ПЕРЕНАПРАВЛЕНИЕ КЛЕТОЧНОГО ИММУНИТЕТА ПОСРЕДСТВОМ ХИМЕРНЫХ РЕЦЕПТОРОВ Российский патент 2001 года по МПК A61K48/00 C12N5/00 A61P37/00 

Изобретение относится к функциональным химерам рецептора T-клетки, F_c рецептора или рецептора В клетки, которые способны к перенаправлению функции иммунной системы. Более конкретно, оно относится к регуляции лимфоцитов, макрофагов, природных киллерных клеток или гранулоцитов путем экспрессии в указанных клетках химер, которые заставляют клетки отвечать на мишени, распознаваемые химерами. Изобретение относится также к функциональным химерам рецептора T клеток, F_c рецептора или рецептора В клетки, которые способны к направлению терапевтических клеток на специфическое распознавание и разрушение как клеток, инфицированных специфическим инфицирующим агентом, самого инфицирующего агента, опухолевой клетки, так и аутоиммунно-генерированной клетки. Более конкретно, изобретение относится к продукции химер рецептора T клетки, F_c рецептора или рецептора В клетки, способных к специфическому распознаванию и лизису клеток, экспрессирующих белки оболочки ВИЧ. Таким образом, изобретение описывает лечение заболеваний, таких как СПИД (синдром приобретенного иммунодефицита), который вызывается вирусом ВИЧ.

Распознавание T клеткой антигена при помощи рецептора T клетки является основой в ряду иммунологического феномена. T клетки направляют то, что называется опосредованным клеточным иммунитетом. Это включает разрушение клетками иммунной системы чужеродных тканей или инфицированных клеток. Существует разнообразие T клеток, включая "хелперные" и "супрессорные" клетки, которые моделируют иммунный ответ, цитотоксические (или "киллерные") клетки, которые могут непосредственно убивать аномальные клетки.

T клетка, которая распознает и связывает уникальный антиген, проявляемый на поверхности другой клетки, становится активированной; она может затем размножиться и, если она является цитотоксической клеткой, она может убивать связанную клетку.

Аутоиммунное заболевание характеризуется продукцией как антител, которые реагируют с тканью хозяина, так и иммунных эффекторных T клеток, которые являются аутореактивными. В некоторых случаях аутоантитела могут появляться в результате обычного T- и B-клеточного ответа, активированные посредством чужеродных веществ или организмов, которые содержат антигены, которые имеют перекрестную реакцию с близкими соединениями в тканях организма. Примерами клинически родственных аутоантител являются антитела против рецепторов ацетилхолина при миастении гревис; и анти-ДНК, анти-эритроцитарные, и анти-тромбоцитарные антитела при системной эритроматозной волчанке.

ВИЧ и иммунопатогенез
В 1984 г. было показано, что ВИЧ является этиологическим агентом СПИДа. С того времени определение СПИДа было пересмотрено несколько раз по отношению к критерию, который должен быть включен в диагноз. Однако, несмотря на разброс диагностических параметров, простое общее определение представляет СПИД как инфекцию ВИЧ и последующее развитие стойких конституциональных симптомов и определяемых СПИДом заболеваний, таких как вторичные инфекции, новообразования и неврологическое заболевание. Harrison's Principles of Internal Medicine, 12^th ed., McGraw Hill (1991).

ВИЧ является ретровирусом человека группы лентивирусов. Четыре различных ретровируса человека принадлежат к двум различным группам: HTLV-1, HTLV-2 и вирусам иммунодефицита ВИЧ-1, ВИЧ-2. Первые являются трансформирующими вирусами, тогда как вторые являются цитопатическими вирусами.

ВИЧ-1 идентифицирован как наиболее распространенная причина СПИДа во всем мире. Гомология последовательности между ВИЧ-2 и ВИЧ-1 составляет около 40%, при этом ВИЧ-2 более близок к некоторым членам группы вирусов иммунодефицита обезьян (BИО= SlV). См. , Curran et al., Science 329: 1357-1359 (1985); Weiss et al., Nature 324: 572-575 (1986).

ВИЧ имеет обычные ретровирусные гены (env, gag и pol), а также шесть дополнительных генов, участвующих в репликации и других биологических активностях вируса. Как ранее установлено, общим проявлением СПИДа является выраженная иммуносупрессия, преимущественно опосредованного клеточного иммунитета. Это подавление иммунитета приводит к различным сопутствующим заболеваниям, в частности, к некоторым инфекционным заболеваниям и новообразованиям.

Было показано, что основной причиной иммунного поражения при СПИДе является количественный и качественный дефицит у субъекта тимусных (T) лимфоцитов популяции T4. Эта популяция клеток фенотипически определяется по наличию на поверхности молекулы CD4, которая, как было показано, является клеточным рецептором для ВИЧ. Dalgieish et al., Nature 312: 763 (1984). Хотя T4 клетка является основным клеточным типом, инфицируемым ВИЧ, по существу любая клетка человека, которая экспрессирует молекулу CD4 на своей поверхности, способна к связыванию и инфицированию ВИЧ.

По традиции CD⁺ T клеткам приписывают роль хелперов/индукторов, отмечая их функцию в проведении активирующего сигнала к B клеткам, или индукции T лимфоцитов, несущих реципрокный CD8 маркер, для превращения в цитотоксические/супрессорные клетки. Reinherz and Schlossman, Cell 19: 821-827 (1980); Goldstein et al., Immunol. Rev. 68: 5-42 (1982).

ВИЧ связывается специфически и с высоким сродством через последовательность аминокислот в вирусной оболочке (gp120) с частью VI области молекулы CD4, расположенной около N-конца. После связывания вирус сливается с мембраной клетки-мишени и интернализуется. Будучи интернализованным, вирус использует фермент обратную транскриптазу для транскрипции своей геномной РНК в ДНК, которая интегрируется в клеточную ДНК, где она существует в течение жизни клетки в виде "провируса".

