Изобретение относится к типированию вирусов гепатита C (HCV). В частности, настоящее изобретение относится к способу типирования HCV, используя новые типозависимые пептиды.
Известно, что вирусный гепатит вызывается пятью различными вирусами, известными как гепатит A, B, C, D и E. HAV является РНК-содержащим вирусом и не вызывает длительных клинических симптомов. HBV является ДНК-содержащим вирусом. HDV является зависимым вирусом, который не способен инфицировать клетки в отсутствии HBV, HEV-вирус, передающийся через воду. HCV впервые был идентифицирован и охарактеризован как вызывающий -A,- -B гепатиты (NANBH). Houghtonetal, Европейская заявка 388232. Это привело к открытию множества общих и специфических полипептидов, применимых как иммунологические реагенты для идентификации HCV, См. например, Choo et al. (1989) Seince, 244: 359-362, Kuo et al. (1989) Seicnce, 244: 362-364 и Houghton et al. (1991) Hopatology, 14: 381-388. HCV является основной причиной гепатитов, передаваемых при переливании крови.
Прототипный изолят (штамм) HCV был описан в Европейских заявках 318216 и 388222. Используемый здесь термин "HCV" включает вновь выделенные виды вируса NANBH. Термин "HCV-1" относится к вирусу, описанному в вышеупомянутых публикациях.
Со времени первоначальной идентификации HCV было идентифицировано по крайней мере шесть различных типов вируса, обозначенных как HCV-1 - HCV-6. Cha et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 89, 7144-7148. Среди этих типов существует множество подтипов. Тип вируса, которым инфицирован пациент, может влиять на клинический прогноз и также на реакции к различным способам лечения. Yoshioka et al. (1992) Hepatology, 16: 293-299. В свете того факта, что наиболее серьезным клиническим исходом инфекции HCV является гепатоклеточная карцинома, было бы полезно иметь возможность определять, каким типом или типами HCV инфицирован пациент.
Используемый в настоящее время метод определения типа вируса состоит в типировании гена, то есть выделении вирусной РНК и определении последовательности различных сегментов путем полимеразной цепной реакции (PCR). Этот метод не только трудоемкий и требует много времени, но и не удобен для применения с пробами, которые содержались в условиях, не позволяющих сохранить РНК, или пробами от больных, у которых недостаточный высокий титр вируса. Было бы полезным иметь метод для типирования HCV путем иммунологического или серологического типирования.
Применяемым в настоящее время методом для скрининга крови и диагностики пациентов является иммунологический анализ. При этом иммунологическом анализе используется антиген из HCV-1, который содержит достаточное количество общих эпитопов для выявления антител к другим типам HCV. Иммунологический анализ не выявляет различий между инфекциями различными типами HCV.
Настоящее изобретение включает композиции и методы типирования HCV по генотипу и серотипу. Эти композиции включают типоспецифические эпитопы, нуклеиновые кислоты, кластертипоспецифических эпитипов, кодирующие эпитопы для использования в качестве зондов, и нуклеиновые кислоты, комплементарные к областям, граничащим с теми, которые кодируют эпитопы, для использования в качестве затравок.
Одним из аспектов изобретения является метод типирования HCV, включающий этапы приготовления содержащих антитела проб от индивидумов, контактирование проб с типоспецифическим эпитопом или кластер-типоспецифическими эпитопами в условиях, позволяющих связывание антигена с антителом, и определение того, связываются ли антитела в пробе с этим эпитопом.
Другой аспект изобретения относится к способу типирования HCV, включающему этапы получения антител, содержащий пробы от индивидуума, контактирование пробы с первым типоспецифическим эпитопом или кластертипоспецифическим эпитопом в условиях, позволяющих связывание антигена с антителом, контактирование пробы со вторым типоспецифическим эпитопом и типо-кластерспецифическим эпитопом в условиях, позволяющих связывание антигена с антителом, и определение того, связываются ли антитела из проб с первым или вторым эпитопом.
Другой аспект изобретения относится к полипептидам, содержащим типоспецифические эпитопы или кластертипоспецифические эпитопы. Полипептиды получают из трех различных областей генома HCV. Один набор полипептидов включает типоспецифический эпитоп или кластертипоспецифические эпитопы, полученные из области нуклеотида HCV. Этот первый набор обнаружен между 67 и 84 аминокислотными остатками HCV-1 и гомологичными областями других типов HCV. Здесь используются следующие сокращения аминокислотных остатков: A - аланин, I - изолейцин, L - лейцин, М - метионин, F - фенилаланин, P - пролин, W - триптофан, V - валин, N - аспарагин, C - цистеин, Q - глютамин, G - глицин, S - серин, T - треонин, Y - тирозин, R - аргинин, H - гистидин, K - лизин, D - аспарагиновая кислота, E - глютаминовая кислота.
Конкретные последовательности аминокислотных остатков, полученных из области нуклеотида, и подтипы, из которых они получены, следующие:
1. PEGRTWAQ, подтип 1а или 1б, 2. STCKSWGK, подтип 2а или 2б. 3. SEGRSWAQ, подтип 3а или 4,
Другой набор полипептидов включает типоспецифический эпитоп, полученный из неструктурной области 4(NS4) HCV. Этот второй набор находится между аминокислотными остатками 1689 - 1718 HCV-1 и гомологическими областями других типов HCV.
Конкретные последовательности аминокислотных остатков и типы или подтипы, из которых они получены, следующие:
1. CSQHLPY, подтип 1a, 2. CASHLPV, подтип 16. 3. CASRAAL, подтип 2а или 2б.
Другой набор полипептидов включает типоспецифический эпитоп или кластертипоспецифические эпитопы, полученные из неструктурной области 5 (NS5) вируса гепатита C. Этот набор находится между аминокислотными остатками 2281-2313 HCV-1 и гомологическими областями других типов вируса гепатита C.
Конкретные последовательности аминокислотных остатков и типы или подтипы, из которых они происходят, следующие:
1. PDYEPVVHG, подтипы 1a, 2. PDYVPPVVHG, подтип 1б. 3. PDYQPATVAG, подтип 2а. 4. PGYEPPTVLC, подтип 2б. 5. FAQASPVW, подтип 1a. 6. FPPQALP1W, подтип 1б. 7. FPQALPAW, подтип 2a. 8. FPPQALPPW, подтип 2б.
