ШТАММ БАКТЕРИЙ SERRATIA ODORIFERA A 3б ГКМ ВИЗР N 100 ДЛЯ ОКИСЛЕНИЯ УГЛЕВОДОРОДОВ НЕФТИ И НЕФТЕПРОДУКТОВ Российский патент 2000 года по МПК C12N1/26 B09C1/10 C12N1/26 C12R1/425 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к очистке объектов окружающей среды от загрязнения нефтью и нефтепродуктами при помощи микроорганизмов, и может быть использовано для получения биопрепаратов для очистки почв и поверхностных вод от нефтяных загрязнений, а также для ликвидации аварийных разливов нефти.

Известны нефтеокисляющие штаммы бактерий Acenitobacter (см. патент РФ N 2053204 по кл. С 02 F 3/34 от 12.04.94 г.), и Mycobacterium (см. патент РФ N 2053206 по кл. С 02 F 3/34 от 29.09.94 г.), применяемые для биодеструкции углеводородов нефтепродуктов в окружающей среде. Однако эти штаммы недостаточно эффективны.

Наиболее близким техническим решением (прототипом) являются штаммы Pseudomonas putida ПИ К_o-1, Pseudomonas fluorescens П-896 и Micrococcus ПИ К_y-1, которые используются в качестве аэробных нефтеокисляющих бактерий для создания биопрепарата для очистки от нефти и нефтепродуктов. Штаммы имеют достаточную активность при pH от 4,5 до 8,5 и температуре от 10 до 40^oC (см. патент РФ N 2122980 по кл. С 02 F 3/34 от 12.04.94 г.).

Недостатком данных штаммов является относительно низкая нефтеокисляющая активность в отношении тяжелых высокомолекулярных соединений, входящих в состав углеводородов нефтепродуктов, в частности, парафинов и олефинов, входящих в состав мазута.

Задачей настоящего изобретения является получение штамма бактерий, обладающих высокой нефтеокисляющей активностью в отношении тяжелых высокомолекулярных соединений, входящих в состав углеводородов нефтепродуктов, в частности, парафинов и олефинов.

Для решения указанной задачи предлагается штамм бактерий Serratia odorifera А 3б ГКМ ВИЗР N 100, обладающий высокой деструктивной активностью в отношении тяжелых высокомолекулярных соединений, в частности, парафинов и олефинов, входящих в состав мазута.

Штамм бактерий Serratia odorifera А 3б депонирован в Государственной Коллекции микроорганизмов Всероссийского научно-исследовательского института защиты растений (ГКМ ВИЗР) под номером 100 от 12.03.99 г. Идентификация штамма проведена по "Определителю микроорганизмов" Берги (1980 г.).

Штамм бактерий Serratia odorifera А 3б выделен из загрязненной мазутом почвы, в пос. Кишкенай (Литовская республика) на территории Клайпедского филиала АО "ТОГ". Штамм выделен на селективной питательной среде, содержащей в качестве единственного источника питания углеводороды нефтепродуктов.

Штамм отселектирован и стабилизирован по признаку углеводородокисляющей активности в отношении нефти и нефтепродуктов.

Культурально-морфологические признаки
На МПА и СПА культура образует непрозрачные белые или светло-кремовые колонии с ровным краем. При микроскопировании обнаруживаются подвижные с перитрихиальным жгутикованием палочки, не образующие спор. Размеры клеток (0,6 - 0,8) • (1,5 - 3,0) мкм. Штамм растет при температуре от 5 до 40^oC, оптимальная температура роста 25 - 32^oC. Штамм хранят на косяках МПА или СПА при температуре 2 - 5^oC или в лиофилизированном виде в ампулах.

Физиолого-биохимические признаки
Грамотрицательный (по щелочи). Факультативный анаэроб с дыхательным и ферментативным типом метаболизма. Не нуждается в факторах роста. Оксидазный тест отрицательный, каталазный тест положительный. Не продуцирует флюоресцирующий пигмент. Реакция Фогес-Проскауэра положительная. Обладает нитратредуцирующей способностью. Сероводород не образует, индол не образует, уреазу не разрушает. Аргинин дигидролаза отсутствует, триптофандеаминаза отсутствует. Лизин декарбоксилаза и орнитин декарбоксилаза присутствуют. Цитрат утилизирует, желатин гидролизует. Образует кислоту из целлобиозы. Ферментирует сахара: глюкозу, маннозу, инозитол, сорбит, рамнозу, сахарозу, мелибиозу, амигдалин, арабинозу. Утилизирует в качестве источника азота нитраты, соли аммония, аминокислоты, пептиды, дрожжевой гидролизат.

