Изобретение относится к измерениям или испытаниям, использующим фермент холинэстеразу, конкретно к измерению концентрации веществ антихолинэстеразного действия (АХД), например фторангидрида O-изопропилового эфира метилфосфоновой кислоты (ИМФК), путем определения остаточной ферментативной активности.
Известен способ обнаружения фосфорорганических веществ (ФОВ) АХД в воздушной среде с помощью комплекта средств индикаторного плоского элемента ИПЭ ФОВ путем смачивания фильтра раствором фермента, прокачивания через него пробы воздуха, добавления субстрата с красителем, выполнения временной выдержки в течение 3 минут и сравнения полученной окраски с эталоном /1/.
Недостатком способа является возможность только обнаружения ФОВ и установления уровня зараженности, что в значительной мере обусловлено визуальной регистрацией аналитического эффекта, имеющего неоднородную форму по мере распределения цветореагентов на площади фильтрующего элемента, и не позволяет проводить количественный анализ.
Наиболее близким по технической сущности и достигаемым результатам к предлагаемому является способ определения ФОВ АХД путем добавления к исследуемой пробе воды раствора индикатора бромтимолового синего, раствора холинэстеразы в буфере, проведения инкубации, добавления субстрата бутирилхолинйодида, измерения времени визуального сравнения окраски анализируемой пробы с эталоном, расчета процента угнетения ферментативной активности, определения по калибровочному графику содержания вещества антихолинэстеразного действия в пробе воды /2/.
Недостаток способа состоит в невысокой производительности и точности определения, достигающей +/-25%.
Цель изобретения - повышение производительности, снижение вероятности субъективной ошибки при регистрации аналитического эффекта и одновременно уменьшение погрешности выполнения измерения.
Поставленная цель достигается способом регистрации аналитического эффекта видеоизмерительными средствами, выбором наиболее значимого показателя цветности красного R, по его изменению во времени рассчитывается остаточная ферментативная активность холинэстеразы, строится калибровочный график, по которому определяется концентрация ФОВ, например ИМФК, в растворе.
Последовательное осуществление всех вышеописанных стадий является отличительным признаком способа. Инструментальная регистрация изображений, получаемых в процессе прохождения колориметрических реакций, обработка полученных данных на ПЭВМ и определение величины изменения за фиксированный интервал времени (240 секунд) наиболее значимого показателя цветности красного R дают возможность получить зависимости процента угнетения ферментативной активности от концентрации ФОВ, что позволяет повысить производительность и точность получения результатов.
В табл.1 представлены результаты анализа ФОВ АХД ИМФК и фторангидрида пинаколинового эфира метилфосфоновой кислоты (ПМФК). Процент угнетения ферментативной активности рассчитывался по формуле 1:
где Rk - абсолютное значение изменения показателя красного цвета за фиксированный интервал времени в контрольном анализе;
Rx - абсолютное значение изменения показателя красного цвета за фиксированный интервал времени, полученное при анализе пробы.
По результатам табл.1 получены кубические зависимости, представленные формулами 2, 3, характеризующиеся величинами критерия Фишера - F и коэффициентом корреляции - r, подтверждающими их значимость, что позволяет увидеть возможность проведения количественного анализа.
F=1798, r=0.999
F=1211, r=0.999
Способ количественного определения ФОВ заключается в следующем. Проведение измерения основано на количественной оценке скорости биохимической реакции, протекающей в гетерогенной среде пористой подложки, на которой проявляется изображение, регистрируемое инструментальными видеоизмерительными средствами, например цифровой видеокамерой, с последующим определением показателя цветности красного R.
Пример
Определение ФОВ АХД в растворах проводят с использованием комплекта принадлежностей, входящих в состав ИПЭ ФОВ, видеокамеры и вычислительной техники.
Исследуемая проба в виде водного раствора ФОВ в объеме 0.1±0.01 мл помещается на пористую подложку ИПЭ. Параллельно проводятся работы с контрольной пробой, не содержащей ФОВ. Производится вскрытие пакета с раствором фермента, отбор содержимого пакета в шприц и нанесение 1±0.1 мл на поверхность пористой подложки, смоченной раствором пробы. Одновременно с добавлением фермента включается секундомер и проводится регистрация времени инкубации в течение 5 минут. После завершения инкубации фермента и пробы вскрываются путем раздавливания ампулы с субстратом и красителем, находящиеся внутри пористой подложки ИПЭ. Проводится инструментальная регистрация изображения цветового перехода пробы и контрольного образца в течение 4 минут с помощью видеокамеры, размещенной на расстоянии 15-20 см напротив регистрируемого изображения с подсветкой внешним источником света накаливания мощностью 40-60 Вт, находящимся на расстоянии от регистрируемого изображения 25-30 см под углом 45±5°. Полученная информация в виде видеофрагментов обрабатывается на ПЭВМ с помощью прикладных программных продуктов, с помощью которых определяется значение абсолютной величины изменения параметра цветности красного R для анализируемой и контрольной пробы за фиксированный интервал времени 240±1 секунда. По формуле 1 проводится расчет процента угнетения ферментативной активности с последующим определением по соответствующей калибровочной зависимости 2 или 3 концентрации от процента угнетения и преобразованием ее в единицы миллиграмм в единице объема пробы.
Установление калибровочной зависимости проводится путем приготовления растворов заданной концентрации, представленных в табл.1, проведения анализа в последовательности, приведенной выше в примере, обработки результатов с помощью статистического пакета SPSS 13.0 и установления зависимостей, представленных формулами 2, 3 для ПМФК и ИМФК. С использованием этих зависимостей проведен анализ проб и найдены значения концентраций (табл.2, 3), на примере которых рассчитан коэффициент вариации V по формуле 4, характеризующий погрешность выполнения измерения, что позволило сравнить предлагаемый способ с ранее известным (табл.4).
где Хср - среднее арифметическое значение измерения;
Sx - среднеквадратическое отклонение.
В табл.4 представлены сравнительные характеристики известного и предлагаемого способов.
Таким образом, предлагаемый способ позволяет проводить анализ непосредственно на месте отбора пробы, более производителен, менее трудоемок, превосходит прототип по точности определений и может быть рекомендован подразделениям ликвидации аварий на объектах хранения и уничтожения химического оружия при проведении химической разведки, а также при проведении мероприятий производственного экологического мониторинга объектов УХО, что позволит повысить оперативность получения информации и ее достоверность.
Источники информации
1. Инструкция по применению индикаторных плоских элементов для обнаружения фосфорорганических веществ, разработка Санкт-Петербург ООО «Лаборатория биохимических методов».
2. Руководство по работе в автомобильной радиометрической и химической лаборатории АЛ-4М. М.: «Военное издательство» 1988 г., 144 с.
название | год | авторы | номер документа |
---|---|---|---|
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОЕДИНЕНИЙ АНТИХОЛИНЭСТЕРАЗНОГО ДЕЙСТВИЯ В ВОДЕ И ВОДНЫХ ЭКСТРАКТАХ | 1999 |
|
RU2157850C1 |
Способ определения фосфорорганических нестицидов в воде | 1985 |
|
SU1359741A1 |
СПОСОБ БИОХИМИЧЕСКОЙ ИДЕНТИФИКАЦИИ ВЫСОКОТОКСИЧНЫХ АНТИХОЛИНЭСТЕРАЗНЫХ ЯДОВ | 2014 |
|
RU2557535C1 |
ЭКСПРЕСС-СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИНГИБИТОРОВ БУТИРИЛХОЛИНЭСТЕРАЗЫ В ВОДЕ И ВОДНЫХ ЭКСТРАКТАХ | 2019 |
|
RU2704264C1 |
СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ОТРАВЛЕНИЙ МАЛЫМИ ДОЗАМИ ФОСФОРОРГАНИЧЕСКИХ ОТРАВЛЯЮЩИХ ВЕЩЕСТВ | 2012 |
|
RU2484469C1 |
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ХОЛИНЭСТЕРАЗЫ КРОВИ | 1998 |
|
RU2153675C2 |
ИНДИКАТОРНЫЙ ПЛОСКИЙ ЭЛЕМЕНТ ДЛЯ КОНТРОЛЯ ВРЕДНЫХ ВЕЩЕСТВ, НАБОР, СОДЕРЖАЩИЙ ИНДИКАТОРНЫЙ ПЛОСКИЙ ЭЛЕМЕНТ, КОМПЛЕКТ И СПОСОБ ДЛЯ ЭКСПРЕСС-АНАЛИЗА ВОЗДУХА | 2008 |
|
RU2364863C1 |
СПОСОБ ОЦЕНКИ ТОКСИЧЕСКОЙ ОПАСНОСТИ АНТИХОЛИНЭСТЕРАЗНЫХ СОЕДИНЕНИЙ | 2013 |
|
RU2526817C1 |
СПОСОБ АКУСТИЧЕСКОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТА ИЛИ КОЛИЧЕСТВА СУБСТРАТА В МИКРООБЪЕМАХ | 1991 |
|
RU2007460C1 |
Способ определения пестицидов и лекарственных веществ антихолинэстеразного действия | 1990 |
|
SU1745769A1 |
Анализируемую пробу помещают на пористую подложку, входящую в состав индикаторных плоских элементов, и после инкубации в присутствии фермента, субстрата и индикатора регистрируют цветовой переход анализируемой пробы и контрольного образца в течение 240±1 с видеоизмерительными средствами для выбираемого наиболее значимого показателя цветности. Проводят расчет процента угнетения ферментативной активности с последующим определением по калибровочному графику концентрации веществ антихолинэстеразного действия. Это позволяет повысить производительность и точность получения результатов, снизить вероятность субъективной ошибки при регистрации аналитического эффекта и уменьшить погрешность выполнения измерений веществ антихолинэстеразного действия в растворах проб. 4 табл.
Способ количественного определения веществ антихолинэстеразного действия в водных растворах, предусматривающий инкубацию анализируемой пробы в присутствии фермента, субстрата и индикатора, регистрацию колориметрических эффектов путем измерения времени цветового перехода анализируемой пробы и контрольной пробы и расчет процента угнетения ферментативной активности с последующим определением по калибровочному графику концентрации веществ антихолинэстеразного действия, отличающийся тем, что анализируемую пробу помещают на пористую подложку, входящую в состав индикаторных плоских элементов, и после инкубации регистрируют цветовой переход анализируемой пробы и контрольного образца в течение (240±1) с видеоизмерительными средствами для выбираемого наиболее значимого показателя цветности.
Очаг для массовой варки пищи, выпечки хлеба и кипячения воды | 1921 |
|
SU4A1 |
- М.: Военное издательство, 1988, с.24-29 | |||
СПОСОБ ФОТОМЕТРИЧЕСКОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОЛИЧЕСТВА АНАЛИЗИРУЕМОГО ВЕЩЕСТВА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ВИДЕОИЗМЕРИТЕЛЬНОГО КОМПЛЕКСА | 1995 |
|
RU2130171C1 |
Хлоргидрат О-изобутил-О-2-(N-пиперидил)изопропил-метилтионфосфоната, обладающий антихолинэстеразной активностью | 1991 |
|
SU1803408A1 |
Авторы
Даты
2009-06-10—Публикация
2007-02-20—Подача