/ Scil03: 90-96, 1991). Очищенные образцы анти-МВР сравнивались с исходным источником IgG с помощью электрофореза в полиакриламидном геле. Когда очищенные анти-МВР были абсорбированы до нулевого значения с помощью МВР, полученные после абсорбции супернатанты не содержали остаточных IgG.

Постоянные количества анти-МВР (с целью расширения шкалы 15 единиц связывания радиоактивности приняты за 100%) инкубировали с повышенными количествами человеческого МВР (0-10000 нг) или отдельными пептидами МВР (0-10000 нг) в жидкофазном исследовании и после 1.5 часов инкубации содержание (уровень) свободных анти-МВР определялось во всех смесях. Анти-МВР, выведенные отдельно от 7 больных MS, или объединенную фракцию анти-МВР от 10 различных больных использовали в экспериментах по нейтрализации. Гистон тимуса теленка и альбумин сыворотки человека использовались как негативные антигенные контроли (пределы: 10-1000 нг).

Одно моноклональное антитело к пептиду МВР 64-78 (клон 26) и поликлональная антисыворотка кролика к пептиду МВР 1-8 (R 155) использовались как позитивные контроли на антитела (Groome, N., Harland, J. and Dawkes, A, Neurochem Int. 7: 309-317, 1985; Barry, R., Payton, M. And Groome N., Neurochem Int 2: 291-300, 1991). Другое моноклональное антитело мыши к эпитопу 45-50 (клон 16) использовалось как негативный контроль на антитела.

Уровни анти-МВР определяли твердофазным радиоиммуноисследованием при использовании МВР человека (Warren, К. G. And Catz, I, Ann. Neurol 209: 20-25, 1986; Warren, К. G. And Catz I, Ann. Neurol 21: 183-187, 1987; Warren, К. G. And Catz, I, J. Neurol Sci 91: 143-151, 1989). Содержание свободных анти-МВР измеряли во всех фракциях, полученных при аффинной хроматографии, и во всех реакционных смесях, используемых для нейтрализации. Все индивидуальные пробы исследовали четыре раза с использованием одного и того же иодинированного материала для того, чтобы минимизировать вариабельность результатов между опытами.

Очищенные анти-МВР были полностью нейтрализованы МВР и пептидами МВР 80-97, МВР 91-106 и МВР 75-95 и были частично нейтрализованы пептидами МВР 64-78, МВР 69-83 и МВР 61-75 (Табл. 1 и фиг. 2). Оставшиеся 12 пептидов не нейтрализовали очищенные анти-МВР, и их кинетические кривые показывают спад в пределах заштрихованной области, см. фиг. 2. Гистон тимуса теленка и альбумин сыворотки человека не реагировали с очищенными анти-МВР даже при концентрациях выше 1000 нг. Клон 26 ингибировался только пептидом МВР 64-78. R 155 ингибировался только пептидом МВР 1-8. Клон 16 не реагировал ни с МВР, ни с другими пептидами (для чистоты изображения, данные контроля не приведены). Контрольные образцы показывают обоснованность подхода в отношении нейтрализации, так как каждое контрольное антитело было абсолютно нейтрализовано выбранным пептидом и никакими другими. Это показывает, что специфичность взаимодействия имеет место даже при высоких концентрациях пептидов (10 000 нг).

Анти-МВР, полученные от 7 разных больных, были полностью нейтрализованы МВР человека и пептидами МВР 80-97, МВР 91-106 и МВР 75-95 (см. фиг. 3 как иллюстрацию). Поскольку полученное от отдельных пациентов количество антител было ограничено, анти-МВР не подвергали реакции с остальными 15 пептидами.