Другой аспект изобретения охватывает молекулы нуклеионовых кислот, кодирующих последовательности аминокислотных остатков, описанных типоспецифических и кластертипоспецифических эпитопов. Эти молекулы нуклеиновых кислот применяются в качестве зондов, например, в блот-тесте по методу Сатерна или других методах выявления ДНК, таких как метод схватывания описанным в патенте США N 4868105 и N 5124246.
Другой аспект изобретения включает молекулы нуклеиновых кислот, комплементарные к фланкирующим участкам, кодирующих типоспецифические и кластертипоспецифические эпитопы. Такие молекулы нуклеиновых кислот используются при проведении полимеразной цепной реакции для определения генотипа конкретного HCV.
Фиг. 1 представляет диаграмму экспериментальной стратегии серотипирования.
Фиг. 2 представляет диаграмму исчерпывающей стратегии картирования эпитопа.
Фиг. 3 является сводкой графиков представляющих результаты картирования эпитипа HCV 1а (Rodneg).
Фиг. 4 является сводкой графиков, представляющих результаты картирования эпитопа HCV 2b (Nomoto).
"Вирус гепатита C" или "HCV" относится к видам вирусов, патогенные типы которых вызывают NANBH, и к происходящим из них аттенуированным типам или дефектным интерферируемым частицам, см., главным образом, публикации, цитируемые в разделе "Предпосылки изобретения". Геном HC. состоит из РНК. РНК-содержащие вирусы имеют относительно высокий уровень спонтанных мутаций, порядка 10-3 - 10-4 на встроенный нуклеотид. Fields & Knipe (1986) "Fundamental Verology" (Raven Press, NV). Поскольку гетерогенность и текучесть генотипа присущи РНК-содержащим вирусам, существует множество типов/подтипов среди видов HCV, которые могут быть вирулентными или невирулентными. Культивирование, идентификация, обнаружение и выделение различных типов HCV описаны в литературе. Как показано здесь, все нуклеотидные последовательности и последовательности аминокислотных остатков происходят из упомянутых типов HCV. Номер HCV-1 генома и последовательностей аминокислотных остатков, как таковы, описано Choo et al. (1990) Brit. Med. Bull., 46: 423- 441. Данное здесь описание позволяет диагностировать эти различные типы вирусов.
Использующийся в настоящем изобретении термин "тип" относится к вирусам HCV, которые различаются генотипически более чем на 30%, "подтип" относится к вирусам HCV, которые различаются генотипически на 10-20%, а термин "изолят" относится к вирусам HCV, которые различаются генотипически менее чем на 10%. "Типирование" относится к распознаванию одного типа HCV от другого.
Сведения о нескольких различных типах/подтипах HCV описаны в международной заявке WO 93/00365, в частности о типе или подтипе CDC/HCV1 (также называемом HCV-1). Информации об одном типе или подтипе, частичная геномная такой как или аминокислотная последовательность достаточно, чтобы позволить знакомому с этой областью науки специалисту, используя стандартную технику, выделить новые типы HCV. Например, нескольких различных типов HCV были подвергнуты скринингу, как описано ниже. Эти типы, которые были получены из нескольких человеческих сывороток (и из различных географических областей), были типированы, используя метод и реагенты, описанные в настоящей работе.
Была выведена геномная структура и нуклеотидная последовательность геномной РНК HCV-1. Геном, по-видимому, является однонитчатый РНК, содержащей 10.000 нуклеотидов, представляет собой положительную цепь и имеет непрерывную открытую рамку считывания (OPC), кодирующую полипептид, состоящий приблизительно из 3000 аминокислот. В OPC (ORF) структурный белок (белки), по-видимому, кодированы приблизительно в первой четверти области аминоконца, вместе с большинством полипротеинов, ответственных за неструктурные (NS) белки. Если сравнения со всеми известными вирусными последовательностями наблюдаются небольшие, но достоверные колинеарные гомологии с неструктурными (NS) белками семейства флавивирусов и с пестивирусами (которые в настоящее время также считаются частью семейства Флавивирусов).
Основываясь на предполагаемых аминокислотных остатках, закодированных в нуклеотидной последовательности HCV-1, и других доказательствах, возможные белковые домены кодированного полипротеина HCV и также приблизительные границы представлены в таблице 1.
Таблица 1
Предполагаемый домен - Приблизительная граница номера аминокислот)
C (белок нуклеокапсида) - 1-191
E1 (белок оболочки вириона) - 192-383
E2/NS1 (оболочка) - 384-800
NS2 (неизвестная функция) - 800-1050
NS3 (протеаза) - 1050-1650
NS4 (неизвестная функция) - 1651-2100
NS5 (полимераза) - 2100 - 3011 (конец)
Эти домены являются гипотоническими предполагаемыми. Например, E1 - NS2 граница находится, возможно, в 750-810 области, а граница NS3 - NS4 примерно в 1640-1650. Имеется также доказательство, что 191 аминокислотная (aa) версия C является предшественником, который далее претерпевает процессинг до длины около 170 aa, и что белки NS2. NS4 и NS5 каждый также подвергаются процессингу в два зрелых белка.
Различные типа HCV определяются в соответствии с различными критериями, так, например, OPC, состоящая приблизительно из 9000 до 12000 нуклеотидов, кодирующая полипротеин, сходный по размерам с таковым вируса HCV-1, кодированный полипротеин сходного гидрофобного и/или антигенного характера, что и таковой вируса HCV-1, и наличие колинеарной полипептидной последовательностей, которые сохраняются с HCV-1.
Следующие параметры гомологии нуклеиновых кислот и гомологии аминокислот применимы как сами по себе, так и в комбинации для идентификации типов HCV. В целом, как описано выше, различные типы HCV проявляют около 70% гомологии, тогда как подтипы проявляют 80- 90% гомологии, а изоляты около 90% гомологии.