Провирус может сохраняться латентным или быть активированным для транскрипции мРНК и геномной РНК, ведущей к синтезу белка, сборке, образованию нового вириона и проникновения вируса через клеточную поверхность. Хотя точный механизм, посредством которого вирус индуцирует гибель клетки не установлен, предполагается, что основным механизмом является массивный выход вируса через клеточную поверхность, приводя к разрушению плазматической мембраны и вызывая нарушение осмотического равновесия.

В течение инфекции организм хозяина вырабатывает антитела против вирусных белков, включая основные гликопротеины оболочки gp120 и gp41. Вопреки гуморальному иммунитету заболевание прогрессирует, приводя к летальному подавлению иммунитета, характеризующемуся многочисленными сопутствующими инфекциями, паразитарными заболеваниями, слабоумием и смертью. Неспособность антивирусных антител хозяина остановить развитие заболевания представляется одним из наиболее вызывающих беспокойство и тревогу аспектов инфекции, предсказательно слабыми для попыток вакцинации, основанных на обычных подходах.

Два фактора могут играть роль в эффективности гуморального ответа на вирусы иммунодефицита. Во-первых, подобно другим РНК-содержащим вирусам (и в частности, подобно ретровирусам) вирусы иммунодефицита проявляют высокую степень мутаций в ответ на иммунный контроль хозяина. Во-вторых, гликопротеины оболочки сами по себе являются интенсивно гликозилированными молекулами, представляющими несколько эпитопов, подходящих для высокоаффинного связывания антител. Слабая антигенная мишень, которую представляет вирусная оболочка, позволяет хозяину немного возможностей противостоять вирусной инфекции путем выработки специфических антител.

Клетки, инфицированные вирусом ВИЧ, экспрессируют гликопротеин gp120 на своей поверхности. Gp120 опосредует процесс слияния среди клеток CD⁺ посредством реакции, близкой к той, которая опосредует проникновение вируса в неинфицированные клетки, приводя к образованию короткоживущих многоядерных гигантских клеток. Образование синтиция зависит от непосредственного взаимодействия гликопротеина оболочки gp120 с белком CD4. Dalgleish et al., выше; Klatzman et al., Nature 312:763 (1984): McDougal et al., Science 231:382 (1986); Sodroski et al., Nature 322:470 (1986); Lifson et al., Nature 323: 725 (1986); Sodroski et al., Nature 321:412 (1986).

Доказательством того, что связывание CD4-gpl20 является ответственным за вирусную инфекцию клеток, несущих антиген CD4, включает обнаружение того, что образуется специфический комплекс между gp120 и CD4 (McDougal et al., выше). Другие исследователи показали, что линии клеток, которые не инфицируются ВИЧ, переводятся в инфицируемые линии клеток после трансфекции и экспрессии к ДНК гена CD4 человека. Maddon et al., Cell 46: 333-348 (1986).

Многими группами были предложены и успешно продемонстрированы in vitro терапевтические программы, основанные на растворимом CD4 в качестве пассивного агента для помехи при вирусной адсорбции и опосредованной синцитием клеточной трансмиссии (Deen et al., Nature 331:82-84 (1988); Fisher et al., Nature 331: 76-78 (1988); Hussey et al., Nature 331: 78-81 (1988); Smith et al. , Science 238: 1704-1707 (1987); Traunecker et al., Nature 331: 84-86 (1988)) и затем были разработаны белки слияния CD4-иммуноглобулин с увеличенной продолжительностью полужизни и умеренной биологической активностью (Capon et al., Nature 337: 525- 531 (1989); Traunecker et al., Nature 339: 68-70 (1989); Byrn et al., Nature 344: 667-670 (1990); Zettleissl et al., DNA Cell Biol., 9:347-353 (1990)). Хотя конъюгаты CD4-иммунотоксин или белки слияния проявляют эффективную цитотоксичность по отношению к инфицированным клеткам in vitro (Chaudhary et al., Nature 335: 369-372 (1988); Till et al., Science 242: 1166-1168 (1988)), латентность синдрома иммунодефицита делает ее маловероятной, поскольку любое одноразовое лечение будет эффективным в устранении вирусоносительства, а антигенность чужеродных белков слияния очевидно будет ограничивать их применимость для требуемого лечения повторными дозами. Испытания на обезьянах, зараженных SIV, показали что растворимый CD4, если введение животным не сопровождается заметной CD4 цитопенией, может понижать титр SIV и увеличивать показатели миелоидного потенциала in vitro (Watanabe et al., Nature 337: 267-270 (1989)). Однако, наблюдалось быстрое появление вируса после преходящего лечения, предполагая, что введение может быть необходимым в течение всей жизни для предотвращения ослабления иммунной системы.

T клетки и F_c рецепторы
Экспрессия на поверхности клетки наиболее распространенного вида антигена рецептора T клетки (TCR) требует совместной экспрессии, по крайней мере, 6 раздельных полипептидных цепей (Weiss et al., J. Exp. Med. 160: 1284-1299 (1984); Orloffhashi et al., Nature 316: 606-609 (1985); Berkhout et al., J. Biol. Chem. 263: 8528-8536 (1988); Sussman et al., Cell 52: 85-95 (1988)), α/β цепи связывания антигена, три полипептида CD3 комплекса и ζ. Если любая из цепей отсутствует, то нет уверенности в стабильной экспрессии оставшихся членов комплекса. ζ является лимитирующим полипептидом для экспрессии на поверхности полного комплекса (Sussman et al., Cell 52: 85-95 (1988)), и предполагается, что он опосредует, по крайней мере, часть программ клеточной активации, запускаемой при распознавании лиганда рецептором (Weissman et al. , EMBO J. 8:3651-3656 (1989); Frank et al., Science 249: 174-177 (1990)). Интегральный мембранный гомодимер ζ (зета) I типа 32 kDa имеет внеклеточный домен из 9 остатков при отсутствии сайтов для N-связанного присоединения гликана и внутриклеточный домен из 112 остатков (мышь) или из 113 остатков (человек) (Weissman et al., Science 238:1018-1020 (1988); Weissman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 9709-9713 (1988)). Изоформа ζ, называемая η (эта) (Baniyash et al., J.Biol. Chem. 263: 9874-9878 (1988); Orloff et al., J.Biol. Chem. 264: 14812-14817 (1989)), которая возникает из альтернативного пути сплайсинга мРНК (Jin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:3319-3323 (1990)), присутствует в пониженном количестве в клетке, экспрессирующей рецептор антигена. Предполагается, что ζ-η гетеродимеры опосредуют образование инозитолфосфатов, а также рецептор-опосредуемую запрограммированную гибель клетки, называемую апоптозом (Mercep et al., Science 242:571-574 (1988); Mercep et al., Science 246:1162-1165 (1989)).

