Способ иммобилизации люциферазы светляков Советский патент 1982 года по МПК A61K38/44 C12N11/02 

Изобретение относится к неописанному ранее способу получения иммобилизованной люциферазы светляков, Указанньзй фермент является уникальным для аналитического определения аденозинтрифосфата (АТФ) в различных биологических препаратах, поэтому раработка методов его получения, особенно в иммобилизованном состоянии, важна для целей медицинской биохимии в частности для диагностики инфаркта миокарда. Растворимая люцифераза светляков является очень лабильным ферментом и легко инактивируется. Препарат люциферазы светляков за четыре дня хранения при комнатной температуре теряет почки 99% своей активности. В литературе отсутству ют данные о возможных путях ее стабилизации и создании таких нерастворимых форм фермента, которые могли, бы быть использованы многократно.

Предлагаемый способ основан на химическом методе иммобилизации путем образования ковалентной связи между ферментом и полимерным носителем, модифицированным введением груп способных реагировать с ферментом 1 J.

Предлагаемый способ иммобилизации люциферазы светляков заключается в том, что слабощелочный экстракт лампочек светляков с рН 7,5-8,0 и ионной силой 0,1-0,2 М обрабатывают при 2-15°С предварительно модифициро ваннь1ми введением групп, способных реагировать с ферментом, полимерами на основе полисахаридов или полиак0рилатов. Полученную твердую фазу отделяют обычными приемами. Предпочтительно в качестве полимеров на основе полисахаридов использовать сефарозу или сефадекс, модифициро5ванные BrCN, или - в качестве полимеров на основе полиакрилатов - полиметакриловую кислоту, модифицированную карбодиимидом,и процесс осуществляют при 2-5°С.

0

Цель изобретения - решить как проблему стабилизации люциферазы, так и проблему получения фермента, пригодного, для многократного использования.

5

Сущность способа заключается в следующем. Водный экстракт люцифера,зы-, полученный экстракцией обезвоженных лампочек светляков буферным раствором с рН 7,5-8,0 и ионной силой

0 0,1-0,2 М обрабатывают предварительно модифицированными полисахаридами (сефароэа или сефадекс, обработанные BrCN, целлофан, модифицированный периодатом калия) или полиакрилатом (полиметакриловая кислота, модифицированная карбодиимидом) при . Для предотвращения инактивации Ферме та все операции лучше проводить при . Полученную иммобилизованную люцифераэу отделяют известными приемами, например отфильтровывают. Стабильность фермента, полученного способом изобретения, в 10 раз (22°С) превышает стабильность растворимого фермента в тех же условиях,

Выбор для иммобилизации люциферазы полимеров указанной природы (полисахариды, полиакрилаты) создает условия, при которых носитель химически взаимодействует преимущественно с молекулами белка и не взаимодействует с другими низко- и высоко молекулярными примесями, содержащимися в экстракте, в частности с субстртами люциферазы люциферином и АТФ. в результате помимо иммобилизации происходит также очистка люциферазы от сопуствующих низко- и высокомолекулярных примесей.

П р и м .е р 1. 60 мг предварительно высушенных над Са Сб в вакууме лампочек светляков растирают в тонкий порошок и экстрагируют 3 мл трис-ацетатного 0,02 М буфера, 2 мМ ЭДТА, (этилендиаминтетрауксусная кислота) 0,1 М Na С , рН 7,9 при в течение 30 мин. Полученную суспензию центрифугируют (15000 об/м ) в течение 10 мин. Раствор отделяют, а осадок промывают 2 мй того же буфера и вновь центрифугируют. К соединенным водным фракциям (5 мл) добавляют набухший порошок (283 мг) BrCN актифйрованной сефарозы. Суспензию встряхивают при 4°С в течение 25 ч. Полученный в результате полимер с ковалентно присоединенным к нему ферментом отделяют на пористом стеклянном фильтре и осадок промывают 10 раз по 5 мл попеременно ацетатным буфером (0,02 М; 1 М NaC ) и трис-ацетатным буфером (0,02 М; 1 М NaC ), а затем 5 раз по 5 мл дистиллированной водой до тех пор, пока в промывных водах люциферазная активность упадет до нуля. Полученный в результате препарат иммобилизованнойлюциферазы содержит 12% от общей активности сырого экстракта., Суспензию хранят в 0,02 М трис-ацетатном буфере, рН 7,75, 2 мМ ЭДТА. При хранении в течение месяца при суспензия иммобилизованной люциферазы сохраняет более 30% ферментативной активности.

П р и м е р 2. Экстракцию и иммо билизацию люциферазы проводят точно также, как указано в примере 1 при 2с но в качестве носителя к сырому экстракту добавляют 260 мг полиметакриловой кислоты, предварительно обработанной 1-этил-3-(3-диметил-. -аминопропил)-карбодиимид гидрохлоридом. Полученный в результате препаt aT иммобилизованной люциферазы светляков содержит 8% от активности сырого экстракта.

П р им ер 3. Экстракцию и иммобилизацию проводят точно также, как указано в примере 1 при температуре . Полученный в результате препарат иммобилизованной люциферазы светляков содержит 0,09% от активности сырого экстракта.

Применение иммобилизованной люциферазы светляков дает большие преимущества по сравнению с растворимым ферментом, так как появляется возможность многократного использования люц1 феразы, что значительно уменьшает расход дорогостоящего фермента. После иммобилизации резко возрастает срок хранения фермента, так в течение месяца при иммобилизованный фермент сохраняет более 30% активности, в то время как препарат высокоочищенной растворимой люциферазы только 4%. Все выше указанное делает иммобилизованную люциферазу более перспективной для использования в клинических условиях КП.Ц определения уровня АТФи АТФ - зависимых ферментов в различных тканях. Существенным достоинством изобретения является то, что в качестве источника фермента используется не чистый фермент, а сырой экстракт. При этом в процессе иммобилизации достигается очистка люциферазы от ряда сопутствующих низко и высокомолекулярных примесей.

Формула изобретения

1.Способ иммобилизации люциферазы светляков, отличающийся тем, что слабощелочный экстракт лампочек светляков с рН 7,5-8,0 и ионной силой 0,1-0,2 М обрабатывают при 2-15с предварительно модифицированными введением групп, способных реагировать с ферментом, полимерами на основе полисахаридов или полиакрилатов.

2.Способ ПОП.1, отличающийся тем,что в качестве полимеров на основе полисахаридов используют сефарозу или сефадекс, модифицированные BrCN.

3.Способ ПОП.1, отличающий с я тем, что в качестве полимеров на основе полиакрилатов исполь56603786

зуют полиметакриловую кислоту, моди-Источники информации,

фицированную карбодиимидом.принятые во внимание при экспертизе

4. Способ по П.1, отличаю- 1. БереэинИ,В. и Антонов В.К. Имщ и и с я тем, что процесс ведутмобилизованные ферменты. М,, МТУ,

при 2-5-0. 1, 126-158, 1975.