ШТАММ БАКТЕРИЙ SERRATIA ODORIFERA JAP-1 ДЛЯ ОКИСЛЕНИЯ УГЛЕВОДОРОДОВ НЕФТИ И НЕФТЕПРОДУКТОВ Российский патент 2003 года по МПК C12N1/20 B09C1/10 C02F3/34 C12N1/20 C12R1/425 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к очистке объектов окружающей среды от загрязнения нефтью и нефтепродуктами при помощи микроорганизмов, и может быть использовано для получения биопрепаратов для очистки почв и поверхностных вод от нефтяных загрязнений, а также для ликвидации аварийных разливов нефти в условиях высокой концентрации солей тяжелых металлов.

Известны нефтеокисляющие штаммы бактерий Acenitobacter, см. патент РФ 2053204 по кл. С 02 F 3/34 от 12.04.94 г., и Mycobacterium, см. патент РФ 2053206 по кл. С 02 F 3/34 от 29.09.94 г., применяемые для биодеструкции углеводородов нефтепродуктов в окружающей среде. Однако эти штаммы недостаточно эффективны.

Известны также штаммы Pseudomonas putida ПИ К₀-1, Pseudomonas fluorescens П-896 и Micrococcus ПИ К_у-1, которые используются в качестве аэробных нефтеокисляющих бактерий для создания биопрепарата для очистки от нефти и нефтепродуктов. Штаммы имеют достаточную активность при рН от 4,5 до 8,5, см. патент РФ 2122980 по кл. С 02 F 3/34 от 12.04.94 г.

Известен штамм бактерий Bacillus cereus В 3б, обладающий высокой деструктивной активностью в отношении углеводородов нефти и нефтепродуктов при рН от 3,0 до 8,5, см. RU 2157843 от 31.05.1999.

Данное техническое решение принято в качестве прототипа настоящего изобретения.

Недостатком прототипа является относительно низкая нефтеокисляющая активность при высоких концентрациях солей тяжелых металлов.

Задачей настоящего изобретения является получение штамма бактерий, обладающих высокой нефтеокисляющей активностью в условиях загрязнения объектов окружающей среды солями тяжелых металлов.

Для решения указанной задачи предлагается штамм бактерий Serratia odorifera Jap-1, обладающий высокой деструктивной активностью в отношении углеводородов нефти и нефтепродуктов, толерантный к солям тяжелых металлов.

Штамм бактерий Serratia odorifera Jap-1 депонирован в Государственной коллекции микроорганизмов Всероссийского научно-исследовательского института защиты растений (ГКМ ВИЗР) под номером 150 от 18.06.2001. Идентификация штамма проведена по "Определителю микроорганизмов" Берги (1997г.).

Штамм бактерий Serratia odorifera Jap-1 выделен из загрязненной нефтепродуктами и солями тяжелых металлов почвы в префектуре г. Токио, Япония.

Штамм выделен на селективной питательной среде, содержащей в качестве единственного источника питания углеводороды нефтепродуктов.

Штамм отселектирован и стабилизирован по признакам:
углеводородокисляющая активность в отношении нефти и нефтепродуктов;
толерантность к солям тяжелых металлов при их высокой концентрации.

Культурально-морфологические признаки штамма: подвижные с перитрихиальным жгутикованием палочки, споры не образующие, 0,6-0,8•1,5-3,0 мкм. Грамотрицательные.

Биохимические признаки штамма. Факультативный анаэроб, с дыхательным и ферментативным типом метаболизма. Рост: 5-40^oС. Не нуждается в факторах роста. Оксидазный тест отрицательный. Каталазоположителен. Не продуцирует флуоресцирующий пигмент. Реакция Фогес-Проскауэра положительная. Обладает нитратредуцирующей способностью. Сероводород не образует. Индол не образует. Уреазу не разрушает. Аргинин дегидролаза отсутствует. Лизин декарбоксилаза присутствует. Орнитин декарбоксилаза присутствует. Цитрат утилизирует. Триптофан деаминаза отсутствует. Гидролизует желатин. Образует кислоту из целлобиозы. Ферментирует сахара: глюкозу, маннозу, инозитол, сорбит, рамнозу, сахарозу, мелибиозу, амигдалин, арабинозу.