Подобно ζ и η, в клеточных поверхностных комплексах экспрессируется ассоциирующаяся с F_c рецептором γ (гамма) цепь с дополнительными полипептидами, некоторые из которых опосредуют распознавание лиганда, и другие из них имеют неопределенную функцию, γ обладает гетеродимерной структурой и в общей организации очень близка к ζ и является компонентом высокоаффинного F_cεRI IgE рецептора у тучных клеток и базофилов, который, по крайней мере, состоит из трех различных полипептидных цепей (Blank et al., Nature 337: 187-189 (1989); Ra et al., Nature 241: 752-754 (1989)) и одного из низкоаффинных рецепторов для lgG, представленного у мышей F_cγRIIα (Ra et al., J. Biol. Chem. 264: 15323-15327 (1989)), и у человека подтипом CD16, экспрессируемого макрофагами и природными киллерными клетками - CD16_TM (CD16 трансмембранный) (Lanier et al. , Nature 342: 803-805 (1989); Anderson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2274-2278 (1990)) и полипептидом неопределенной функции (Anderson et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 87: 2274-2278 (1990). Недавно было сообщено, что γ экспрессируется линией T клеток мыши CTL, у которой он образует гомодимеры, а также γ-ζ и γ-η гетеродимеры (Orloff et al., Nature 347: 189-191 (1990)).

F_c рецепторы опосредуют фагоцитоз иммунного комплекса, трансцитоз и зависящую от антитела клеточную цитотоксичность (ADCC) (Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991); Unkeless et al., Annu. Rev. Immunol. 6: 251-281 (1988); и Mellman, Curr. Opin. Immunol. 1:16-25 (1988)). Недавно было показано, что одна из изоформ низкоаффинного F_c рецептора мыши F_cRγIIB1 опосредует интернализацию покрытых Ig мишеней в покрытые клатрином ямки, и что другой низкоаффинный рецептор F_cRγIIIA опосредует ADCC посредством их ассоциации с одним или несколькими членами небольшой семьи "триггерных молекул" (Miettinen et al., Cell 58: 317-327 (1989); и Hunziker and Mellman, J. Cell. Biol. 109:3291-3302 (1989)). Эти триггерные молекулы, ζ цепь рецептора T клетки, цепь η TCR, γ цепь F_c рецептора взаимодействуют с доменами распознавания лиганда рецепторов различных иммунных систем и могут автономно инициировать клеточные эффекторные программы, включая цитолиз, последующую агрегацию (Samelson et al., Cell 43: 223-231 (1985); Weissman et al., Science 239: 1018-1020 (1988); Jin et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 87: 3319-3323 (1990); Blank et al., Nature 337: 187-189 (1989); Lanier et al., Nature 342: 803-805 (1989); Kurosaki and Ravetch, Nature 342: 805-807 (1989); Hibbs et al., Science 246: 1608-1611 (1989); Anderson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2274-2278 (1990) и lrvin and Weiss, Cell 64: 891-901 (1991)).

Однако в нарисованных параллелях между семействами низкоаффинных F_c рецепторов мыши и человека становится ясно, что изоформы F_cRγIIA и C не имеют двойника у мыши. Частично поэтому их функция еще не определена.

Поскольку гуморальные агенты, основанные только на CD4, могут иметь ограниченное применение in vivo, предыдущая работа исследовала возможность усиления клеточного иммунитета к ВИЧ. Было описано получение химерного белка, у которого внеклеточный домен CD4 слит с трансмембранным и/или внутриклеточным доменами рецептора T клетки, F_c рецептором IgG или элементами передачи сигнала В клетки (U.S.S.N/07/847566 и 07/665961 включены здесь в качестве ссылки). Цитотоксические T клетки, экспрессирующие химеры, которые включают внеклеточный домен CD4, показывают эффективное МНС-зависимое разрушение клеточных мишеней, экспрессирующих белки оболочки BИЧ. Особенно важным и новым компонентом данного подхода была идентификация единичного рецептора T клетки, F_c рецептора и рецепторных цепей B клетки, агрегация которых достаточна для инициации клеточного ответа.

Одним из конкретно применимых приложений настоящего подхода было изобретение химер между CD4 и ζ,η или γ, которые направляют цитолитические T лимфоциты на распознавание и уничтожение клеток, экспрессирующих gp120 ВИЧ (U.S. S.N/07/847566 и 07/665961, включенные в качестве ссылки).

Несмотря на то, что по своей сути рецепторы T клетки, В клетки и F_c рецептор являются или могут быть чрезвычайно сложными многомерными структурами, не приспособленными к удобным манипуляциям, настоящее изобретение демонстрирует свойство способности создания химер между внутриклеточным доменом любой из различных молекул, которые способны удовлетворить задаче распознавания мишени. В частности, образование химер, состоящих из внутриклеточной части цепей рецептора T клетки/F_c рецептора зета, эта или гамма, соединенных с внеклеточной частью подходящим образом сконструированной молекулы антитела позволяет потенциалу распознавания мишени иммунной системы клетки быть специфически направленным на антиген, распознаваемый внеклеточной частью антитела. Таким образом, обладая частью антитела, способной к распознаванию некоторой детерминанты на поверхности патогена, иммунная система клеток, вооруженная химерой, будет отвечать на наличие патогена, соответственно эффекторной программе ее дифференцировки, например, T хелперные лимфоциты будут отвечать посредством цитотоксической активности в отношении мишени, а B лимфоциты будут активированы для синтеза антитела. Макрофаги и гранулоциты будут осуществлять свои эффекторные программы, включая выделение цитокина, фагоцитоз и генерирование активного кислорода. Аналогично, имея часть антитела, способную к распознаванию опухолевых клеток, реакция иммунной системы на опухоль будет благотворно повышенной. Обладая антителом, способным к распознаванию, иммунные клетки, имеющие неподходящую реактивность по своим детерминантам, аутореактивные клетки могут быть избирательно нацелены на уничтожение.

