ШТАММ БАКТЕРИЙ TRICHODERMA LIGNORUM Л-1 ГКМ ВИЗР N 103 ДЛЯ ОКИСЛЕНИЯ УГЛЕВОДОРОДОВ НЕФТИ И НЕФТЕПРОДУКТОВ Российский патент 2000 года по МПК C12N1/26 B09C1/10 C12N1/26 C12R1/885 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к очистке объектов окружающей среды от загрязнений нефтью и нефтепродуктами при помощи микроорганизмов, и может быть использовано для получения биопрепаратов для очистки почв и поверхностных вод от нефтяных загрязнений, а также для ликвидации аварийных разливов нефти.

Известны нефтеокисляющие штаммы бактерий Acenitobacter, (патент РФ N 2053204 по кл. С 02 F 3/34 от 12.04.94 г., и Mycobacterium, см. патент РФ N 2053206 по кл. С 02 F 3/34 от 29,09.94 г.), применяемые для биодеструкции углеводородов нефтепродуктов в окружающей среде.

Однако эти штаммы недостаточно эффективны.

Наиболее близким техническим решением (прототипом) являются штаммы Pseudomonas putida ПИ К₀-1, Pseudomonas fluorescens П-896 и Micrococcus ПИ К_y-1, которые используются в качестве аэробных нефтеокисляющих бактерий для создания биопрепарата для очистки от нефти и нефтепродуктов. Штаммы имеют достаточную активность при pH от 4,5 до 8,5 и температуре от 10^oC до 40^oC (патент РФ N 2122980 по кл. С 02 F 3/34 от 12.04.94 г.).

Недостатком данных штаммов является относительно низкая нефтеокисляющая активность в отношении тяжелых высокомолекулярных соединений, входящих в состав углеводородов нефтепродуктов, в частности, би- и полициклических ароматических соединений, входящих в состав мазута.

Задачей настоящего изобретения является получение штамма бактерий, обладающих высокой нефтеокисляющей активностью в отношении тяжелых высокомолекулярных соединений, входящих в состав углеводородов нефтепродуктов, в частности, би- и полициклических ароматических соединений.

Для решения указанной задачи предлагается штамм бактерий Trichoderma lignorum Л-1 ГКМ ВИЗР N 103, обладающий высокой деструктивной активностью в отношении тяжелых высокомолекулярных соединений, в частности, би- и полициклических ароматических соединений, входящих в состав мазута.

Штамм бактерий Trichoderma lignorum Л-1 депонирован в Государственной Коллекции микроорганизмов Всероссийского научно-исследовательского института защиты растений (ГКМ ВИЗР) под номером 103 от 12.03.99 г.

Идентификация штамма проведена по определителю Н.М. Пидопличко Грибы-паразиты культурных растений. Киев, Наукова думка, 1977 г.

Штамм бактерий Trichoderma lignorum Л-1 выделен из загрязненной мазутом почвы, в пос. Кишкенай (Литовская республика) на территории Клайпедского филиала АО "ТОГ". Штамм выделен на селективной питательной среде, содержащей в качестве единственного источника питания углеводороды нефтепродуктов.

Штамм отселектирован и стабилизирован по признаку углеводородокисляющей активности в отношении нефти и нефтепродуктов.

Культурально-морфологические признаки.

На агаризованной среде Чапека колонии быстрорастущие, достигают 9 - 10 см в диаметре за 4 дня при 20^oC и за 3 дня при 25^oC. Культура образует белую, слаборазвитую мицелиальную пленку, затем скудные воздушные гифы с конидиальной зоной, в зрелом состоянии темно-зеленой. Обратная сторона колоний не окрашена. Мицелий состоит из бесцветных, гладких, септированных, сильно ветвистых гиф 1,5 х 12,0 мкм в диаметре. Хламидоспоры интеркалярные, реже верхушечные, на коротких боковых веточках, большей частью шаровидные, редко эллиптические, бесцветные, гладкие до 14 мкм в диаметре. Конидиеносцы сильно ветвистые, в компактных или рыхлых подушечках, в прерывистых или концентрических зонах, с главной осью около 4,5 мкм толщиной, с боковыми веточками, одиночными или в группах по 2 - 3, иногда расположенными нерегулярно, увеличивающимися в длине по мере удаления от вершины конидиеносца и несущими более мелкие боковые веточки, супротивные или неправильно расположенные. Все веточки отходят под широким углом. Стеригмы образуют ложные мутовки, кроме верхушечной стеригмы и групп, состоящих более чем из 2 - 3 стеригм, иногда они одиночные или супротивные по длине веточки. Изменчивы по величине, довольно длинные (8 - 14) х (2,4 - 3) мкм, но могут быть и до 20 мкм длиной, прямые или слегка согнутые, кеглевидные, суженные у основания, наиболее широкие чуть выше середины, потом суживаются в довольно длинную шейку. Конидии шаровидные, редко широкоэллиптические, слегка шероховатые, 3,6 - 4,5 мкм в диаметре или (4 - 4,8) х (3,5 - 4) мкм. На агаре Чапека с 0,5% кукурузным экстрактом, pH 5,0 - 6,0, колония радиально расходящаяся от центра, пушистая. Дерновинки бархатистые, белые, расположены густым газоном, на 4-5 сутки становятся матово-темно-зелеными. Обратная сторона колоний желтовато-бурая. На сусло-агаре, pH 5,0 - 6,0, морфологические особенности и характер роста аналогичны. Штамм хранят на косяках МПА или СПА при температуре (2 - 5)^oC или в лиофилизированном виде в ампулах.

Физиолого-биохимические признаки.

В качестве источников азота используют соли аммония, аминокислоты, пептон, растительные и дрожжевые гидролизаты; в качестве источника углерода используют сахарозу, глюкозу, крахмал, мелассу, зеленую патоку, углеводороды нефтепродуктов. Образует внеклеточные ферменты: хитиназу, протеазу, глюкозу. Обладает антагонистической активностью по отношению к фитопатогенным грибам p.p. Fusarium, Verticillium, Altemaria.

Для выращивания штамма использовали посевную и ферментационную среду следующего состава:
KH₂PO₄ - 2 г/л
Na₂HPO₄ - 3 г/л
MgSO₄•7H₂O - 0,5 г/л
FeSl₃•6H₂O - 0,05 г/л
CaCl₂•2H₂O - 0,01 г/л
(NH₄)₂SO₄ - 2 г/л
Соевая мука - 5 г/л
Меласса - 20 г/л
Вода - до 1 л
Посевной материал выращивали в колбах, процесс культивирования проводили в ферментерах V = 100 л при Т = 28^oC, pH 6,8 - 7,2 в течение 72 часов в аэробных условиях. В качестве индуктора использовали 0,01% сырую нефть.

Выращенную культуру использовали в опытах по оценке деструктивной активности штамма бактерий Trichoderma lignorum Л-1 в отношении би- и полициклических ароматических соединений, являющихся типичными представителями тяжелых высокомолекулярных соединений, входящих в состав углеводородов нефтепродуктов.

Нефтеокисляющую активность штамма оценивали ИК-спектрометрически с использованием прибора АН-2 по снижению концентрации углеводородов нефтепродуктов в образцах среды, содержащей би- и полициклических ароматических соединений, входящих в состав мазута.

Пример 1
Выделение и фракционирование тяжелых фракций нефтепродуктов из загрязненной мазутом почвы для получения образцов среды осуществляли следующим образом. Проводили экстракцию нефтепродуктов из почвы четыреххлористым углеродом, после чего растворитель отгоняли. Полученные нефтепродукты растворяли в петролейном эфире, через сутки из раствора отфильтровывали выпавшие в темный осадок асфальтены. Из отфильтрованного раствора производили сорбцию основной части ароматических углеводородов на окись алюминия, используемый в качестве сорбента, отделяя от смеси сумму парафиновой и олефиновой фракций. С сорбента с основной частью ароматических углеводородов проводили экстракцию моноциклических ароматических углеводородов, промывая сорбент тремя порциями н-гексана и дополнительно элюируя их остатки бензолом (3 мл) в хроматографической колонке (высота сорбента 5 см). Оставшиеся ароматические углеводороды элюировали с колонки смесью бензол-спирт (1:1), отгоняли растворитель. Затем смесь ароматических углеводородов растворяли в н-гексане, добавляя к раствору пятикратный объем спирта и 2 - 3 капли воды, энергично встряхивали и оставляли до разделения фаз. В верхний гексановый слой переходили ароматические углеводороды, в спиртовой фазе в виде эмульсии концентрировались азотистые, сернистые и другие полярные углеводороды.

Полученную таким образом смесь би- и полициклических ароматических углеводородов разделяли на колонке с высотой сорбента около 20 см ступенчатым элюированием смесью бензол-спирт с повышением полярности растворителя. Качество разделения би- и полициклических ароматических углеводородов контролировали, во-первых, по флуоресценции ароматических соединений при облучении УФ-светом (моноциклические ароматические соединения флуоресцируют синим светом, бициклические ароматические углеводороды - зеленым, а полициклические углеводороды - желтым при облучении синим светом), и во-вторых, рефрактометрически: бициклические соединения имеют коэффициент преломления = 1,54-1,58; полициклические - >1,58.

Выделенные бициклические ароматические соединения добавляли в жидкую питательную среду следующего состава:
KH₂PO₄ - 2 г/л
Na₂HPO₄ - 3 г/л
MgSO₄x7H₂O - 0,5 г/л
FeCl₃ • 6H₂O - 0,05 г/л
CaCl₂ • 2H₂O - 0,01 г/л
(NH₄)₂SO₄ - 2 г/л
Соевая мука - 5 г/л
Меласса - 20 г/л
Вода - до 1 л
Штамм бактерий Trichoderma lignorum Л-1 засевали в колбы, содержащие 50 мл среды, исходная концентрация бициклических ароматических соединений составляла 18 - 22 мг/л, pH среды колебалось от 5,0 до 8,0. Штамм культивировали на качалке в диапазоне температуры от 15^oC до 25^oC в течение 30 суток. Содержание бициклических ароматических соединений в среде контролировали еженедельно. Результаты представлены в табл. 1.

Пример 2
Выделенные, как описано в примере 1, полициклические ароматические соединения добавляли в жидкую питательную среду аналогичного описанному в примере 1 состава.

Штамм бактерий Trichoderma lignorum Л-1 засевали в колбы, содержащие 50 мл среды, исходная концентрация полициклических ароматических соединений составляла 28 - 31 мг/л, pH среды колебалось от 5,0 до 8,0. Штамм культивировали на качалке в диапазоне температуры от 15^oC до 25^oC в течение 30 суток. Содержание полициклических ароматических соединений в среде контролировали еженедельно. Результаты представлены в табл. 2.

Проведенные опыты подтвердили весьма высокую деструктивную активность заявленного штамма в отношении тяжелых высокомолекулярных соединений, входящих в состав углеводородов нефтепродуктов, в частности, бициклических (до 93,6%) и полициклических (до 93,2%) ароматических соединений, входящих в состав мазута. При этом штамм эффективен при температурах (Т = 15 - 25^oC) в широком диапазоне pH (pH 5,0 - 8,0).

Биопрепарат на основе штамма бактерий Trichoderma lignorum Л-1 может быть получен промышленным способом с использованием стандартного биотехнологического оборудования с применением доступных сырьевых материалов.

Изобретение относится к биотехнологии, очистке объектов окружающей среды от загрязнения нефтью и нефтепродуктами. Штамм бактерий Trichoderma lignorum Л-1 выделен из загрязненной нефтепродуктами почвы, депонирован в ГКМ ВИЗР под номером 103. Штамм выращивают в жидкой питательной среде, содержащей минеральные соли, соевую муку и мелассу при 28°С и рН 6,8 - 7,2 в течение 72 ч в аэробных условиях. Деструктивная активность данного штамма против бициклических и полициклических ароматических соединений, входящих в состав мазута, составила 84,9 - 93,6% для бициклических и 90,1 - 93,2% для полициклических ароматических соединений, при этом штамм эффективен при температурах Т = 15 - 25°С в диапазоне рН 5,0 - 8,0. 2 табл.

Штамм бактерий Trichoderma lignorum Л-1 ГКМ ВИЗР 103 для окисления углеводородов нефти и нефтепродуктов.