Используемый в настоящей работе термин - полинуклеотид, "происходящий из" обозначенной последовательности, относится к полинуклеотидной последовательности, которая состоит из последовательности по крайней мере около 6 нуклеотидов, предпочтительнее не менее 8 нуклеотидов, более предпочтительно не менее около 10-12 нуклеотидов, еще более предпочтительно по крайней мере около 15-20 нуклеотидов, соответствующих области обозначенной нуклеотидной последовательности. Термин "соответствие" означает гомологичный или комплементарный обозначенной последовательности. Предпочтительно, чтобы последовательность области, из которой происходит этот полинуклеотид, являлась гомологичной или комплементарной последовательности, которая уникальная для HCV генома. Методики гибридизации для определения комплементарности последовательностей нуклеиновых кислот в этой области известна. См., например, Moniatis et al. (1982). Кроме того, несовпадения двойных полинуклеотидов, образовавшихся при гибридизации, можно определить известными методами, включающими, например, переваривание нуклеазой, такой как 1, которая специфически переваривает однониточные участки в двойных полинуклеотидах. Области, из которых можно "извлечь" типичные последовательности ДНК, включают, но не ограничиваются, например, областями, кодирующими типоспецифические эпитопы, а также и несчитываемые и/или нетранслируемые области.
Производный полинуклеотид не обязательно физически происходит от показанной нуклеотидной последовательности, но может быть генерирован любым способом, включая, например, химический синтез, или репликацию ДНК, или обратную транскрипцию, или просто транскрипцию. Кроме того, комбинации областей, соответствующих таковой обозначенной последовательности, могут быть модифицированы известными в данной области науки, путями в соответствии с предполагаемым использованием.
Подобным образом, термин полипептидная или аминокислотная последовательность, "происходящая из" обозначенной последовательности аминокислоты или нуклеиновой кислоты, относится к полипептиду, имеющему аминокислотную последовательность, идентичную таковой полипептида, закодированного в этой последовательности или ее части, эта часть состоит, по крайней мере, из 3-5 аминокислот, или более предпочтительно, по крайней мере, из 8-10 аминокислот, и еще более предпочтительно, по крайней мере, из 11-15 аминокислот, или которую можно иммунологически идентифицировать с полипептидом, закодированным в последовательности. Эта терминология также включает полипептид, экспрессированный из обозначенной последовательности нуклеиновой кислоты.
Рекомбинантный или производный полипептид не обязательно транслируется из обозначенной последовательности нуклеиновых кислот, он может быть создан любым способом, включая, например, химический синтез, или экспрессию рекомбинантной системы экспрессии, или выделение из HCV, включая мутированные HCV. Описанные здесь полипептиды обычно относительно короткие и таким образом очень легко синтезируются химически.
Рекомбинантный или производный полипептид может включать в свою последовательность один или более аналогов аминокислот или неприродных аминокислот. Методы вставки аналогов аминокислот в последовательность известны в данной области науки. Он также может включать одну или более меток, которые известны специалистам в данной области науки. Подробное описание аналогов и "мимотопов" представлено в патенте США N 5,194,392.
Аналоги пептидов включают делеции, добавки, замены или его модификации, которые сохраняют способность типирования HCV. Предпочтительные "замены" - это те, которые консервативными, т.е. один остаток заменен другим того же общего типа. Хорошо понятно, что естественно встречающиеся аминокислоты могут быть подразделены на кислые, основные, нейтральные и полярные, или нейтральные и неполярные. Далее три из кодируемых аминокислот являются ароматическими. Обычно предпочтительно, чтобы кодируемые полипептиды, отличающиеся от природного эпитопа, содержат замещенные кодоны для аминокислот, которые относятся к той же группе, что и котоды замещенной аминокислоты. Таким образом, в целом основные аминокислоты Lys, Arg и His взаимозаменяемы, кислые аминокислоты аспарагин и глютамин взаимозаменяемы, нейтральные полярные аминокислоты Ser, Thr, Cys, Cln и Asn взаимозаменяемы, неполярные алифатические аминокислоты Cly, Ala, Yal, Ile и Leu консервативны относительно друг друга (но из/за размера Gly и Ala более близко родственны, и Val, Ile и Leu более близко родственны, а ароматические аминокислоты Phe, Trp и Tyr взаимозаменяемы). Хотя пролин является неполярной нейтральной аминокислотой, он представляет трудности из-за его влияния на конформацию, замена его или им не является предпочтительной, за исключением тех случаев, когда можно получить те же или сходные результаты конформации. Полярные аминокислоты, которые представляют консервативные изменения, включают Ser, Thr, Gln, Asn и, в меньшей мере, Met. Кроме того, хотя их классифицируют в различные категории, Ala, Cly и Ser представляются взаимозаменяемыми, а Cys дополнительно входит в эту группу или может быть классифицирован полярными нейтральными аминокислотами.
Следует далее отметить, что, если полипептиды получены синтетически, могут быть сделаны замены аминокислотами, которые не кодированы геном. Альтернативные остатки включают, например, омега аминокислоты формулы H2N(CH2)nCOOH, где n = 2-6. Это нейтральные неполярные аминокислоты так же как саркозин (Sar), трет-бутилаланин (t-BuA), трет-бутилглицин (t-BuG), N-метил-Ile (N-MeIle) и норлейцин (Nle). Фенилглицин, например, может быть заместителем для Trp, Tyr или Phe - ароматической нейтральной аминокислоты, цитруллин (Cit) и метионин сульфоксид (MSO) являются полярными, но нейтральными, циклогексил аланин (Cha) нейтральный и неполярный, цистеиновая кислота (Cya) - кислая, а орнитин (Orn) - основной. Определяющие конформацию свойства пролиновых остатков могут быть сохранены, если один или несколько из них замещаются гидроксипропином (Hyp).
Термин "рекомбинантный полинуклеотид", используемый в настоящей работе, предполагает полинуклеотид геномного сДНК, полусинтетического или синтетического происхождения, который по существу своего происхождения или манипуляции: (1) не ассоциирован со всем или с частью полинуклеотида, с которым он связан в природе, (2) присоединен к полинуклеотиду, иному, чем тот, с которым он связан в природе, или (3) не встречается в природе.
Термин "полинуклеотид", используемый в настоящей работе, относится к полимерной форме нуклеотидов любой длины, будь то рибонуклеотиды или дезоксирибонуклеотиды. Этот термин относится только к первичной структуре молекулы. Таким образом, этот термин включает только двух и однонитчатые ДНК и РНК. Он также включает известные типы модификаций, например метки, которые хорошо известны в этой области науки, метилирование "кэпы", и замещение одного или нескольких естественно встречающихся нуклеотидов аналогом, междунуклеотидные модификации, такие как, например, модификации с незаряженными связями (например, метил фосфонатами, фосфотриэфирами, фосфорамидатами, карбаматами и т.д.) и с заряженными связями (например, фосфоротиоаты, фосфородитиоаты и т. д. ), связи, содержащие подвешенные остатки, такие, как например, белки, включая, но не ограничиваясь, нуклеазы, токсины, антитела, сигнальные пептиды и поли-L-лизин, интеркаляторы (например, акридин, псорален, и т.п.), содержащими хелаторы (т.е., металлы, радиоактивные металлы, борон, металлы-окислители, и т. п. ), содержащими алкиляторы, полинуклеотиды с модифицированными связями (например, альфа аномерные нуклеиновые кислоты и т.п.), а также немодифицированные формы полинуклеотидов. Полинуклеотиды, описанные здесь, являются относительно короткими и поэтому могут быть легко синтезированы химически.
Термин "очищенный" полипептид относится к полипептиду, находящемуся в состоянии, по существу свободном от других полипептидов, т.е. в композиции, которая содержит как минимум приблизительно 50% по весу (выбранного полипептида/к общему составу полипептидов в композиции), предпочтительно минимум около 70%, и еще более предпочтительно минимум около 90% выбранного полипептида безотносительно к небелковым материалам в этой композиции. Методика очистки вирусных полипептидов известнаа в этой сфере науки. Термин "очищенные" антитела в этой области науки определяются подобным же образом.
Как принято в настоящей работе, термин "эпитоп" относится к антигенной детерминанте полипептида. Эпитоп может содержать 3 или более аминокислот, которые определяют сайт связывания антитела. Обычно эпитоп содержит по крайней мере 5 аминокислот, но иногда состоит из не менее 8 аминокислот. Методы картирования эпитопов хорошо известны в данной области науки.
Как принято в настоящей работе, термин "типоспецифический эпитоп" относится к эпитому, обнаруживаемому у одного типа HCV. "Кластертипоспецифический эпитоп" обнаруживается у более чем одного типа, но реже, чем у всех типов HCV, Например, конкретный эпитоп может быть распознан антителами от пациента, инфицированного HCV-1, но не распознаваться или распознаваться менее эффективно антителами от пациента, инфицированного HCV-2. Аналогично кластертипоспецифический эпитоп от HCV-3 может быть распознан антителами от пациента, инфицированного HCV-3 или HCV-4, но не антителами от пациента, инфицированного HCV-1 или HCV-2. "Сохраненные эпитопы"- это те, которые распознаются антителами, специфическими для всех типов HCV.
Полипептид является "иммунологически реактивным" с антителами, которые связываются с пептидами благодаря распознаванию антителами специфического эпитопа, содержащегося в полипептиде. Иммунологическая реактивность может определяться связыванием антител, особенно, кинетикой связывания антител и/или конкуренцией в связывании, используя в качестве конкурентов известные полипептиды, содержащие эпитоп, против которого направлено антитело. Методики определения иммунологической реактивности полипептида с антителом известны в этой сфере науки.
Как используется в настоящей работе, термин "антитело" относится к полипептиду или группе полипептидов, которые включают по крайней мере один соединяющий антитела сайт. Термин "соединяющий антитела сайт" или "связывающий домен" образован из сложения вариабельных доменов молекул(ы) антитела с образованием трехмерных связывающих пространств с формой внутренней поверхности и распределением заряда, комплементарно к характеристикам эпитопа антигена, что позволяет проходить иммунологической реакции с антигеном. Соединяющий антитела сайт может быть образован из домена тяжелой и/или легкой цепи (Vн и VL соответственно), которые образуют гипервариабельные петли, способствующие связыванию антигена. Термин "антитело" включает, например, сочлененные антитела, гибридные антитела, химерные антитела, измененные антитела, унивалентные антитела, Фаб-белки и однодоменные антитела.
Антитела, специфические к полипептидам, и полипептиды могут быть получены любым известным экспериментальным методом. Например, суспензию полипептидов в физиологически приемлемом буфере смешивают с подходящем адъювантом и вводят животному. Методы создания поликлональных и моноклональных антител хорошо известны и не будут здесь детально описаны.
Термин "полипептид" относится к полимеру аминокислот и не имеет отношения к определенной длине продукта, тем самым полипептиды, олигопептиды и белки включены в определение полипептида. Этот термин не относится или не исключает пост-экспрессионные модификации полипептида, например гликозилирование, ацетилирование, фосфорилирование и т.п. Включены в данное определение, например, полипептиды, содержащие один или более аналогов аминокислот (включая, например, неприродные аминокислоты и др.), полипептиды с замещенными связями, а также другие известные науке модификации, как встречающиеся в природе, так и не встречающиеся в природе.
"Лечение" - термин, употребляемый в настоящей работе, относится к профилактике и/или терапии.
Термин "индивидуум", употребляемый в данной работе, относится к позвоночным, в частности к представителям видов млекопитающих, и включает, но не ограничивается ими, животных (например, собак, кошек, крупный рогатый скот, свиней, овец, коз, кроликов, мышей, крыс, морских свинок и т.д.) и приматов, включая обезьян, шимпанзе, бабуинов и человека.
Как употреблено здесь, термин "смысловая нить" нуклеоиновой кислоты содержит последовательность, имеющую гомологию последовательности к таковым мРНК. Термин "антисмысловая нить" содержит последовательность, комплементарную к таковой "смысловой нити".
Употребляемый в данной работе термин "геном с колонительной нитью" (или "геном с + РНК) - это такой геном, в котором, будь то РНК или ДНК, является однонитчатым и который кодирует вирусный полипептид (ы). Примеры вирусов с + РНК включают Тогавириды, Коронавириды, Нетровириды, Пикорнавириды и Калицивириды. Сюда относятся также Флавовириды, которые ранее классифицировались как Топавириды. См. Fields & Knipe (1986).
Как употреблено в настоящей работе, термин "антитело-содержащая проба организма" относится к компоненту, организма индивида, который является источником представляющих интерес антител. Антитело-содержащие компоненты организма известны в данной области и включают, но не ограничиваются ими, например, плазму, сыворотку, спинномозговую жидкость, лимфоидную жидкость, внешние отделы дыхательного, кишечного и мочеполового трактов, слезы, слюна, молоко, белые кровяные тельца и миеломы.
Как употреблено в настоящей работе, термин "биологическая проба" относится к пробе ткани или жидкости, выделенной от индивидуума, включая, но не ограничиваясь, например, плазму, сыворотку, спинально-мозговую жидкость, лимфатическую жидкость, внешние срезы кожи, дыхательного, пищеварительного и мочеполового трактов, слезы слюны, молоко, клетки крови, опухоли и органы. Сюда также относятся пробы компонентов клеточных культур in vitro (включая, но не ограничиваясь ими, кондиционированную среду, получаемую от выращивания клеток в культуральной среде, предположительно зараженные вирусом клетки, рекомбинантные клетки и клеточные компоненты).
Практическая часть настоящего изобретения будет использовать, если не указано иначе, общепринятые методы молекулярной биологии, микробиологии, рекомбинантной ДНК, синтез полипептидов и нуклеиновых кислот и иммунологии, которые относятся к этой области науки. Такие методы полно описаны в литературе. См. Moniatis, Fitsch & Sambrook, "Molecular Cloning: A Laborototy Manual" (1982); "DNA Cloning, Volums Iandll" (D.N. Clovered 1985); "Oligonueleotide Synthesis" (M.J.Gfit ed, 1984); "Nucleic Acid Hylridirazation" (B.D. Hames & S.J. Higgins eds, 1984); "Transeription and Translation" (B. D. Hames & S.J. Higgins eds. 1984); "Anunal Cell Culture" (R.I.Freshneg ed. 1986); "Immobilired Cells and Enrymes" (IRLPress, 1986); B.Perbal, "Apractical Guide To Molecular Cloning "(1984); the series", Methods in Erymology" (Academic Press, Inc); "Cene Transfer Vectos For Mammalion cells" (J.H. Millerand M.P. Calos eds., 1987. Cold Spring Harbor Laboratory). Meth. Enzymol., Vol. 154 and 155 (Wuand Grossman, and Wu, eds, respectively), Mayer and Walker, eds. (1987), "Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology" (Academic Press, London); Scopes, (1987) "Protein Purification. Prineipalsand Practuce", Second Edition (Springer Verlag, N. V.); and "Handbook of Experimental Immunology", Volumes I-IV (D.M. Weir and C.C. Blackwell eds. 1986).
Все патенты, патентные заявки и публикации, упомянутые здесь как выше, так и ниже, таким образом, включены здесь в виде ссылок.
Изобретение включает способы для выявления HCV и идентификации инфекции различными типами HCV. Изобретение также включает полипептиды и молекулы нуклеиновых кислот, использованные в методах.
Способы для выявления и типирования инфекции HCV включают как иммуноанализы, так и идентификацию нуклеиновых кислот методами, включающими, но не ограниченными ими, (Southern) блот аналогом Сатерна и полимеразной цепной реакцией. Чтобы идентифицировать инфекцию вирусом HCV, биологическую пробу инкубируют с одним из полипептидов, описанным выше, в условиях, которые позволяют связываться антителу с антигеном, и определяют, связались ли антитела в пробе с эпитопом, обнаруженными на полипептиде.
Иммунологический анализ и диагностические наборы
Пептиды, содержащие типоспецифические эпитопы и кластертипоспецифические эпитопы, полезны в иммунологических анализах для выявления присутствия антител к HCV, или присутствия вирусов и/или вирусных антигенов в биологических пробах. Постановка иммологических анализов подвержена большому количеству вариаций, и в этой области известно множество методик. Для иммунологического теста используется, по крайней мере, один типоспецифический эпитоп или кластертипоспецифический эпитоп. В одном варианте иммунологический тест использует комбинацию типоспецифических эпитопов и/или кластертипоспецифических эпитопов.
Полипептиды полезны для типирования HCV путем использования эпитопов для определения присутствия типоспецифических или кластертипоспецифических антител. Полипептиды также пригодны для получения типо- или кластертипоспецифических антител, которые затем могут быть использованы в иммунологических тестах для выявления различий между типами HCV.
Полипептиды получают из трех различных областей генома HCV. Один набор полипептидов включает типо- или кластертипоспецифический эпитоп, полученный из нуклеоидной области HCV. Другой набор полипептидов включает типо- или кластертипоспецифические эпитопы, полученные из неструктурной области 4 (NS4) HCV. Другой набор полипептидов включает типо- или кластертипоспецифический эпитоп, полученный из неструктурной области 5 (NS5) вируса гепатина C. Этот набор находится между аминокислотными остатками 2281 и 2313 HCV-1 и гомологичными регионами других типов вируса гепатита C.
Полипептиды пригодны для использования в иммунологических тестах для одного или более типов HCV. Для определения одного типа пробу контактируют с одним или несколькими полипептидами, содержащими кластертипоспецифический эпитоп, в условиях, которые позволяют связываться антителу с антигеном, и определяют, связываются ли антитела в пробе с этим эпитопом.
В иммунологическом тесте для определения конкретного типа HCV биологическую пробу получают от индивидуума, контактируют с первым типоспецифическим эпитопом или кластертипоспецифическим эпитопом в условиях, которые позволяют связываться антигену с антителом, контактируют со вторым типоспецифическим эпитопом или кластертипоспецифическим эпитопом в условиях, которые позволяют связываться антителу с антигеном, и определяют, связывались ли антитела в пробе с первым или вторым эпитопом. Эти этапы могут быть повторены с любым числом полипептидов, содержащих типо- и/или кластертипоспецифические эпитопы.