Несмотря на эти примеры, описывающие использование химерных антител в качестве удобного демонстрационного инструмента, изобретение не ограничивается в объеме химерными антителами, и конечно, использование специфических внеклеточных доменов не антител может иметь важные преимущества. Например, имея внеклеточную часть, которая является рецептором для вируса, бактерии или паразита, клетки, вооруженные химерами, будут специфически выбирать клетки, экспрессирующие вирусную, бактериальную или паразитарную детерминанты. Преимуществом этого подхода перед использованием антител является то, что естественный рецептор для патогена может иметь уникально высокую селективность или аффинность по отношению к патогену, позволяющую большую степень точности в конечном ответе иммунной системы. Аналогично, удаление клеток иммунной системы, которые неподходящим образом реагируют с собственным антигеном, это может быть достаточным для присоединения антигена (либо в виде интактного белка, в случае обедняющей терапии по B клетке, либо в виде МНС комплекса, в случае обедняющей терапии по T клетке) к внеклеточным цепям зета, эта или гамма, и посредством этого воздействовать на специфическое нацеливание клеток, неправильно реагирующих на собственные детерминанты.

Другим использованием химер является регуляция клеточных популяций in vivo последовательно с другими видами генетической инженерии. Например, предлагается использование проникающих в опухоль лимфоцитов или природных киллерных клеток для внесения цитоксических начал в участок опухоли. Настоящее изобретение описывает удобное приспособление для регуляции количества и активности таких лимфоцитов и клеток без удаления их из тела пациента для амплификации in vitro. Таким образом, поскольку внутриклеточные домены химерных рецепторов опосредуют пролиферативный ответ клеток, координация внеклеточных доменов посредством различных агрегационных стимулов, специфических для внеклеточных доменов (например, антител, специфических по отношению к внеклеточному домену), будет приводить к пролиферации клеток, несущих химеры.

Хотя специфические осуществления настоящего изобретения включают химеры между зета, эта или гамма цепями, или их активными фрагментами (например, обсуждаемыми ниже), любой рецепторной цепью, имеющей близкую функцию с этими молекулами, например, у гранулоцитов или В лимфоцитов, могут быть использованы в целях, описанных здесь. Отличительные черты желаемых триггерных молекул иммунной клетки включают способность сливаться с внеклеточным доменом таким образом, чтобы полученная химера присутствовала на поверхности терапевтической клетки, и способность инициировать клеточные эффекторные программы после имевшей место вторичной агрегации с лигандом-мишенью.

В настоящее время наиболее удобным способом доставки химер к клеткам иммунной системы является генетическая терапия в некоторых видах. Однако перенастройка клеток иммунной системы химерными рецепторами путем смешивания клеток с подходящим солюбилизированным очищенным химерным белком будет также приводить к образованию популяции сконструированных клеток, способных к ответу на мишени, распознаваемые посредством внеклеточного домена химер. Подобные подходы были использованы, например, для введения интактного CD4 рецептора для BИЧ в эритроциты в терапевтических целях. В этом случае сконструированная клеточная популяция не будет способна к самообновлению.

Настоящее изобретение относится к функциональным упрощенным химерам рецептора T клетки, рецептора B клетки и F_c рецептора, которые способны к перенастройке функции иммунной системы. Более конкретно, оно относится к регуляции лимфоцитов, макрофагов, природных киллерных клеток или гранулоцитов путем экспрессии в указанных клетках химер, которые направляют клетки реагировать на мишени, распознаваемые химерами. Изобретение относится также к способу направления клеточных ответов на инфицирующий агент, раковую или канцерогенную клетку или на аутоиммуногенерированную клетку. Способ направления клеточного ответа у млекопитающих включает введение эффективного количества терапевтических клеток указанному животному, указанные клетки являются способными к распознаванию и разрушению указанного инфекционного агента, опухоли, раковой клетки или аутоиммуногенерированной клетки. Клеточный ответ может быть опосредован единой рецепторной химерой или может быть результатом взаимодействия между многими химерами (например, набором из двух или нескольких химер, одна из которых включает внутриклеточный домен CD28). Соответственно, изобретение включает использование этих клеток, экспрессирующих химерные рецепторы для получения лекарственного препарата для лечения заболевания (как описано выше).

В другом осуществлении способ направления клеточного ответа на инфекционный агент включает введение терапевтических клеток, способных к распознаванию и разрушению указанного агента, где агентом является специфический вирус, бактерия, простейшее или грибок. Еще более специфически способ разрабатывается против агентов, таких как ВИЧ и Р neumocystis carinii.

В особенности, изобретение описывает способ направления клеточного ответа на инфицированную ВИЧ клетку. Способ включает введение пациенту эффективного количества цитотоксических T лимфоцитов, указанные лимфоциты являются способными к специфическому распознаванию и лизису клеток, инфицированных ВИЧ, а также циркулирующего вируса.

Таким образом, в одном осуществлении, в соответствии с изобретением описан способ направления клеточного ответа на клетки, инфицированные ВИЧ, включающий введение пациенту эффективного количества цитотоксических T лимфоцитов, которые способны специфически распознавать и лизировать клетки, инфицированные ВИЧ.