Как указано выше, анти-МВР были нейтрализованы пептидами, соответствующими промежутку между 61-106 аминокислотными остатками. Пептиды, которые не нейтрализовали анти-МВР, охватывают аминоконцевой (примерно от 1 до 63 остатков) и карбокси-концевой (примерно от 117 до 162 остатка) участки МВР человека. По- видимому, пептиды от различных не перекрывающихся участков МВР нейтрализуют одни и те же антитела. Это может объясняться тем, что антитела узнают прерывистый эпитоп, содержащий аминогруппы различных участков. Подобный факт ранее наблюдался Hruby et al. (Hruby, S., Alvord, Е. С., Groome, N. P. et al., Molec Immun 24: 1359-1364, 1987), который показал, что крысиное моноклональное антитело имеет основной эпитоп в последовательности МВР 112-121 и в то время сильную перекрестную реактивность с другим эпитопом 39-91. Это более вероятно, чем возможность того, что антитело имеет перекрестную реактивность по отношению к двум совершенно различным последовательностям, которые не образуют прерывистого эпитопа (Hruby, S., Alvord, Е. С. , Alvord, Е. С., Marteuson R. Е. et al, J. Neurochem 44: 637-650, 1985). Данные по нейтрализации могут быть объяснены способностью пептидов, соответствующих различным участкам МВР, частично занимать связывающую область антитела, взаимодействуя с различными аминокислотами в боковых цепях. Это объяснение подтверждается тем наблюдением, что пептиды, обеспечивающие полное ингибирование (МВР 80-97, МВР 91-106 и МВР 75-95), приблизительно в 100 раз менее эффективны в молярном отношении, чем интактный МВР. Исходя из вышеизложенной гипотезы, это могло быть обусловлено тем, что каждый пептидный клон не способен достичь энергии связывания с действительным эпитопом МВР.

Пример 2.

Нейтрализация или модулирование образования антител к МВР человека, in vivo
Подбор больных и контрольные исследования
Больные, которых подобрали для данного исследовательского проекта, наблюдались в клинике по уходу и исследованию больных рассеянным склерозом Университета Альберты, Эдмонтон, Канада. Пациенты были продиагностированы как больные рассеянным склерозом по критерию Шумахера (1965) с подтверждением диагноза методом получения изображения мозга с помощью магнитного резонанса и/или иммунохимическими профилями спинномозговой жидкости (CSF). Для того, чтобы проиллюстрировать, что при хронически прогрессирующем рассеянном склерозе (MS) уровень анти-МВР устойчиво повышен в течение продолжительных периодов времени, от месяцев до нескольких лет, у больных повторно брали пункции CSF поясничного отдела с контролем свободных и связанных анти-МВР. У больных с хронически прогрессирующим заболеванием (MS) уровень аутоантител остается устойчиво повышенным в течение 11 лет и спонтанного спада уровня анти-МБР не происходит (фиг. 14 как иллюстрирующий пример).

Для того, чтобы определить, что изначально повышенные уровни анти-МВР в спинномозговой жидкости (CSF) оставались относительно постоянными в течение 24 часов, у двух больных (IF56 и 3М66) брали образцы CSF каждые 30 мин в течение 2 часов так же, как 24 часами позже, с контролированием свободной и связанной форм анти-МВР (фиг. 5А и 5В соответственно). Больные 1F56 и 3М66 служили в качестве временных контролей. Уровни свободных и связанных анти-МВР оставались неизменно повышенными при исследованиях CSF каждые 30 мин в течение 2-х часов так же, как и спустя 24 часа.

Кроме того, подобным образом был определен эффект введения 5 см³ физиологического раствора в спинномозговую жидкость двум другим больным (4М45 и 5М59) (фиг. 5С и 5Д соответственно). Эти больные служили в качестве временных контролей с физиологическим раствором. При введении 5 см³ физиологического раствора внутриоболочечно уровни F и В анти-МВР оставались повышенными по сравнению с базовым уровнем, когда образцы CSF исследовались, как описано выше, подтверждая таким образом, что "эффект разведения" на титры анти-МВР был незначительным.

Уровни анти-МВР определяли твердофазным радиоиммунологическим анализом с МВР человека, адсорбированным в лунках панели для микротитрования "Иммунлон". Лунки покрывали 100 мкл МВР в концентрации 10 мкг/мл (1 мкг/лунку) и инкубировали в течение ночи при 37^oC. После нанесения BSA и трехкратного отмывания водой панели выдерживались при комнатной температуре. Образцы (100 мкл) CSF или экстракта ткани, растворенные в 0.010 г lgG/л (0.01 М PBS буфер, 0.05% Твин 20), инкубировали в МВР-покрытых ячейках в течение 1-2 часов при комнатной температуре. После пяти отмываний буфером (0.01 М PBS, 0.05% Твин 20) ячейки инкубировали с антителами козы к IgG-Fc кролика (0.01 М PBS, 0.05% Твин 20, 0.5% BSA) в течение 1 часа при комнатной температуре и затем отмывали, как описано выше. Наконец, добавляли меченый ¹²⁵I-протеин А (или ¹²⁵I-протеин G) и инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре. Когда в качестве метки использовали ¹²⁵I-протеин G, BSA в буфере для исследований и для процедуры истощения заменяли на овальбумин. После трехкратного завершающего отмывания водой лунки обсчитывали индивидуально. Результаты, выраженные в единицах радиоактивности, представляли следующим образом: (счет образца - счет контроля) - (общий счет радиоактивности - счет контроля). Все образцы исследовали в 10 повторах, и время счета составляло 10 мин для того, чтобы зарегистрировать > 10000 единиц радиоактивности в каждом положительном образце.