Штамм хранят на косяках МПА при (2-5)^oС или в лиофилизированном виде в ампулах.

Для выращивания штамма и получения биопрепарата использовали посевную и ферментационную питательные среду следующего состава, г/л:
KH₂PO₄ - 2
Na₂HPO₄ - 3
MgSO₄•7H₂O - 0,5
FеСl₃•6Н₂О - 0,05
CaCl₂•2H₂O - 0,01
(NH₄)2SO₄ - 2
Соевая мука - 5
Меласса - 20
Вода - До 1 л
Посевной материал выращивали в колбах, а процесс культивирования проводили в ферментерах V= 100 л при Т=28^oС, рН=6,8-7,2 в течение 72 часов в аэробных условиях. В качестве индуктора использовали 0,01% сырую нефть. Затем глубинную культуру микроорганизма (10%) вносили в стерильный торф одновременно с минеральными добавками и проводили доращивание при Т=3^oС в течение 120 часов.

В качестве минеральных добавок использовали:
карбамид - 0,6 мас. %;
двойной суперфосфат - 0,3 мас. %;
сульфат калия - 1,5 мас.%
Титр полученного биопрепарата - 1•10¹² КОЕ/г.

Нефтеокисляющую активность штамма оценивали ИК-спектрометрически с использованием прибора АН-2 по снижению концентрации углеводородов нефтепродуктов в образцах почвы, содержащих высокие концентрации подвижных форм солей тяжелых металлов.

Пример 1
Биопрепарат на основе штамма бактерий Serratia odorifera Jap-1 вносили в керамические сосуды, наполненные грунтом с рН от 3,0 до 8,5 и содержанием мазута 37,8 до 39,6 г/кг. Концентрация солей тяжелых металлов существенно превышала предельно допустимую концентрацию (ПДК). Количество внесенного биопрепарата - 1 г на 1 кг почвы. Сосуды выдерживали в термостатах в диапазоне температуры от 3 до 45^oС в течение 90 суток. Содержание мазута в почве контролировали 1 раз в 30 дней. Опыт проведен в трехкратной повторности. Результаты представлены в таблице 1
Пример 2
Во втором примере биопрепарат на основе штамма бактерий Serratia odorifera Jap-1 был внесен в стеклянные сосуды, наполненные почвой с содержанием сырой нефти 47,9-50,5 г/кг; Опыт проведен в трехкратной повторности. Результаты представлены в таблице 2.

В результате проведенных опытов можно констатировать весьма высокую деструктивную активность препарата на основе заявленного штамма (до 94%), в том числе и при высоком содержании подвижных форм тяжелых металлов При этом штамм эффективен в широком диапазоне температур (Т=3-45^oС).

Штамм бактерий Serratia odorifera Jap-1 может быть выращен промышленным способом с использованием стандартного биотехнологического оборудования с применением доступных сырьевых материалов.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к очистке объектов окружающей среды от загрязнения нефтью и нефтепродуктами. Предлагается штамм бактерий Serratia odorifera Jap-1, обладающий высокой деструктивной активностью в отношении углеводородов нефти и нефтепродуктов, толерантный к слоям тяжелых металлов. Данный штамм Serratia odorifera Jap-1 может быть выращен промышленным способом с использованием стандартного биотехнологического оборудования с применением доступных сырьевых материалов. Штамм может быть использован для получения биопрепаратов для очистки почв и поверхностных вод от нефтяных загрязнений, а также для ликвидации аварийных разливов нефти в условиях высокой концентрации солей тяжелых металлов. 2 табл.

Штамм бактерий Serratia odorifera Jap-1 для окисления углеводородов нефти и нефтепродуктов, толерантный к солям тяжелых металлов.