В еще другом осуществлении описываются химерные рецепторные белки, которые направляют цитотоксические T лимфоциты для распознавания и лизиса инфицированной ВИЧ клетки. Еще другое осуществление изобретения включает клетки-хозяева, трансформированные вектором, содержащим химерные рецепторы.

В еще другом осуществлении настоящее изобретение описывает антитело против химерных рецепторов по изобретению.

Для того чтобы получить цитотоксические T лимфоциты, которые специфически связывают и лизируют клетки, инфицированные ВИЧ, изобретатели настоящего изобретения, таким образом, попытались и описали здесь рецепторные химеры. Эти рецепторные химеры являются функционально активными и проявляют экстраординарные способности специфического связывания и лизиса клеток, экспрессирующих gp120.

Это является предметом настоящего изобретения, далее описывается способ лечения индивидуумов, инфицированных ВИЧ. Таким образом, настоящее изобретение описывает многие важные преимущества в лечении СПИДа.

Эти и другие не ограничивающие осуществления по настоящему изобретению будут очевидны для квалифицированного специалиста из последующего подробного описания изобретения.

В следующем подробном описании будут сделаны ссылки на различные методологические приемы, известные квалифицированному специалисту в области молекулярной биологии и иммунологии. Публикации и другие материалы, устанавливающие подобные известные методологические приемы, на которые сделаны ссылки, включаются здесь в качестве полных ссылок, как было установлено.

Стандартные ссылки на работы, устанавливающие общие принципы технологии рекомбинантной ДНК, включают Watson et al., Molecular Biology of Gene, том I и II, the Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc., publisher, Menlo Park, CA (1987); Darnell et al., Molecular Cell Biology, Scientific American Books, Inc. , publisher. New York, N.Y. (1986); Lewin, Genes II, John Wiley & Sons, publishers, Berkley, CA (1985); Old et al., Principles of Gene Manipulation: An Introduction to Genetic Engineering, 2^nd edition. University of California Press, publisher, Berkley, CA (1981); Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, publisher, Cold Spring Harbor, NY (1989) и Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., Wiley Press, New York, NY (1989).

ОПРЕДЕЛЕНИЯ
"Клонирование" обозначает использование in vitro рекомбинантной техники для введения конкретного гена или другой последовательности ДНК в молекулу вектора. Для успешного клонирования желаемого гена необходимо использовать способы получения фрагментов ДНК для соединения с фрагментами молекул вектора, для введения составленной молекулы ДНК в клетку хозяина, в которой он будет реплицироваться, и для отбора клона среди клеток реципиентов хозяина, обладающего геном мишенью.

"кДНК" обозначает комплементарную или копию ДНК, полученную из матрицы РНК путем воздействия РНК-зависимой ДНК-полимеразы (обратной транскриптазы). Следовательно, "клон кДНК" обозначает дуплекс последовательности ДНК, комплементарной к интересующей молекуле РНК, переносимый вектором клонирования.

"Библиотека кДНК" обозначает коллекцию молекул рекомбинантной ДНК, содержащей вставки кДНК, которые содержат ДНКовые копии мРНК, экспрессируемые клеткой ко времени, когда получена библиотека кДНК. Подобная библиотека кДНК может быть получена методиками, известными специалистам и описанными, например, у Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, см. выше. Обычно сначала выделяется РНК из клетки организма, геном которого содержит желаемый клон конкретного гена. Для этой цели предпочтительным является млекопитающее, в частности, линии клеток лимфоцитов человека. Настоящим предпочтительным вектором для этой цели является штамм WR вируса осповакцины.

"Вектор" обозначает молекулу ДНК, происходящую, например, из плазмиды, бактериофага или вируса млекопитающего или насекомого. Вектор будет содержать один или несколько особенных сайтов рестрикции и может быть способен к автономной репликации у определенного хозяина или организма носителя таким образом, чтобы клонируемая последовательность являлась репродуцибельной. Таким образом, "вектор экспрессии ДНК" обозначает любой элемент, способный направлять синтез рекомбинантного пептида. Такиe векторы экспрессии ДНК включают бактериальные плазмиды и фаги, и плазмиды млекопитающих и насекомых, и вирусы.

"Чистое по существу" относится к соединению, например, белку, полипептиду или антителу, которое является по существу чистым от компонентов, которые естественно сопутствуют ему. В целом соединение является по существу чистым, если в образце содержится интересующего соединения, по крайней мере, 60%, более предпочтительно, по крайней мере, 75%, и наиболее предпочтительно, по крайней мере, 90% от общего материала. Чистоту можно измерить при помощи подходящего способа, например, хроматографией на колонке, электрофорезом на полиакриламидном геле или путем ЖХВР анализа. В этом контексте "по существу чистая" нуклеиновая кислота обозначает последовательность нуклеиновой кислоты, сегмент или фрагмент, который не является непосредственно примыкающим к (то есть, ковалентно присоединенным к) обеим из кодирующих последовательностей, с которыми он непосредственно соседствует (то есть к одной по 5' концу и к одной по 3' концу) в природно имеющемся геноме организма, от которого происходит ДНК по изобретению.

"Функциональное производное" обозначает "фрагмент", "вариант", "аналог" или "химическое производное" молекулы. "Фрагмент" молекулы, такой как любая из последовательностей ДНК, по настоящему изобретению относится к обозначению любого нуклеотидного поднабора молекулы. "Вариант" такой молекулы относится к обозначению встречающейся в природе молекулы, по существу, сходной с полной молекулой или ее фрагментом. "Аналог" молекулы относится к обозначению не встречающейся в природе молекулы, по существу, сходной с полной молекулой или ее фрагментом. Указанная молекула является "по существу сходной" с другой молекулой, если последовательность аминокислот обеих молекул является по существу одинаковой. В частности, "по существу сходная" является последовательность аминокислот, которая имеет, по крайней мере, 50%, предпочтительно, 85% и, наиболее предпочтительно, 95% идентичности с природной или референс-последовательностью и/или последовательностью, которая отличается от природной или референс-аминокислотной последовательности только консервативными аминокислотными заменами. По существу сходная аминокислотная последовательность обладает сходной биологической активностью. Таким образом, описано, что если две молекулы имеют сходную активность, то предполагается, что они являются вариантами, согласно используемому здесь термину, даже если одна из молекул содержит дополнительные или менее аминокислотных остатков, не обнаруженных в другой, или если последовательность аминокислотных остатков не является идентичной. Как здесь использовано, указанная молекула является "химическим производным" другой молекулы, если она содержит дополнительные химические радикалы, не являющиеся обычно частью молекулы. Такие радикалы могут улучшать растворимость, адсорбцию, биологическое время полужизни молекулы и т.п. Радикалы могут альтернативно снижать токсичность молекулы, устранять или ослаблять нежелаемые побочные эффекты молекулы и т.п. Радикалы способны опосредовать такие описанные эффекты, например, в Remington's Pharmaceutical Sciences, 16^th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (1980).