Перед исследованием все образцы CSF и/или образцы ткани разводили до конечной концентрации IgG 0.010 г/л. Свободные (F) анти-МВР определяли непосредственно в CSF или тканевом экстракте, тогда как уровни связанных антител определяли после кислотного гидролиза иммунных комплексов. Неспецифичное связывание наблюдалось для каждого образца в непокрытых лунках. С целью локализации эпитопа синтетические пептиды сначала подвергали взаимодействию с очищенными антителами в жидкофазном конкурентном исследовании, после чего анти-МВР определяли радиоиммунологическим анализом во всех конечных смесях. Результаты анализов конкурентного связывания и радиоиммуноанализа выражали как % ингибирования синтетического пептида, определенный как 100 единиц радиоактивности. Пробы исследовались в 10 повторах и обсчитывались в течение 10 мин на LKB1275 Minigamma-счетчике. Объединенные выделенные из ткани анти-МВР использовались в 5 предварительно приготовленных разведениях в качестве позитивных контролей. CSF, собранная от больных с не неврологическими заболеваниями, служила негативным контролем. Воспроизводимость исследований составляла от 3% до 5%, а разброс данных менее 7%.

Определение постоянной повышенных уровней анти-МВР в CSF в контрольных экспериментах составило следующую стадию исследования.

Контрольный "слепой" эксперимент фазы 1 с дублированным пептидом-внутриоболочечная инъекция
Проводят фазу 1 эксперимента по определению действия синтетического пептида МВР 75-95 на титры F и В анти-МВР в спинномозговой жидкости. После утверждения в Научном Совете по этике Университета Альберты проект был осуществлен при участии больных с клинически установленным диагнозом рассеянного склероза (MS) (Schumacher et al., Ann NY Acad. Sci., 122, 552-568, 1965), тяжелобольных инвалидов с сильно прогрессирующим заболеванием. Четырнадцать больных согласились добровольно участвовать в этом исследовании; 8 больных были отобраны по начальному титру F анти-МВР в CSF (около 8 единиц радиоактивности) (Табл. 2) для получения одной внутриоболочечной инъекции либо пептидов МВР 75-95, которые связывают анти-МВР in vitro, либо не связывающего контрольного пептида МВР 35-58 (Warren and Catz, 1993 b). Эксперимент проводили методом двойного "слепого" варианта, когда ни исследователи, ни испытуемые не знали природы вводимого вещества. Все пептиды были закодированы семью наугад выбранными однозначными номерами посторонним врачом. Парные пептиды, растворенные в 5 см³ физиологического раствора и введенные в CSF путем поясничной пункции, использовались в возрастающих дозах (1, 2.5, 5 и 10 мг). CSF исследовалась до инъекции (базовая линия), с 30 минутными интервалами в течение 2 часов после инъекции, 24 часами позже и затем с предельным интервалом в течение 3-4 недель до тех пор, пока уровни анти-МВР не вернулись к базовому (исходному). Подсчет клеток, общий белок, глюкоза, уровни IgG и альбумина были определены во всех образцах CSF. Уровни свободных и связанных анти-МВР определяли радиоиммуноанализом, как описано выше.

Табл. 2: Клинические данные и уровни анти-МВР в CSF у 14 больных с хронически прогрессирующим рассеянным склерозом (MS), давших согласие участвовать в фазе 1 научного исследования, предусматривающего внутриоболочечную однократную инъекцию синтетических пептидов МВР. Поскольку был необходим исходно высокий уровень свободных (F) анти-МВР (> 8 единиц радиоактивности) для того, чтобы получить значительное постинъекционное изменение, для исследования было отобрано только 8 из 14 больных.

