ШТАММ БАКТЕРИЙ ENTEROBACTER CLOACAE ГИСК № 258, ОБЛАДАЮЩИЙ КОМПЛЕКСОМ ФАКТОРОВ ПАТОГЕННОСТИ Российский патент 2001 года по МПК C12N1/20 C12Q1/06 C12Q1/10 C12N1/20 C12R1/01 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения термолабильного энтеротоксина (ЛТ-энтеротоксина) и анатоксина Enterobacter cloacae при производстве вакцин.

Техническим результатом является штамм Enterobacter cloacae N 443, обладающий повышенной токсинопродуцирующей способностью. Штамм Enterobacter cloacae N 443 выделен из испражнений больного с острым лейкозом в Республиканской клинической больнице им. Г.Г. Куватова г. Уфы, депонирован в коллекции Государственного научно-исследовательского института стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А. Тарасевича и имеет регистрационный номер 258.

Штамм Enterobacter cloacae ГИСК N 258 характеризуется следующими признаками:
Культуральные признаки.

При выращивании на обычных питательных средах при температуре 37^oC штамм на поверхности питательной среды растет с образованием характерных изолированных колоний с желтоватым оттенком. При выращивании в бульоне Хоттингера (pН 7,2) при температуре 37^oC в течение 24 ч - вызывает равномерное помутнение с выпадением осадка.

Способы определения активности ЛТ-энтеротоксина:
Субплантарное введение мышам весом 15-16 г 0,05 мл центрифугата 20-часовой бульонной культуры вызывает отек лапки более 110 мг (Аксенова Е.В., 1980).

Интраназальное введение 0,05 мл 20-часовой бульонной культуры вызывает гибель 95% мышей-самцов весом 15-16 г в течение 20 минут при явлениях тонических судорог и асфиксии (Войно-Ясенецкая Н.К., 1967).

Внутримышечное введение 300 млн микробных клеток 20-часовой бульонной культуры вызывает некроз кожи кролика диаметром 3,6 см.

В опыте петля тонкой кишки кролика при введении 500 млн м.т. 20-часовой бульонной культуры дает положительный результат (V/L=1,2).

Гретый при 56^oC в течение 45 мин центрифугат 20-часовой бульонной культуры вызывает отек лапки мышей до 30 мг, не вызывая некроза кожи кролика. Гретая при 100^oC 20-часовая культура не вызывает накопления жидкости в изолированной петле тонкого кишечника кролика (V/L=0,3).

Условия хранения культуры после леофильной сушки при выращенной в 0,3%-ном МПА (pН 7,2), залитым стерильным вазелиновым маслом, при температуре 4^oC.

Среды для размножения - бульон Хоттингера (pН 7,2), содержащий 5% эритроцитов кролика при температуре 37^oC в течение 24 часов.

Генетические особенности: Hly+, Ent+, MS+, MR+.

Устойчив к пенициллину, левомицитину, карбенициллину, олеандомицину, цефалексину, рифампицину.

Пример 1.

0,1 мл 1 млрд суспензии суточной агаровой культуры в физиологическом растворе сеют в стерильный бульон Хоттингера (5 мл, pН 7,2), инкубируют в термостате при 37^oC в течение 20 часов, центрифугируют при 6000 об/мин в течение 7 минут. Полученную надосадочную жидкость (центрифугат) в объеме 0,05 мл вводят субплантарно в заднюю левую лапку мышей-самцов весом 15-16 г. Через 24 часа животных умерщвляют эфиром и ампутированные по голеностопному суставу лапки взвешивают на торсионных весах, при этом центрифугат штамма Enterobacter cloacae ГИСК N 258 давал разницу между левой и правой лапками не менее 120 мл, остальные 20 штаммов, способные продуцировать ЛТ-энтеротоксин, - от 65 до 90 мг. Контроли - нативный стерильный бульон Хоттингера (pН 7,2) и гретый при 56^oC центрифугат 20-часовой бульонной культуры 30-35 мг соответственно.

Результаты приведены в таблице.

Пример 2.

0,1 мг 1 млрд суспензии суточной агаровой культуры сеют в бульон Хоттингера (pН 7,2), инкубируют в термостате при 37^oC в течение 20 ч и 500 млн м. т. суспензию в объеме 1 мл вводят в сегмент изолированной петли тонкого кишечника кролика. Через 16 часов животных умерщвляют воздушной эмболией и рассчитывают соотношение объема экссудата к длине сегмента (V/L). При этом 20-часовая бульонная культура штамма Enterobacter cloacae ГИСК N 258 оказалась способной давать накопление жидкости в большом количестве и показатель V/L составил 1,2. У остальных 20 штаммов, способных продуцировать ЛТ-энтеротоксин, показатель V/L колебался в пределах 0,9-1,0. При введении стерильного бульона Хоттингера и гретой при 100^oC 20-часовой бульонной культуры отношение объема накопленной жидкости к длине сегмента составило 0,25 и 0,3 соответственно.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения термолабильного энтеротоксина (ТЛ-энтеротоксина) и анатоксина Enterobacter cloacae при производстве вакцин. Штамм бактерий Enterobacter cloacae ГИСК 258 обладает комплексом факторов патогенности, а также повышенной токсинопродуцирующей способностью. 1 табл.

Штамм бактерий Enterobacter cloacae ГИСК 258, обладающий комплексом факторов патогенности.