Аналогично, "функциональное производное" гена рецепторной химеры по настоящему изобретению включает обозначение "фрагменты", "варианты" или "аналоги" гена, который может быть "по существу сходным" с нуклеотидной последовательностью и который кодирует молекулу, проявляющую сходную активность с рецепторной химерой, например T клетки, В клетки или рецепторной химерой F_c. "По существу сходные" нуклеиновые кислоты кодируют по существу сходные последовательности аминокислот и также могут включать любую последовательность нуклеиновой кислоты, способную к гибридизации с последовательностью нуклеиновой кислоты дикого типа в подходящих условиях для гибридизации (см., например, Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Press, New York, NY (1989) для условий гибридизации подходящей жесткости).

Таким образом, как использовано здесь, белок рецепторной химеры T клетки, В клетки или F_c включает обозначение любых функциональных производных, фрагментов, аналогов или химических производных, которые могут быть по существу сходными с химерой "дикого типа" и которые проявляют сходную активность (то есть, наиболее предпочтительно, 90%, более предпочтительно, 70%, предпочтительно, 40%, или, по крайней мере, 10% активности рецепторной химеры дикого типа). Активность функционального производного рецепторной химеры включает специфическое связывание (его внеклеточной части) с агентом мишенью или клеткой и конечное разрушение (направляемое его внутриклеточной или трансмембранной частью) того агента или клетки; такая активность может быть определена, например, путем использования любого из исследований, описанных здесь.

Последовательности ДНК, кодирующую рецепторную химеру T клетки, В клетки или F_c по настоящему изобретению, или ее функциональное производное может быть рекомбинировано с вектором ДНК в соответствии с общепринятыми способами, включая окончания для лигирования с "затупленными" или "расшатанными" дефосфорилированными концами, расщепление ферментом рестрикции для обеспечения подходящих концов, получение связывающих концов при подходящей обработке щелочной фосфатазой, чтобы избежать получения нежелательного соединения, и лигирование подходящими лигазами. Способы для подобного манипулирования описаны у Maniatis et al., выше и хорошо известны в технике.

Указанная молекула нуклеиновой кислоты, такая как ДНК, "способна к экспрессии" полипептида, если он содержит последовательности нуклеотидов, которые содержат транскрипционную или трансляционную регуляторную информацию, и такие последовательности являются "оперативно примыкающими" к нуклеотидным последовательностям, которые кодируют полипептид. Оперативное примыкание является примыканием, в котором регуляторные последовательности ДНК и последовательности ДНК, предполагаемые к экспрессии, состыкованы таким образом, чтобы позволять экспрессию гена. Точная природа регуляторных областей, требующихся для экспрессии гена, может отличаться от организма к организму, но будет в целом включать промоторную область, которая содержит у прокариотов промотор (который направляет инициацию транскрипции РНК), а также последовательности ДНК, которые, при транскрипции в РНК, будут давать сигнал инициации синтеза белка. Такие области обычно будут включать те 5'-некодирующие последовательности, участвующие в инициации транскрипции и трансляции, такие как ТАТА-бокс кэппированную последовательность, последовательность СААТ и подобные.

Если требуется, некодирующая 3'-область у последовательности гена, кодирующей белок, может быть получена путем вышеописанных способов. Эта область может быть сохранена для своих транскрипционных терминирующих регуляторных последовательностей, таких как терминация и полиаденилирование. Таким образом, путем сохранения 3'-области, естественно примыкающей к последовательности ДНК, кодирующей белок, могут быть обеспечены транскрипционные терминирующие сигналы. Если транскрипционные терминирующие сигналы не являются удовлетворительно функциональными для экспрессии в хозяйской клетке, тогда 3' функциональная область в клетке хозяине может быть замещена.

Две указанные последовательности ДНК (такие как последовательность области промотора и кодирующая последовательность рецептора T клетки, рецептора В клетки и F_c рецепторной химеры) являются оперативно соединенными. Если природа связи между двумя последовательностями не (1) приводит к введению мутации сдвига рамки, (2) влияет на способность последовательности области промотора направлять транскрипцию последовательности гена рецепторной химеры или (3) влиять на способность последовательности гена рецепторной химеры быть транскрибируемой последовательностью области промотора. Область промотора могла быть оперативно присоединена к последовательности ДНК, если промотор был способен к эффективной транскрипции той последовательности ДНК. Таким образом, для экспрессии белка являются необходимыми транскрипционные и трансляционные сигналы, распознаваемые подходящим хозяином.

Настоящее изобретение включает в себя экспрессию рецептора T клетки, рецептора В клетки или белка рецепторной химеры F_c (или их функциональных производных) как в прокариотических, так и эукариотических клетках, хотя является предпочтительной эукариотическая (и, в частности, лимфоциты человека) экспрессия.

Антитела согласно настоящему изобретению могут быть получены путем любого из различных способов. Например, клетки, экспрессирующие белок рецепторной химеры, или ее функционального производного, могут быть введены животному для того, чтобы индуцировать продукцию сыворотки, содержащей поликлональные антитела, которые способны к связыванию химеры.