Обычно иммунологически тест на анти-HCV антитело (а) включает отбор и приготовление тестируемых проб, подозреваемых на наличие антител, таких как биологическая проба, затем инкубацию ее с типоспецифическим эпитопом или кластертипоспецифическим эпитопом в условиях, которые позволяют образоваться комплексам антиген-антитело, и затем выявление образования таких комплексов. Подходящие инкубационные условия методически хорошо известны. Иммунологический тест может быть без ограничений в гетерогенных или гомогенных условиях и стандартного или конкурентного типа.
В гетерогенных условиях типоспецифический эпитом или кластертипоспецифический эпитоп обычно связан с твердой подложкой для улучшения разделения пробы от полипептида после инкубации. Примеры твердых подложек, которые могут быть использованы, включают, но не ограничиваются, нитроцеллюлозу (например, в виде мембраны или пластинки для микротитрования), поливинилхлорид (например, в виде пластин или микротитровальных лунок), полистирольный латекс (например, в бусах или планстиках для микротитрования, поливинилфторид (известный как Immulon® ), диазотированную бумагу, нейлоновые мембраны, активированные бусы и бусы с белком A. Например, микротитровальные пластины DynatechImmulon®1 или Immulon®2 или 0,25-дюймовые полистирольные бусы (Precicion Plastic Ball) могут быть использованы в гетерогенных условиях. Твердые подложки, содержащие типоспецифические эпитопы или кластертипоспецифические эпитопы, обычно отмываются после отделения от гестируемой пробы и перед определением связанных антител. Как стандартный, так и конкурентный методы хорошо известны в данной области.
В гомогенных условиях тестируемую пробу инкубируют с типоспецифическим эпитопом или кластертипоспецифическим эпитопом в растворе. Например, это может быть в условиях, которые ускоряют образование любых комплексов антиген-антитело. Как стандартные, так и конкурентные условия для этих тестов хорошо известны в данной области.
В стандартных условиях количество антител HCV, образующих комплекс антитело-типо- или пластертипоспецифический эпитоп контролируется непосредственно. Это может быть достигнуто определением, будут ли меченые анти-ксеногенные (например, античеловеческие) антитела, которые распознают эпитоп на анти-HCV антителах, связываться в результате образования комплекса. В конкурентных условиях количество антител к HCV в пробе определяется контролем влияния конкурентного эффекта на связывание известного количества меченых антител (или другого конкурирующей связи) в комплексе.
В тесте ингибирования определяется способность антител связываться с полипептидами, содержащими различные типоспецифические эпитопы к кластертипоспецифическим эпитопам. Антитела сначала контактируют с полипептидами, содержащими эпитоп(ы) одного типа или кластер-типа HCV, и затем с полипептидами, содержащими эпитоп(ы) другого типа или пластер-типа HCV. Этот процесс может быть повторен для дополнительных типов или кластер-типов HCV.
Образовавшиеся комплексы, включающие анти-HCV антитела (или в случае конкурентного метода количества конкурентного антитела), выявляют любым из ряда известных способов в зависимости от условий. Например, немеченые антитела HC в комплексе могут быть выявлены, используя конъюгат антиксеногенно Iq, соединенного с меткой (например, ферментной меткой).
В типичном иммунологическом тесте тестируемую пробу, обычно биологическую пробу, инкубируют с полипептидами, содержащими один или несколько типоспецифических или кластертипоспецифических эпитопов, в условиях, которые способствуют образованию комплексов антиген-антитело. Можно применять различные условия. Например, может быть применен метод "сэндвича", в котором антитела, связанные с твердой подложкой, инкубируют с тестируемой пробой, затем отмывают, инкубируют со вторым, меченым антителом к анализу и подложку снова отмывают. Аналит выявляется определением, связано ли второе антитело с подложкой. В конкурентных условиях, которые могут быть либо гетерогенными, либо гомогенными, тестируемую пробу обычно инкубируют с антителом, а меченый конкурирующий антиген тоже инкубируют последовательно или одновременно. Эти и другие методы хорошо известны в данной области науки.
Антитела против типоспецифических эпитопов или кластертипоспецифических эпитопов можно использовать в иммунологических тестах для выявления вирусных антигенов у пациентов с HCV-вызванным NANBH, и у инфицированных доноров крови. Более того, эти антитела могут быть чрезвычайно полезными для выявления острой фазы у доноров и пациентов.
В иммунологическом тесте можно использовать, например, моноклональные антитела к типоспецифическим эпитопам или кластертипоспецифическим эпитопам, комбинацию моноклональных антител к эпитопам одного вирусного антигена, моноклональные антитела к эпитопам различных вирусных антигенов, поликлональные антитела к тому же вирусному антигену, или поликлональные антитела к различным вирусным антигенам. Методики могут быть основаны, например, на конкуренции или прямой реакции, или определении типа "сэндвич". Методики могут также, например, использовать твердую подложку или проводиться путем иммунопреципитации. Большинство тестов включают использование меченых антител или полипептидов, метки могут быть, но не ограничиваются энзиматическими, флуоресцентными, хемилюминесцентными, радиоактивными или молекулами красителей. Тесты, при которых усиливаются сигналы зонда, также хорошо известны, например тесты, использующие биотин и авидин, и энзиматически меченные и опосредованные иммунологические тесты, такие как ELISA.
Далее изобретение включает молекулы нуклеиновых кислот, кодирующих последовательность аминокислотных остатков описанных типоспецифических эпитопов и кластертипоспецифических эпитопов. Эти молекулы нуклеиновых кислот применимы в качестве зондов, например, в Southern блотах или других тестах узнавания ДНК, таких как отлавливающее определение, описанное в патентах США N 4868105 и N 5124246.