Все пептиды, используемые в данных исследованиях, синтезировались под кодом "продукт хорошего качества" (GMP) на основе F_moc (9-метоксикарбонил) метода Procyon Inc. (L. Ontario, Canada). Чистоту пептидов контролировали жидкостной обратнофазовой хроматографией на колонке С 18 при водно-ацетонитрильном градиенте, содержащем 0.1% ТХУ. Масс-спектроскопия и аминокислотный анализ выполнялся на основе стандартных методик. Перед введением все пептиды тестировались на пирогенность (Ванкуверский Генеральный госпиталь, Ванкувер, Канада), стерильность (местная лаборатория Общественного Здравоохранения Северной Альберты, Эдмонтон, Канада) и острую токсичность (Служба Лаборатория медицинских исследований Университета Альберты, Канада). Было показано, что они "пригодны" для введения людям. Соответствующие количества закодированных синтетических пептидов растворяли в 5 см³ стерильного физиологического раствора (0.9% NaCl, инъекция USP, апирогенный, Baxter Corp, Toronto, Canada) фильтровали 2 раза через стерилизующую мембрану с размером пор 0.22 мкм (Millex-GX, Millipore Corp., Bedford, М A, USA) и вводили в спинномозговую жидкость (CSF) путем поясничной инъекции.

Сравнительные (между пациентами) исследования пептидов
Больные 6F33, 8М41, 4М45 и 1F56 получали синтетический пептид МВР 75-95, способный связывать анти-МВР in vitro, а пациенты 10F36, 13F43, 5М59 и 3М66 получали "контрольный" несвязывающий синтетический пептид МВР 35-58 в возрастающих дозах 1, 2.5, 5 и 10 мг соответственно (фиг. 6). У больного 6F53 (фиг. 6В), который получил 1 мг МВР 75-95, наблюдалось 75% уменьшение свободных анти-МВР с немедленным возвращением их к исходному уровню; у больного 8М41 (фиг. 6D), который получил 2.5 мг МВР 75-95, наблюдалось полное связывание-нейтрализация свободных анти-МВР, а затем их уровень вернулся к исходному через 24 часа; у больного 4М45 (фиг. 6F), которому ввели 5 мг МВР 75-95, произошло резкое и полное связывание-нейтрализация свободных анти-МВР, что продолжалось в течение 7 дней с возвратом к исходному уровню, как было установлено, спустя 21 день; у больного 1F56 (фиг. 6H), которому ввели 10 мг МВР 75-95, также произошло полное связывание-нейтрализация свободных анти-МВР, что продолжалось в течение 7 дней и затем уровень антител вернулся к исходным значениям, как было установлено, в период с 14 по 28 день. Уровни связанных анти-МВР несущественно изменялись при однократном внутриоболочечном введении МВР 75-95. У больных 10F38, 13F43, 5М59 и 3М66, которым было введено соответственно 1, 2.5, 5 и 10 мг контрольного несвязывающего пептида МВР 35-58, уровни свободных и связанных антител в CSF оставались измененными по отношению к исходному в течение 24 часов эксперимента (фиг. 6A, 6C, 6E и 6G соответственно). Традиционные CSF-параметры воспаления при MS, такие как счет клеток, абсолютные уровни общего белка, IgG и альбумина, олигоклональное связывание, индекс IgG и синтез IgG в CNS, оставались неизменяемыми до и после введения пептида.

Сравнительные исследования пептидов при введении одному пациенту
Эти исследования проводились для того, чтобы минимизировать вариабельность результатов полученных исследований нескольких больных. У больного 5М59, которому вводили либо физиологический раствор (временный контроль), либо 5 мг несвязывающего пептида МВР 35-58, уровни свободных анти-МВР оставались повышенными относительно исходного уровня во время обоих экспериментов (фиг. 7А). Больному 4М45 первоначально вводили физиологический раствор (временный контроль), а двумя месяцами позже ему ввели 5 мг МВР 75-95. Уровни свободных больных анти-МВР оставались устойчиво повышенными во всех образцах, собранных во время контрольного эксперимента, и стали необнаруживаемыми после введения МВР 75-95 (фиг. 7В). Подобные результаты были получены и у больной 1F56, которая имела устойчиво повышенные уровни свободных антител в течение контрольного эксперимента, а после введения 10 мг МВР 75-95 ее свободные анти-МВР стали необнаруживаемыми, (фиг. 7С). Полное исследование было проведено с больным 3М66. У него уровни свободных анти-МВР были устойчиво повышенными в течение контрольного эксперимента или при введении 10 мг МВР 35-58; однако, когда были введены 10 мг МВР 75-95, свободные анти-МВР были полностью нейтрализованы и не обнаруживались в течение 7 дней (фиг. 7D).