В предпочтительном способе антитела по настоящему изобретению являются моноклональными антителами. Такие моноклональные антитела могут быть получены, используя гибридомную технологию (Kohler et al., Nature 256:495 (1975); Kohler et al., Eur. J.Immunol. 6:511 (1976); Kohler et al., Eur J.Immunol. 6: 292 (1976); Hammerling et al. , In: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas, Elsevier, N. Y., стр. 563-684 (1981)). В целом такие процедуры включают иммунизацию животного антителом химеры рецептора T клетки, рецептора В клетки или F_c рецептора. Спленоциты такого животного экстрагируются и сливаются с подходящей линией клеток миеломы. Может быть использована любая подходящая линия клеток по настоящему изобретению. После слияния полученные гибридомные клетки поддерживаются избирательно в среде HAT и затем клонируются путем ограниченного разведения, как описано Wands et al., (Gast roenterology 80:225-232 (1981)). Гибридомные клетки, полученные благодаря такой селекции, затем исследуются для идентификации клонов, которые секретируют антитела, способные к связыванию химеры.

Антитела по изобретению могут быть также поликлональными или, предпочтительно, специфическими к области поликлональными антителами.

Антитела против химеры рецептора T клетки, В клетки или F_c рецептора по настоящему изобретению могут быть использованы для мониторинга количества химерного рецептора (или несущих химерный рецептор клеток) у пациента. Такие антитела также подходят для использования в обычных известных в технике иммунодиагностических исследованиях, включая такие иммунометрические или "сэндвич" анализы, в виде направленного "сэндвича", обратного "сэндвича" и одновременного "сэндвич"- анализа. Антитела могут быть использованы в любом количестве комбинаций, как может быть определено квалифицированным сотрудником, в отсутствие неуместного экспериментирования, для воздействия на иммуноопределение приемлемой специфичности, чувствительности и точности.

Обычные ссылки на работы, основополагающие общие принципы иммунологии, включают Roitt, Essential Immunology, 6^th ed., Blackwell Scientific Publications, publisher, Oxford (1988); Kimball, Introduction to Immunology, 2^nd ed. , Macmillan Publishing Co., publisher, New York (1986); Roitt et al., Immunology, Gower Medical Publishing Ltd., publisher, London, (1985); Campbell, "Monoclonal Antibody Technology", in Burdon et al., eds. Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, volume 13, Elsevier, publisher, Amsterdam (1984); Klein, Immunology: The Science of Self-Nonself Discrimination, John Wiley & Sons, publisher, New York (1982) и kennett et al. , eds., Monoclonal Antibodies, Hybridoma: A New Dimension In Biological Analyses, Plenum Press, publisher, New York (1980).

Под "детектированием" подразумевается включение определения наличия или отсутствия вещества либо количественное определение вещества. Термин, следовательно, относится к использованию материалов, композиций и способов по настоящему изобретению для качественного и количественного определения.

Выделение других гибридом, секретирующих моноклональные антитела такой же специфичности, как здесь описано, может проводиться согласно технологии анти-идиотипического скрининга (Potocmjak et al., Science 215:1637 (1982)). В кратком виде анти-идиотипическое антитело является антителом, которое распознает особенные детерминанты, присутствующие в антителе, продуцируемом интересующим клоном. Анти-идиотипическое антитело получают путем иммунизации животного тем же штаммом, используемым в качестве источника моноклонального антитела с моноклональным интересующим антителом. Иммунизированное животное будет распознавать и отвечать на идиотипические детерминанты иммунизируемого антитела путем продукции антитела к этим идиотипическим детерминантам (анти-идиотипическое антитело).

Для репликации гибридомные клетки могут быть культивированы как in vitro, так и in vivo. Высокая продукция in vivo в культуре в настоящее время делает этот способ предпочтительным. В кратком виде, клетки из отдельных гибридных штаммов инъекцируют внутрибрюшинно обработанным пристаном мышам BALB/c для получения асцитной жидкости, содержащей высокую концентрацию желаемых моноклональных антител. Моноклональные антитела изотипа IgM или IgG могут быть очищены из культурального супернатанта при использовании метода хроматографии на колонке, хорошо известного в технике для специалиста.

Антитела по настоящему изобретению являются конкретно удобными для использования в иммуноопределениях, где они могут быть применены в жидкой фазе или привязанными к носителю из твердой фазы. Кроме того, антитела в этом иммуноопределении могут быть мечены различными путями для детектирования.

В технике существует много различных меток и способов мечения. Примеры видов меток, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, но не ограничиваются этим, ферменты, радиоизотопы, флуоресцентные соединения, хемолюминесцентные соединения, биолюминесцентные соединения и хелаторы металлов. Любой специалист будет знать другие подходящие метки для связывания с антителами или будет уверен в пути использования в обычном эксперименте. Кроме того, связывание этих меток с антителами может быть проведено при использовании обычных способов в технике, общеизвестных любому специалисту.

Один из способов, в котором антитела по настоящему изобретению могут быть определены при помощи метки, является использование пришивания к ферменту. Этот фермент, в свою очередь, помещенный вместе со своим субстратом, будет реагировать со своим субстратом таким образом, чтобы производить химический радикал, который можно зарегистрировать, например, спектрофотометрическим или флуориметрическим путем. Примеры ферментов, которые могут быть использованы для детектируемых меченых антител включают малатдегидрогеназу, стафилоккоковую нуклеазу, дельта-V-стероидную изомеразу, алкогольдегидрогеназу дрожжей, альфа-глицерофосфатдегидрогеназу, триозофосфатдегидрогеназу, биотин-авидин пероксидазу, пероксидазу хрена, щелочную фосфатазу, аспаргиназу, глюкозооксидазу, β-галактозидазу, рибонуклеазу, уреазу, каталазу, глюкозо-VI-фосфатдегидрогеназу, глюкоамилазу и ацетилхолинэстеразу.