Изучение антигенного картирования путем экспрессии кДНК HCV показало, что ряд клонов, содержащих эти кДНК, экспрессировали полипептиды, которые были иммунологически реактивными с сывороткой индивидуумов с проявлениями NANBH. Ни один полипептид не был иммунологически реактивен со всеми сыворотками. Пять из этих полипептидов были очень иммуногенными в том смысле, что антитела к HCV-эпитопам в этих полипептидах были выявлены в сыворотках многих различных пациентов, хотя перекрест в выявлении был неполным. Таким образом, результаты по иммуногенности полипептидов, закодированных в различных клонах, позволяют предположить, что эффективные системы выявления инфекции HCV могут включать использование панелей эпитопов. Эпитопы в этих панелях могут быть сконструированы в один или множественные полипептиды. Тесты на различные эпитопы могут быть последовательными или одновременными.
Наборы, удобные для иммунодиагностики и содержащие соответствующие меченые реагенты, создаются путем упаковки соответствующих материалов, включая по данному изобретению полипептиды, содержащие типоспецифические эпитопы и кластертипоспецифические эпитопы или антитела против типоспецифических эпитопов и кластертипоспецифических эпитопов, в удобные контейнеры вместе с оставшимися реагентами и материалами, требующимися для проведения тестов, а также необходимый набор инструкций для проведения тестов.
Далее изобретение включает молекулы нуклеиновых кислот, комплементарные к флаксирующим областям последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих типоспецифические эпитопы и кластертипоспецифические эпитопы. Такие молекулы нуклеиновых кислот пригодны при проведении ПЦР (PCR) для определения генотипа конкретного HCV.
Следует отметить, что вариабельные и гипервариабельные области имеются в геноме HCV, поэтому гомология в этих областях ожидается значительно меньшей, чем во всем геноме.
Методики для определения гомологии последовательности нуклеиновых кислот и аминокислот хорошо известны. Например, последовательность аминокислот может быть определена непосредственно и сравнена с последовательностью, предлагаемой в настоящей работе. Альтернативно может быть определена последовательность нуклеотидов геномного материала предполагаемого HCV (обычно через промежуточную кДНК), может быть определена аминокислотная последовательность, закодированная в нем, и сравнены соответствующие области.
Представленное выше обсуждение и примеры только иллюстрируют изобретение, средний специалист в данной области поймет, что изобретение может быть осуществлено другими путями и изобретение определяется исключительно формулой изобретения.
Пример 1. Сравнение главных эпитопов разнообразных различных типов HC.
Сравнивают гомологию аминокислотных остатков у различных типов и подтипов HCV для разных областей. Подтип HCV - такой, как описан филогенетическим анализом Simmondsa. Нумерация аминокислотной последовательности соответствовала таковой, описанной для последовательности прототипа HCV-1 Choo et al. В таблице 2 показан процент гомологии аминокислотных остатков типоспецифических эпитопов и кластертипоспецифических эпитопов и сохраненного главного эпитопа для области NS4. В таблице 3 показана гомология аминокислотных остатков между двумя типоспецифическими эпитопами или кластертипоспецифическими эпитопами области NS5. В таблице 4 показан процент гомологии аминокислотных остатков главных сохраненных эпитопов нуклеотидной области и типоспецифических эпитопов.
Пример 2. Синтез пептидов
Синтезируют два набора полипептидов. Первый набор разрабатывают для проведения картирования эпитопа HCV-1, а второй набор разрабатывают для определения, какие эпитопы, идентифицированные при изучении картирования эпитопа, содержали типоспецифические эпитопы. В первом наборе полипептидов шестьдесят четыре набора (в дубликатах), перекрывающих октапептидов, были синтезированы Mimotopes по всему HCV-1 полипротеину (3011 аминокислотных остатков).
Второй набор полипептидов получают в соответствии с методом, описанным Geysen (1990) J. Top. Med. Pub. Health, 21: 523-533, и Merrifield (1963) J. Am. Chem. Soc., 85: 2149-2154.
Для синтеза типоспецифического эпитопа во втором наборе полипептидов выбирают четыре антигенных области, которые представляют главные эпитопы неконсервативных последовательностей в HCV-1 из нуклеотида NS4, NS5 и их соответствующих последовательностей из подтипов HCV 1b, 2a, 3a и типа 4. Последовательность из нуклеотида выбирают из менее консервативной области аминокислотных остатков 67-88. Последовательность из NS4 области выбирают из области аминокислотных остатков 1689-1718. Последовательности, выбранные из области NS5, являются из области аминокислотных остатков 2281- 2313 и 2673-2707.
Пример 3. Биологические пробы
Чтобы определить эффективность полипептидов в способности определения различий между антителами, специфическими к различным типам CHV, получают антисыворотки от двадцати четырех хронических пациентов с NANBH из различных районов мира, включая восточное побережье и западное побережье Соединенных Штатов, Японии, Западно-европейских стран, Южноевропейских стран и Южной Африки. Выделение вирусной РНК, синтез кДНК, амплификация ПЦР секвенирование ДНК и гибридизация олигонуклеотидного зонда проводят как описано Cha et al. (1992) Proc Natl. Acad. Sci. USA, 89: 7144-7148.
Пример 4. Процедуры картирования эпитопов
Чтобы определить, какие области HCV содержат эпитопы, группоспецифические или консервативные, весь полипротеин HCV-1 подвергают эпитопному картированию. Примененный метод по существу такой же, как представлен на фиг. 2.
Шестьдесят четыре набора (в дубликатах) перекрывающихся октапептидов синтезируют Mimotopes® через весь полипротеин HCV-1 (3011 аминокислот). Панель из 40 проб, содержащие 25 образцов реактивных антител к HCV из США, 9 реактивных проб к HCV из Японии и 6 HCV- нереактивных проб отрицательного контроля, отбирают для эпитопного картирования и кластерного анализа. Иммунологический тест проводят с использованием стандартных процедур ELISA.
Критерии для идентификации главных эпитопов основываются на частоте реакции антител и интенсивности реакции антител (титр) к этим эпитопам. Результаты представлены на фиг. 3 и 4.
Пример 5. Пептидзависимые, связанные с ферментом иммуносорбентные тесты
Чтобы определить оптимальный иммунологический тест с использованием полипептидов, описанных в примере 2, проводят два отдельных полипептидзависимых связанных с ферментом иммуносорбентных теста ELISA и сравнивают результаты. Первый тип ELISA представляет Nune MaxisoreTM, на котором пептиды просто адсорбируются, а во втором типе используют Nune Covalink NHTM, на котором полипептиды связаны ковалентно. Образование амидных связей между карбоксильными кислотами и аминами инициируется добавлением карбодиимида. Для снижения гидролиза активный сложный эфир можно приготовить добавлением N-гидрокси-сукцинимида (NHS) к вышеуказанным процедурам конъюгирования.
Микротитровальные пластинки для первого типа ELISA готовят следующим образом. Полипептиды помещают в лунки микротитровальных пластин Nune MaxisoreTM в концентрации 1 мкг/на лунку в 100 мкл физраствора с фосфатным буфером (PBS). Полипептиды оставляют на ночь для адсорбции при комнатной температуре. Затем микротитровальные пластины отмывают четыре раза с PBS без детергента. Затем лунки покрывают 220 мкл SuperblookR (Picrce) на один час, а затем отсасывают без дальнейшего промывания и высушивают под вакуумом.
Определение проводят следующим образом. Пробы сыворотки объемом 5 мкл добавляют в лунку со 100 мкл 5% обезжиренного молока и инкубируют один через при 37oC. Затем лунки отмывают пять раз в PBS с 0,05% Tween. Конъюгаты очищенного по сродству козьего анти-человеческого IgG, меченные пероксидазой хрена (Jackson Laboratories), затем используют для определения степени связывания антител человека с полипептидами. Конъюгаты предварительно разбавляют до 5% IgG в 150 mM NaCl, PBS и 5% лошадиной сыворотки (денатурированной нагреванием). 100 мкл конъюгата помещают в лунки и инкубируют один час при 37oC. Затем лунки отмывают пять раз в PBS/Tween и OPD [о-фенилен-диамин-2HCl, одна таблетка на проявляющий буфер (цитрат фосфатный, забуфериренный 0,02% H2O2), Sigma] в течение тридцати минут при комнатной температуре и определяют поглощение при 492 нм и 620 нм. Разницу определяют из 200 случайных (нормальных) образцов при семи стандартных отклонениях от среднего или около 0.45.
Микротитровальные пластины для второго типа ELISA готовят следующим образом. Полипептиды помещают в лунки микротитровальных пластин Nune MaxisorlTM в концентрации 10 мкг/на лунку в 50 мкл воды. Затем добавляют 25 мкл 0,1 М NHS (сульфо-N-гидросукцинимида, Pierсe) и 25 мкл 0.1 М EDC (1-этил-3-(3-диметиламинопропилкарбодиимида) Sigma) к полипептидам и перемешивают при комнатной температуре в течение 30 мин на качающейся платформе. Все содержимое затем добавляют к 52 мл ледяного 0.1 М a-карбонатного буфера pH 8.6. 100 мкл смеси используют для покрытия лунок микротитровальной пластины и затем 30 мин инкубируют при 4oC, затем пластины четыре раза отмывают раствором PBS/0,1% Triton X-100. После этого пластинки обрабатывают Superblock и тест проводят как описано выше.
Полученные результаты представлены в таблицах 5-14.
Пример 6. Тест ингибирования
Тесты ингибирования проводят для определения способности пептидов конкурировать друг с другом в связывании антител. Синтезируют три набора коротких полипептидов из нуклеотидных областей NS4 и NS5 различных типов последовательностей HCV. Эти полипептиды охватывают области последовательностей от аминокислот 1689-1695, 1696-1702 и 1711-1917. Тесты ингибирования проводят добавлением 10 мкг вышеуказанных полипептидов к пробе и инкубации при 37oC в течение одного часа, а затем проводят тест ELISA, как описано выше. Если обнаруженное ингибирование составляло более 50% связывания антител, полипептид считался ингибиторным. Полученные результаты представлены в таблице 15.
Пример 7. Типирование из клинических проб HC
Типо- или кластертипоспецифические эпитопы, представленные в таблице 16, используют в тестах ELISA примера 5 для тестирования 13 клинических проб от больных не-А, не-Б гепатитом (10 платных доноров, 3 зараженных при переливании крови хронических больных не-А, не-Б гепатитом). В таблице 17 представлены результаты этих тестов. Каждую клиническую пробу исследуют на реактивность с двенадцатью различными пептидами, соответствующими данным областям (aa 67-84, 1689-1718 или 2281-2313), представляющим различные типоспецифические или кластертипоспецифические эпитопы. Каждая проба дала нереактивный (NR), слабо реактивный (WR) или реактивный (R) ответ с каждым типированием пептидов. Эти результаты предсказывают генотип HCV для каждой пробы, который коррелирует с генотипом HCV, определенным по ПЦР, представленным в правой колонке.
Изобретение относится к вирусологии и иммунологии и может быть использовано для типирования вируса гепатита С (НСV). Биологический образец контактируют с первым полипептидным реагентом, содержащим типоспецифический эпитоп, специфичный для первого типа вируса гепатита С и/или эпитопа кластерспецифического эпитопа, специфичного к кластеру первого типа вируса гепатита С либо к наборам антител, специфичных для указанных эпитопов. Эпитопы выбирают из эпитопов, локализованных между аминокислотными остатками 67 и 84, 1689 и 1718, и 2281 и 2313 НСV-1 или гомологичных областей НСV других типов. Набор полипептидов включает полипептиды, содержащие аминокислотные последовательности типоспецифического или кластертипоспецифического эпитопов НСV. Изобретение позволяет типировать НСV путем иммунологического анализа. 3 c. и 8 з.п.ф-лы, 4 ил., 17 табл.
| Прибор, замыкающий сигнальную цепь при повышении температуры | 1918 |
|
SU99A1 |
| Огнетушитель | 0 |
|
SU91A1 |
| ДАТЧИК ФАЗЫ | 0 |
|
SU388232A1 |
| Enomoto N | |||
| et al | |||
| Bioch | |||
| Bioph | |||
| Res | |||
| Способ приготовления консистентных мазей | 1919 |
|
SU1990A1 |