Повторное введение синтетического пептида МБР 75-95
После установления того, что пептид МВР 75-95 нейтрализует свободные анти-МВР in vivo за период, больший чем 7 суток, было принято решение о повторном введении 10 мг МВР 75-95 в спинномозговую жидкость еженедельно в течение 10 недель. Этот эксперимент был проведен с участием трех больных с прогрессирующим рассеянным склерозом (MS), которые не участвовали в эксперименте по однократному введению пептидов и дали согласие на это исследование. Свободные и связанные анти-МВР определялись за 1-2 недели до первого введения, до и после 30 мин после каждой инъекции и вновь спустя 1 и 2 месяца после последней инъекции. Счет клеток, общий белок, глюкозу, IgG и альбумин определяли во всех образцах CSF, полученных перед каждой из 10 инъекций. Перед первой и после последней инъекции отбирали кровь и анализировали содержание электролитов, креатинина, ферментов сердца и печени и гематологические показатели.

Когда больные хронически прогрессирующей формой рассеянного склероза (MS) получали повторные внутриоболочечные инъекции 10 мг МВР 75-95 с недельным интервалом (в течение периода до 10 недель), первоначально высокий уровень свободных анти-МВР мог становиться необнаруживаемым, пока вводился пептид; когда пептид прекращали вводить, уровень свободных анти-МВР возвращался на исходный в течение 1-2 месяцев (фиг. 8). Титры связанных антител оставались устойчиво повышенными на протяжении всего эксперимента.

Больные, которые участвовали в этих исследованиях и которые получали либо однократные инъекции синтетических пептидов, либо повторяемые еженедельно инъекции, имели хронически прогрессирующий рассеянный склероз с повышенной степенью неврологических повреждений.

Ни один из этих больных не сообщил об ухудшении неврологических симптомов или об обострениях болезни (MS), последовавших в результате внутриоболочечного введения пептидов, и клеточная реакция в GSF не развивалась. Больные, получавшие повторные введения МВР 75-95 контролировались на развитие возможных соматических осложнений, включая изменения электролитов, так же и дисфункцию сердца, печени, почек и гематологические изменения, и никаких нежелательных осложнений не было выявлено.

Внутривенное ведение МВР 75-95
После установления того факта, что внутриоболочечное введение пептида МВР 75-95 приводит к связыванию свободных анти-МВР без изменения уровня связанных антител, было решено определить влияние внутривенного введения того же пептида на титры в CSF свободных и связанных анти-МВР; 500 мг МВР 75-95 растворяли в 100 см³ физиологического раствора и вводили внутривенно спустя 30 мин больному 8М41 при постоянном контроле анти-МВР в CSF каждые 30 мин в течение первых двух часов, 18 часов спустя и 10, 16 и 30 дней спустя. Кровь отбирали перед инъекцией, а также через 16 и 30 дней и анализировали на содержание электролитов, креатинина, сердечных и печеночных ферментов и гематологические показатели. В спинномозговой жидкости определяли количество клеток, общий белок, глюкозу, содержание IgG и альбумина. Как показано на фиг. 8, внутривенное введение 500 мг МВР 75-95 не дает никаких изменений в уровнях титров связанных и свободных анти-МВР в CSF на протяжении первых двух часов; 30%-ное падение уровня свободных анти-МВР в CSF наблюдалось через 18 часов. Когда CSF повторно подвергалась анализу через 10, 16 и 30 дней, уровни свободных и связанных анти-МВР опускались ниже исходного с 11 единиц радиоактивности до 4, 2 и 1 радиоактивных единиц соответственно.

При повторных наблюдениях у пациентов с внутриоболочечными инъекциями МВР часто наблюдалась устойчивость повышенных уровней связанных антител, тогда как свободные анти-МВР были необнаруживаемыми после внутриоболочечной инъекции МВР 75-95. Это свидетельствует о том, что воспалительный процесс, вызванный аутоантителами к МВР, остается активным во время и после внутриоболочечного введения МВР 75-95. Для подтверждения этого наблюдения МВР 75-95 был введен внутривенно пациенту, который предварительно получил внутриоболочечную инъекцию пептида. После внутривенного введения уровни и свободных и связанных антител в CSF значительно снижались при наблюдении в течение месяца. Снижение как свободных, так и связанных антител CSF после внутривенного введения МВР 75-95 означает, что имеет место снижающая регуляция аутоиммунного воспалительного процесса, ответственного за синтез анти-МВР.

МВР эцитоп для анти-МВР при MS
Для определения локализации МВР эпитопа для анти-МВР при MS свободные и связанные анти-МВР, очищенные аффинной хроматографией из CSF и ткани мозга больных рассеянным склерозом (MS) (Warren К. G., et al., Ann. Neurol. 35, 280-283, 1994), подвергали взаимодействию в исследованиях по конкурентному ингибированию с 41 последовательным синтетическим пептидом МВР равной длины (каждый пептид состоит из 10 остатков и перекрывает соседний на 9 остатков), занимающих участок между 61 и 110 остатками МВР человека. Было установлено, что пептид(ы), обеспечивающие максимальное ингибирование, наиболее прочно соединяются с антиген-связывающей областью антитела.

Максимальное ингибирование (≥80%) очищенных свободных и связанных анти-МВР из ткани мозга больного рассеянным склерозом (фиг. 10) обеспечивалось четырьмя декапептидами, обозначенными МВР 84-93, МВР 85-94, МВР 86-95 и МВР 87-96, позволяя предположить, что эпитоп МВР для анти-МВР локализован между 84 и 96 остатками. Минимальный участок общих аминокислотных остатков находится между 87 и 93 остатком.

Связанные антитела имеют более ограниченную направленность, чем свободные антитела.

Роль антител к анти-МВР в патогенезе демиелинизации при рассеянном склерозе еще не установлена и может единственно быть определена модулированием анти-МВР in vivo и последовательным наблюдением за клиническими и патологическими проявлениями. Например, во время острых стадий MS, когда отношение свободных и связанных антител выше 1, пептид, который известен как связывающий свободные анти-МВР, может быть введен внутриоболочечно для того, чтобы связать свободно циркулирующие антитела и скорригировать клинические симптомы острого рецидива; еженедельное введение может быть необходимо до наступления ремиссии. Для больных с хронически прогрессирующим заболеванием внутривенное введение пептида, так же, как и внутриоболочечное ведение, может быть необходимо для регулирования механизмов воспаления, которые вызваны анти-МВР.

Различные модификации предпочтительных вариантов осуществления изобретения могут быть выполнены без ограничений объема изобретения, который охватывается приведенными ниже пунктами формулы.

Описывается новый пептид или его соли, способный нейтрализовать или модулировать образование антител к миелиновому основному белку, имеющий формулу I R₁-Val-His-Phe-Phe-Lys-Asn-Ile-R₂, где R₁ выбрано из группы, включающей Asn-Pro-Val-; Pro-Val-; Val-; Lys-Ser-His-Gly-Arg-Thr-Gln-Asp-Glu-Asn-Pro-Val-; Thr-Gln-Asp-Glu-Asn-Pro-Val-; водород и гидрокси; R₂ выбрано из группы, включающей -Val; -Val-Thr; -Val-Thr-Pro; -Val-Thr-Pro-Arg-, водород и гидрокси, при условии, что R₁ и R₂ одновременно не являются водородом или гидроксилом, при этом данный пептид содержит замещения, добавления или делеции. Описывается также фармацевтическая композиция на основе соединения общей формулы (I) и способ лечения рассеянного склероза. Технический результат - повышение эффективности при лечении рассеянного склероза. 3 с. и 5 з.п.ф-лы, 10 ил., 2 табл.