Наличие детектируемых меченых антител также может быть определено путем мечения антител радиоактивным изотопом, который затем может быть определен путем таких приспособлений, как использование гамма-счетчика или сцинтилляционного счетчика. Изотопы, которые конкретно применяются для цели настоящего изобретения, следующие: ³H, ¹²⁵I, ³²P, ³⁵S, ¹⁴C, ⁵¹Cr, ⁵⁷Co, ⁵⁸Co, ⁵⁹Fe и ⁷⁵Se.

Возможно также детектировать связывание меченных детектируемых антител путем мечения антител флуоресцентным соединением. Когда флуоресцентно меченное антитело выдерживается на свету соответствующей длины волны, его присутствие может быть зарегистрировано по флуоресценции красителя. Среди наиболее распространенных используемых флуоресцентных метящих соединений -флуоресцеин, изотиоцианат, родамин, фикоэритрин, фикоцианин, аллофикоцианин, о-фталевый альдегид и флуорескамин.

Антитела по изобретению могут быть также помечены для детектирования путем их сопряжения с хемилюминесцентным соединением. Наличие хемилюминесцентно меченного антитела определяется затем по наличию люминесценции, которая возникает в процессе химической реакции. Примерами конкретно применимых хемилюминесцентно метящих соединений являются люминал, изолюминал, тероматический (theromatic) сложный эфир акридиния, имидазол, соли акридиния, эфир щавелевой кислоты и диоксиметан.

Подобным образом может быть использовано биолюминесцентное соединение для мечения антител по настоящему изобретению. Биолюминесценция является видом хемилюминесценции, обнаруживаемая в биологических системах, в которых белок катализатор увеличивает эффективность хемилюминесцентной реакции. Наличие биолюминесцентного антитела определяется путем регистрации наличия
люминесценции. Важные биолюминесцентные соединения для целей мечения включают люциферин и экворинлюциферазу.

Антитела и по существу очищенные антигены по настоящему изобретению являются идеально подходящими для получения набора. Такой набор может содержать приспособление для переноски, разделенное на части для получения тесного разграничения между одним или несколькими емкостями, такими как флаконы, пробирки и тому подобное, каждая из указанных емкостей содержит отдельные элементы, используемые для определения.

Существуют многие виды исследования, для которых могут быть составлены наборы, и, включают, например, конкурентное и неконкурентное исследования. Типичными примерами исследований, которые могут использовать антитела по изобретению, являются радиоиммуноанализ (RIA), ферментативный иммуноанализ (EIA), твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA) и иммунометрический или "сэндвич"-иммуноанализ.

Термин "иммунометрический анализ" или "сэндвич"-иммуноанализ включает одновременный "сэндвич"-иммуноанализ, прямой сэндвич-иммуноанализ и обратный сэндвич-иммуноанализ. Эти термины хорошо понятны для квалифицированного работника. Квалифицированный работник поймет также, что антитела по настоящему изобретению будут применимы в других вариантах или видах исследований, которые известны в настоящее время, или которые могут быть разработаны в будущем. Таковые будут включены в объем настоящего изобретения.

В предпочтительном виде проведения исследования важно, что некоторые "блокаторы" будут присутствовать в инкубационной среде (обычно добавленные с меченным растворимым антителом). "Блокаторы" добавляются для уверенности, что неспецифические белки, протеазы или антитела человека к иммуноглобулинам мыши, присутствующие в экспериментальном образце, не давали перекрестной реакции или не разрушали антитела на твердофазной подложке, или меченное радиоактивностью индикаторное антитело не давало положительно ложный или отрицательно ложный результаты. Следовательно, по существу, имеется отбор "блокаторов", добавляемых для специфичности исследования, описанного в настоящем изобретении.

Было обнаружено, что многие непосредственные (то есть неспецифические) антитела того же класса или полкласса (изотипа), как и используемые в исследовании (например, IgG₁, IgG₂ IgM и т.п.) могут быть использованы в качестве "блокаторов". Концентрация "блокаторов" (обычно 1-100 мкг/мкл) является важной для того, чтобы поддержать правильную чувствительность, даже ингибировать любое нежелательное влияние путем взаимно имеющихся перекрестно-реактивных белков в сыворотке человека. Кроме того, требуется оптимизированная буферная система, содержащая "блокаторы". Предпочтительными буферами являются те, которые основаны на слабых органических кислотах, таких как имидазол, HEPPS, MOPS, TES, ADA, ACES, HEPES, PIPES, TRIS и тому подобные, при физиологическом значении pH. В некоторой мере менее предпочтительными буферами являются неорганические буферы, такие как фосфатный, боратный или карбонатный. Наконец, предпочтительно добавляемыми к буферу, содержащему "блокаторы", являются некоторые известные ингибиторы протеаз (обычно в концентрации 0,01-10 мкг/мл).

Имеется много твердофазных иммуносорбентов, которые использовали и которые могут быть использованы по настоящему изобретению. Хорошо известные иммуносорбенты включают стекло, полистерол, полипропилен, декстран, найлон и другие материалы, сделанные в виде пробирок, подложек и микротитровальных планшетов, или покрытые такими материалами и т.п. Иммобилизованные антитела могут быть как ковалентно, так и физически пришиты к твердой фазе иммуносорбента при помощи способов, таких как ковалентное связывание через амидную или эфирную связь, или путем адсорбции. Квалифицированный работник будет знать многие другие подходящие твердофазные иммуноадсорбенты и методы для иммобилизации на них антител или будет способен выяснить такие, которые используются не более, чем в рутинных экспериментах.

Для диагностики in vivo, in vitro или in situ метки, подобные радионуклидам, могут быть связаны с антителами по настоящему изобретению или непосредственно, или используя промежуточную функциональную группу. Промежуточная группа, которая часто используется для связывания радиоизотопов с антителами, которые существуют в виде катионов металлов, представляет диэтилентриаминпентануксусную кислоту (DTPA). Обычными примерами катионов металлов, которые связываются этим образом, являются ^99mTc, ¹²³I, ¹³¹I, ⁹⁷Ru, ