ПРИМЕНЕНИЕ БЕНЗОНАФТАЛИНОВЫХ ПРОИЗВОДНЫХ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ, ПРЕДНАЗНАЧЕННЫХ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ЗАБОЛЕВАНИЙ НЕРВНОЙ СИСТЕМЫ Российский патент 2000 года по МПК A61K31/195 A61K31/395 A61P25/02 A61P25/28 A61P37/00 

Изобретение касается применения соединений, описываемых структурной формулой (I):

и их солей для получения лекарственных средств, предназначенных для лечения периферических нейропатологических состояний, нейродегенеративных заболеваний центральной нервной системы и аутоиммунных заболеваний нервной системы. Указанные соединения, а также способ их получения описаны в патенте ЕР 0199636.

Для этих соединений отмечается активность в отношении дифференцировки и пролиферации клеток, и рекомендуется их использовать в частности, в области дерматологии.

В указанной формуле (I):
- R₁ представляет группу - COR₆ или CH₂OH, где R₆ является радикалом:

или радикалом OR₇, в котором R₇ является атомом водорода, алкилом содержащим от 1 до 20 атомов углерода, моногидроксиалкилом или полигидроксиалкилом r' и r'' являются атомом водорода, низшим алкилом, моно- или полигидроксиалкилом, арилом, возможно замещенным, или аминокислотным остатком или остатком аминосодержащего сахара, или вместе образуют гетероцикл,
- R₂ является атомом водорода, алкилом, разветвленным или неразветвленным, содержащим от 1 до 15 атомов углерода, радикалом алкокси, содержащим от 1 до 4 атомов углерода, или циклоалифатическим радикалом,
- R₃ является атомом водорода, гидроксильным радикалом, алкильным радикалом, разветвленным или линейным, содержащим от 1 до 4 атомов углерода, радикалом алкокси, содержащим от 1 до 10 атомов углерода, циклоалифатическим радикалом замещенным или незамещенным, тиоциклоалифатическим радикалом или радикалом формулы
-O-Si-/CH₃/₂-R₈, в которой R₈ является низшим алкильным радикалом, линейным или разветвленным,
- R₄ и R₅, одинаковые или различные, являются атомом водорода, низшим алкильным радикалом, гидроксильным радикалом или низшим радикалом ацилокси.

Согласно настоящему изобретению из числа алкильных радикалов, разветвленных или неразветвленных, содержащих от 1 до 20 атомов углерода или от 1 до 15 атомов углерода, можно назвать преимущественно следующие радикалы: метил, этил, изопропил, бутил, трет. бутил, гексил, октил, нонил, 2-этилгексил и додецил. Предпочтительно, эти перечисленные радикалы содержат от 1 до 12 атомов углерода.

В том случае, когда алкил является низшим, этот радикал обычно содержит от 1 до 6 атомов углерода. В качестве радикалов низшего алкила можно назвать радикалы метил, этил, пропил, изопропил, бутил, трет.бутил, гексил.

Под терминами "моногидроксиалкил" и полигидроксиалкил" следует понимать радикалы, содержащие от 1 до 6 атомов углерода и от 1 до 5 гидроксильных групп.

Из числа моногидроксиалкильных радикалов предпочтительны радикалы, содержащие 1 или 3 атома углерода, в частности гидроксиметил, 2-гидроксиэтил, 2- или 3-гидроксипропил.

Из числа полигидроксиалкильных радикалов предпочтительны радикалы, содержащие от 3 до 6 атомов углерода и от 2 до 5 гидроксильных групп, такие как радикалы 2,3-дигидроксипропил, 2,3,4-тригидроксибутил, 2,3,4,5-тетрагидроксипентил или остаток пентаэритритола.

Из числа радикалов арила предпочтительны радикалы фенила, тиофена или пиридина, возможно замещенного по меньшей мере одним атомом галогена, гидроксильным радикалом, алкильным радикалом, нитрогруппой, группой метокси или аминогруппой, возможно замещенной. Предпочтителен фенил, возможно замещенный.

Под термином "аминокислотный остаток" понимают, в частности, остаток, являющийся производным одной из аминокислот, таких как лизин, глицин или аспарагиновая кислота. Под термином "пептидный остаток" понимают, в частности, остаток дипептида или трипептида, возникающий в результате сочетания аминокислот.

Из числа "остатков аминосодержащего сахара" можно назвать остатки, являющиеся производными глюкозамина, галактозамина и маннозамина.

Под термином "гетероцикл" предпочтительно понимают радикал пиперидино, морфолино, пирролидино или пиперазино, возможно замещенные в 4-ом положении C₁-C₆-алкилом или полигидроксиалкилом, описанными выше.

Из числа радикалов алкокси, содержащих от 1 до 10 атомов углерода, можно назвать такие радикалы как метокси, этокси, изопропокси, гексилокси и децилокси.

Из числа низших радикалов ацилокси предпочтительны радикалы, содержащие от 1 до 4 атомов углерода, такие радикалы, как например, ацетилокси или пропионилокси.

Под термином "циклоалифатический радикал" понимают алкановый циклический или полициклический радикал, содержащий от 1 до 10 атомов углерода, возможно замещенный одним или несколькими атомами галогена или одним или несколькими гидроксильными радикалами. В частности, можно назвать в этой связи радикалы адамантила или 1-метилциклогексила.

Тиоциклоалифатический радикал предпочтительно является радикалом 1-адамантилтио.

Из атомов галогенов предпочтительны фтор или хлор.

Соединения формулы (I) были изучены с помощью нескольких тестов, в которых измеряли их нейротрофическую активность.

ВЛИЯНИЕ СОЕДИНЕНИЙ ФОРМУЛЫ (I) НА ВЫРАБОТКУ ФАКТОРА РОСТА НЕРВОВ В КУЛЬТУРЕ АСТРОЦИТОВ
Первичные культуры астроцитов были получены из коры головного мозга новорожденных крыс в возрасте 1-2 дня. После вскрытия животных кору мозга измельчали механически путем пропускания через нейлоновое ситечко "Блютекс" с размерами ячейки 83 мМ. Полученные клетки культивировали в культуральной среде DMEM/F 12 (Gibco, Brl 1:1), содержащей 10% эмбриональной бычьей сыворотки, 2,5 мМ L-глютамина, 100 единиц/мл пенициллина и 100 мг/мл стрептомицина (1 кора мозга на 30 мл) в планшетах Coming с 12 лунками из расчета 1 мл клеточного препарата на лунку. Затем планшеты помещают при температуре 37^oC в инкубатор, атмосфера которого насыщена 5% CO₂. Указанную среду меняют каждые три дня, а выращенные культуры используют на 7-й день культивирования, что соответствует 80-90% конфлуэнтности культуры. Далее клетки культивировали в присутствии различных соединений в 500 мл культуральной среды, описанной выше, на лунку, в течение 40 часов. По окончании обработки ФРН, секретированный в среду, изучали методом иммуноферментного анализа, а процентное содержание мембранных белков оценивали по методу Бредфорда с помощью индикаторного реактива кумасси голубого.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФАКТОРА РОСТА НЕРВОВ (ФРН)
С помощью иммуноферментного анализа оценивали уровень ФРН. Лунки 96-луночного планшета обрабатывали в течение 2 часов при 37^oC моноклональным анти-ФРН-антителом, взятом в количестве 0,67 мг/мл и растворенном в буферном растворе Na₂CO₃ количестве 50 мМ при pH = 9,6. Затем обработанные таким образом пластинки инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре в присутствии 1% бычьего сывороточного альбумина (БСА), растворенного в том же самом буферном растворе, после чего их промывали буферным раствором Трис-HCl в количестве 50 мМ (pH = 7,0), содержащим 200 мМ NaCl, 10 мМ CaCl₂, 0,1% реактива Тритон Х-100 и 0,05% NaN₃ (Буфер А). Далее среду астроцитов разбавляли до 9/10 их первоначальной концентрации экстрагирующим буферным раствором (50 мМ Трис-/HCl, pH-7,0, 200 мМ NaCl, 1% БСА, 0,1% Тритон Х-100, 4 мг/мл апротинина, 2 мМ ЭДТА 0,1 мМ хлористого бензетония и 0,05% NaN₃), после чего добавляли по 0,1 мл/лунку раствора, содержащего ФРН (в концентрациях от 10 до 320 пг/мл), (для каждой концентрации - по две параллельные пробы). Затем пластинки инкубировали в течение 16 часов при 37^oC со вторым моноклональным анти-ФРН-антителом в сочетании с бета-галактозидазой (0,13-0,15 единиц/мл). После промывки буфером A пластинки инкубировали в течение 2-3 часов при 37^oC в присутствии субстрата бета-галактозидазы красного бета-D-галактопиранозидхлорфенола (2 мг/мл), растворенных в 10 мМ реактива HEPES (pH = 7,0), содержащего 150 мМ NaCl, 2 мМ MgCl₂, 0,1% NaN₃ и 1% БСА. Продукт реакции измеряли при 570 нМ на приборе Bio Kinetics Reader EL 340.

РЕЗУЛЬТАТЫ
Соединения согласно изобретению увеличивают выработку ФРН. Так, при концентрации 100 нМ наиболее активные из предлагаемых соединений способствуют увеличению выработки ФРН почти на 70% по сравнению с контрольными образцами.

ВЛИЯНИЕ ПРЕДЛАГАЕМЫХ СОЕДИНЕНИЙ НА НЕЙРИТОГЕНЕЗ И РОСТ НЕЙРИТОВ ГАНГЛИЕВ СПИННОМОЗГОВОГО КОРЕШКА
Ганглии спинномозгового корешка (DRG) получают из зародышей крыс в возрасте 14 дней. Взятие проб проводили из трех различных отделов спинного мозга: шейного грудного и крестцового. DRG культивировали в течение 24 часов в питательной среде DMEM (Gibco, Bri), содержащей 5% эмбриональной бычьей сыворотки, 100 единиц/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина, причем атмосфера инкубатора была насыщена на ±5% CO₂. Затем инкубационную среду заменяли идентичной средой, которая не содержала эмбриональной бычьей сыворотки, но содержала 1 мкМ арабинозида цитозина (Sigma) для ингибирования пролиферации не-нейронных клеток.

Влияние предлагаемых соединений на нейритогенез и на рост нейритов оценивали по прошествии 48 часов после начала культивирования среды морфометрическим способом с помощью аналитической системы BIOCOM, позволяющей визуализировать результаты.

РЕЗУЛЬТАТЫ
Некоторые из предлагаемых соединений увеличивают нейритогенез эксплантатов ганглиев спинномозгового корешка более чем на 100% по сравнению с образцами, взятыми для сравнения, при использовании в концентрации 100 пМ.

Мы также провели оценку терапевтического потенциала предлагаемых соединений для лечения аутоиммунных заболеваний нервной системы.

ВЛИЯНИЕ ПРЕДЛАГАЕМЫХ СОЕДИНЕНИЙ НА ПРОЛИФЕРАЦИЮ ЛИМФОЦИТОВ У МЫШИ, ЗАРАЖЕННОЙ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫМ АУТОИММУННЫМ ЭНЦЕФАЛИТОМ (ЭАЭ)
ЗАРАЖЕНИЕ ЖИВОТНЫХ ЭНЦЕФАЛИТОМ ЭАЭ
Мышам-самкам SJb/L делали подкожно инъекцию основного белка миелина (ОБМ, 400 мкг/мышь), эмульгированного в полном адъюванте Фрейнда. Инъекции делали на нулевой и седьмой день эксперимента. Примерно через 20 дней после первой иммунизации осматривали животных и отбирали для теста на пролиферацию лимфатические ганглии тех мышей, у которых появились клинические признаки ЭАЭ. Для проведения теста ганглии отбирали и разобщали на отдельные клетки механически путем пропускания через металлическое сито. Полученные клетки культивировали в питательной среде RPMI (Gibco, Brl), содержащей 10% инактивированной эмбриональной сыворотки теленка, 2,5 мМ L-глютамина, 100 единиц/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 0,5% 2-меркаптоэтанола из расчета 250000 клеток на лунку, помещенные в 96-луночные планшеты. Культуральные планшеты помещали в инкубатор при 37^oC, насыщенный на 5% CO₂. Клетки обрабатывали в день появления культуры различными аналогами ретиноевой кислоты в отсутствие или в присутствии ОБМ (25 мкг/мл, антигенная стимуляция) в течение 96 часов. Степень пролиферации оценивали посредством измерения внедрения в культуру меченного по тритию тимидина, который добавляли в культуральную среду в течение последних 16 часов инкубации.

Анализ результатов теста показывает, что предлагаемые соединения ингибируют пролиферацию лимфоцитов мышей, зараженных ЭАЭ, причем концентрация, соответствующая ингибированию Cl₅₀, составляла от 0,1 до 100 пМ.

ВЛИЯНИЕ ПРЕДЛАГАЕМЫХ СОЕДИНЕНИЙ НА ВЫРАБОТКУ ФАКТОРА НЕКРОЗА ОПУХОЛИ АЛЬФА (TNF-α АКТИВИРОВАННЫМИ МИКРОГЛИАЛЬНЫМИ КЛЕТКАМИ
Первичные культуры микроглиальных клеток
Микроглиальные клетки получали из коры головного мозга новорожденных крыс однодневного возраста. Далее клетки культивировали в питательной среде DMEM (Gibco, BRL), содержащей 10% эмбриональной бычьей сыворотки (неактивированный миоклон), 2,5 мМ L-глютамина, 4,5 г/л L-глюкозы и 100 мкг/мл гентамицина в 96-луночных планшетах. Клетки обрабатывали различными аналогами ретиноевой кислоты и стимулировали добавкой 1 мкг/мл липополисахарида для того, чтобы инициировать выработку фактора TNF-α По истечении 18 часов инкубации культуральные среды исследовали, для выявления фактора TNF-α
Фактор TNF-α в надосадочной жидкости культуры микроглиальных клеток количественно определяли с помощью теста на цитотоксичность на линии клеток L 929. Результаты этого теста оценивались методом колориметрического анализа МТТ.

Показали, что предлагаемые соединения уменьшают выработку фактора TNF-α микроглиальными клетками, активированными в культуре, причем уменьшение достигает 50% при концентрации 10 пМ.

Полученные результаты показывают, что предлагаемые соединения проявляют нейротрофическую активность, которая может найти применение при лечении периферических нейропатий различного типа: травматического, ишемического, метаболического, инфекционного, алкогольного, ятрогенного или генетического, а также при лечении заболеваний, поражающих мотонейроны, таких как боковой амиотрофический склероз (болезнь Шарко) и спинальные амиотрофии. Предлагаемые соединения можно также использовать для изготовления лекарств, предназначенных для лечения ретинопатий, старения (сенильности) головного мозга, слабоумия (деменции) вследствие множественных инфарктов, слабоумия, обусловленного сосудистыми явлениями, при лечении оливопонтоцеребеллярной атрофии (синдрома Дежерина-Томаса) и других нейродегенеративных заболеваний, таких, например, как болезнь Альцгеймера, болезнь Пика или хорея Хантингтона. Соединения согласно изобретению могут также оказаться полезными для предупреждения смерти нейронов ("нейронной смерти"), возникающей вследствие церебрососудистых травм или травм костного мозга или черепа.

И наконец, предлагаемые соединения могут оказаться полезными при лечении патологических состояний аутоиммунного происхождения, таких как рассеянный склероз, болезнь Гийена-Барре-Штроля (острый первичный идиопатический полирадикулоневрит) и тяжелых форм миастении (миастения гравис).

Наиболее активные из предлагаемых соединений описываются следующей формулой:

где R₆ является радикалом

или радикалом OR₇, причем R₇ является атомом водорода, алкилом, содержащим от 1 до 20 атомов углерода, моногидроксиалкилом или полигидроксиалкилом, r' и r'' являются атомом водорода, низшим алкилом, моно- или полигидроксиалкилом, арилом, возможно замещенным, или аминокислотным остатком, или остатком аминосодержащего сахара, или вместе образуют гетероцикл,
R является атомом водорода, гидроксилом, разветвленным или неразветвленным алкилом, содержащим от 1 до 4 атомов углерода, или радикалом алкокси, содержащим от 1 до 4 атомов углерода. Предпочтительными являются 6-[3-(1-адамантил)-4- метоксифенил] -2-нафтойная кислота и 6-[3-(1-адамантил)-4-оксифенил] -2-нафтойная кислота, их сложные эфиры (в частности их сложные метиловые эфиры) и их амиды.

Предлагаемые соединения можно использовать в сочетаниях с одним или несколькими соединениями, относящимися к следующим классам соединений: стероидные и нестероидные противовоспалительные агенты, противовирусные (в особенности противогерпесные) агенты иммуноподавляющие и иммуномодулирующие агенты.

Указанные соединения могут присутствовать в любых фармацевтических формах, приемлемых для приема внутрь энтерально, парэнтерально или наружным путем в комбинации с фармакологически приемлемыми добавками и носителями. Например, указанные соединения могут быть в форме таблеток, драже, капсул, желевых капсул, свечей, пластырей, растворов или суспензий, пригодных для питья или инъекций. Дневной прием указанных средств может быть от 0,01 до 100 мг активного начала.

Изобретение относится к медицине, в частности к неврологии и касается применения бензонафталиновых производных для лечения периферических нейропатических состояний, нейродегенеративных заболеваний центральной нервной системы и аутоиммунных заболеваний нервной системы. Обладая нейротрофической активностью, предложенные соединения позволяют повысить эффективность лечения таких заболеваний. 4 с.п. ф-лы.

1. Применение соединений общей формулы I

и их солей,
где R₁ является группой - COR₆ или СН₂ОН, в которой R₆ является радикалом

или радикалом OR₇, где R₇ является атомом водорода, алкилом, содержащим от 1 до 20 атомов углерода, моногидроксиалкилом или полигидроксиалкилом, r' и r'' являются атомом водорода, низшим алкилом, моно- или полигидроксиалкилом, арилом, возможно замещенным, или аминокислотным остатком или остатком аминосодержащего сахара, или вместе образуют гетероцикл;
R₂ является атомом водорода, разветвленным или неразветвленным алкилом, содержащим от 1 до 15 атомов углерода, радикалом алкокси, содержащим от 1 до 4 атомов углерода, или циклоалифатическим радикалом;
R₃ является атомом водорода, гидроксилом, разветвленным или неразветвленным алкилом, содержащим от 1 до 4 атомов углерода, радикалом алкокси, содержащим от 1 до 10 атомов углерода, замещенным или незамещенным циклоалифатическим радикалом, тиоциклоалифатическим радикалом или радикалом формулы -O-Si (CH₃)₂ -R₃, в которой R₃ является низшим алкилом, линейным или разветвленным, - R₄ и R₅ одинаковые или различные, являются атомом водорода, низшим алкилом, гидроксилом или низшим радикалом ацилокси, в качестве активного начала для получения лекарственных средств, которые можно использовать для лечения периферических нейропатических состояний, нейродегенеративных заболеваний центральной нервной системы и аутоиммунных заболеваний нервной системы. 2. Применение соединений общей формулы

где R₆ является радикалом

или радикалом OR₇, где R₇ является атомом водорода, алкилом, содержащим от 1 до 20 атомов углерода, моногидроксиалкилом или полигидроксиалкилом, а r' и r'' является атомом водорода, низшим аклилом, моно- или полигидроксиалкилом, арилом, возможно замещенным, или аминокислотным остатком, или остатком аминосодержащего сахара, или вместе образуют гетероцикл,
R является атомом водорода, гидроксилом, разветвленным или неразветвленным алкилом, содержащим от 1 до 4 атомов углерода или радикалом алкокси, содержащим от 1 до 4 атомов углерода в качестве активного начала, для получения лекарственных средств, позволяющих лечить периферические нейропатологические состояния, нейродегенеративные заболевания центральной нервной системы и аутоиммунные заболевания нервной системы. 3. Применение 6-[3-(1-адамантил)-4-метоксифенил]-2-нафтойной кислоты, ее сложных эфиров и/или ее амидов в качестве активного начала, для получения лекарственных средств, позволяющих лечить периферические нейропатологические состояния, нейродегеративные заболевания центральной нервной системы и аутоиммунные заболевания нервной системы. 4. Применение 6-[3-(1-адамантил)-4-оксифенил] -2-нафтойной кислоты, ее сложных эфиров и/или ее амидов в качестве активного начала, для получения лекарственных средств, позволяющих лечить периферические нейропатологические состояния, нейродегеративные заболевания центральной нервной системы и аутоиммунные заболевания нервной системы.