1. Пептид или его соли, способный нейтрализовать или модулировать образование антител к миелиновому основному белку, имеющий формулу
R₁-Val-His-Phe-Phe-Lys-Asn-Ile-R₂,
где R₁ выбрано из группы, включающей Asn-Pro-Val-; Pro-Val-; Val-; Lys-Ser-His-Gly-Arg-Thr-Gln-Asp-Glu-Asn-Pro-Val-; Thr-Gln-Asp-Glu-Asn-Pro-Val-; водород; гидрокси;
R₂ выбрано из группы, включающей Val; Val-Thr; Val-Thr-Pro; Val-Thr-Pro-Arg-; водород; гидрокси,
при условии, что R₁ и R₂ одновременно не являются водородом или гидроксилом, при этом данный пептид содержит замещения, добавления или делеции. 2. Пептид по п.1, отличающийся тем, что когда R₁ Asn-Pro-Val-, R₂ - водород или гидрокси; когда R₁ Pro-Val-, R₂ - Val; когда R₁ Val-, R₂ - Val-Thr; когда R₁ водород или гидрокси, R₂ - Val-Thr-Pro; когда R₁ Lys-Ser-His-Gly-Arg-Thr-Gln-Asp-Glu-Asn-Pro-Val-, R₂ - Val-Thr; когда R₁ Thr-Gln-Asp-Glu-Asn-Pro-Val-, R₂ - Val-Thr-Pro-Arg. 3. Фармацевтическая композиция, активная против рассеянного склероза, включающая пептид или его соли, способный нейтрализовать или модулировать образование антител к милеиновому основному белку, один или в комбинации, в смеси с фармацевтически приемлемым носителем, у которого указанный пептид имеет формулу
R₁-Val-His-Phe-Phe-Lys-Asn-Ile-R₂,
где R₁ выбрано из группы, включающей Asn-Pro-Val-; Pro-Val-; Val-; Lys-Ser-His-Gly-Arg-Thr-Gln-Asp-Glu-Asn-Pro-Val-; Thr-Gln-Asp-Glu-Asn-Pro-Val-; водород; гидрокси;
R₂ выбрано из группы, включающей Val; Val-Thr; Val-Thr-Pro; Val-Thr-Pro-Arg-; водород; гидрокси,
при условии, что R₁ и R₂ одновременно не являются водородом или гидроксилом, при этом данный пептид содержит замещения, добавления или делеции. 4. Фармацевтическая композиция по п.3, отличающаяся тем, что когда R₁ Asn-Pro-Val-, R₂ - водород или гидрокси; когда R₁ Pro-Val-, R₂ - Val; когда R₁ Val-, R₂ - Val-Thr; когда R₁ водород или гидрокси, R₂ - Val-Thr-Pro; когда R₁ Lys-Ser-His-Gly-Arg-Thr-Gln-Asp-Glu-Asn-Pro-Val-, R₂ - Val-Thr; и когда R₁ Thr-Gln-Asp-Glu-Asn-Pro-Val-, R₂ - Val-Thr-Pro-Arg. 5. Способ лечения рассеянного склероза путем назначения пациенту пептида или его соли, отличающийся тем, что указанный пептид имеет формулу
R₁-Val-His-Phe-Phe-Lys-Asn-Ile-R₂,
где R₁ выбрано из группы, включающей Asn-Pro-Val-; Pro-Val-; Val-; Lys-Ser-His-Gly-Arg-Thr-Gln-Asp-Glu-Asn-Pro-Val-; Thr-Gln-Asp-Glu-Asn-Pro-Val-; водород; гидрокси;
R₂ выбрано из группы, включающей Val; Val-Thr; Val-Thr-Pro; Val-Thr-Pro-Arg-; водород; гидрокси,
при условии, что R₁ и R₂ одновременно не являются водородом или гидроксилом, при этом данный пептид содержит замещения, добавления или делеции. 6. Способ по п.5, отличающийся тем, что когда R₁ Asn-Pro-Val-, R₂ - водород или гидрокси; когда R₁ Pro-Val-, R₂ - Val; когда R₁ Val-, R₂ - Val-Thr; когда R₁ водород или гидрокси, R₂ - Val-Thr-Pro; когда R₁ Lys-Ser-His-Gly-Arg-Thr-Gln-Asp-Glu-Asn-Pro-Val-, R₂ - Val-Thr; и когда R₁ Thr-Gln-Asp-Glu-Asn-Pro-Val-, R₂ -Val-Thr-Pro-Arg. 7. Способ по п. 5, отличающийся тем, что пептид вводят внутривенно с помощью поясничной пункции, орально или комбинацией данных методов. 8. Способ по п. 5, отличающийся тем, что пептид вводят внутривенно в дозе, варьирующей от 1 мг/кг веса тела до 10 мг/кг веса тела, однократно или последовательно несколько раз в случае необходимости.