Для выращивания штамма и получения биопрепарата использовали посевную и ферментационную среду следующего состава:
KH₂PO₄ - 2 г/л
Na₂HPO₄ - 3 г/л
MgSO₄ • 7H₂O - 0,5 г/л
FeCl₃ • 6H₂O - 0,05 г/л
CaCl₂ • 2H₂O - 0,01 г/л
(NH₄)₂SO₄ - 2 г/л
Соевая мука - 5 г/л
Меласса - 20 г/л
Вода - До 1 л
Посевной материал выращивали в колбах, а процесс культивирования проводили в ферментерах V = 100 л при Т = 28^oC, pH 6,8 - 7,2 в течение 72 часов в аэробных условиях. В качестве индуктора использовали 0,01% сырую нефть.

Выращенную культуру использовали в опытах по оценке деструктивной активности штамма бактерий Serratia odorifera А 3б в отношении парафиновых и олефиновых фракций мазута, являющихся типичными представителями тяжелых высокомолекулярных соединений, входящих в состав углеводородов нефтепродуктов.

Нефтеокисляющую активность штамма оценивали ИК-спектрометрически с использованием прибора АН-2 по снижению концентрации углеводородов нефтепродуктов в образцах среды, содержащей парафиновые и олефиновые фракции мазута.

Пример 1.

Выделение и фракционирование тяжелых фракций нефтепродуктов из загрязненной мазутом почвы для получения образцов среды осуществляли следующим образом. Проводили экстракцию нефтепродуктов из почвы четыреххлористым углеродом, после чего растворитель отгоняли. Полученные нефтепродукты растворяли в петролейном эфире, через сутки из раствора отфильтровывали выпавшие в темный осадок асфальтены. Из отфильтрованного раствора производили сорбцию моноароматических углеводородов на окись алюминия, используемый в качестве сорбента. Полученную таким образом сумму парафиновой и олефиновой фракций разделяли на колонках с окисью алюминия, импрегнированной азотнокислым серебром. Для этого парафиновую фракцию элюировали гексаном, олефиновую фракцию вытесняли с колонки четыреххлористым углеродом; затем гексановый раствор парафиновой фракции концентрировали и повторно наносили на колонку с небольшим количеством окиси алюминия, а оставшуюся на колонке парафиновую фракцию вытесняли гексаном.

Выделенную парафиновую фракцию мазута добавляли в жидкую питательную среду следующего состава:
KH₂PO₄ - 2 г/л
Na₂HPO₄ - 3 г/л
MgSO₄ • 7Н₂О - 0,5 г/л
FeCl₃ • 6Н₂О - 0,05 г/л
CaCl₂ • 2H₂O - 0,01 г/л
(NH₄)₂SO₄ - 2 г/л
Соевая мука - 5 г/л
Меласса - 3 г/л
Вода - До 1 л
Штамм бактерий Serratia odorifera А 3б засевали в колбы, содержащие 50 мл среды, исходная концентрация парафиновых фракций мазута составляла 32-35 мг/л, pH среды колебалось от 5,0 до 8,0. Штамм культивировали на качалке в диапазоне температуры от 15 до 25^oC в течение 30 суток. Содержание парафинов в среде контролировали еженедельно. Результаты представлены в Таблице 1.

Пример 2.

Выделенную, как описано в примере 1, олефиновую фракцию мазута добавляли в жидкую питательную среду аналогично описанному в примере 1 состава. Штамм бактерий Serratia odorifera А 3б засевали в колбы, содержащие 50 мл среды, исходная концентрация в среде олефиновых фракций мазута составляла 23 - 25 мг/л, pH среды колебалось от 5,0 до 8,0. Штамм культивировали на качалке в диапазоне температуры от 15 до 25^oC в течение 30 суток. Содержание олефинов в среде контролировали еженедельно. Результаты представлены в Таблице 2.

Проведенные опыты подтвердили весьма высокую деструктивную активность заявленного штамма в отношении высокомолекулярных парафиновых (до 94,5%) и олефиновых (до 93,0%) фракций мазута. При этом штамм эффективен при температурах (Т = 15 - 25^oC) в широком диапазоне pH (pH 5,0 - 8,0).

Биопрепарат на основе штамма бактерий Serratia odorifera А 3б может быть получен промышленным способом с использованием стандартного биотехнологического оборудования с применением доступных сырьевых материалов.

Изобретение относится к биотехнологии, очистке объектов окружающей среды от загрязнения нефтью и нефтепродуктами. Штамм бактерий Serratia odorifera А 3б выделен из загрязненной нефтепродуктами почвы, депонирован в ГКМ ВИЗР под номером 100. Штамм выращивают в жидкой питательной среде, содержащей минеральные соли, соевую муку и мелассу, при 28°С и рН 6,8-7,2 в течение 72 ч. в аэробных условиях. Деструктивная активность штамма составляет от 90,3 до 94,5% для парафиновых фракций мазута и от 88,7 до 93,0% для олефиновых фракций. При этом штамм эффективен при температурах (Т = 15-25°С) в широком диапазоне рН (рН 5,0-8,0). 2 табл.

Штамм бактерий Serratia odorifera A 3б ГКМ ВИЗР 100 для окисления углеводородов нефти и нефтепродуктов.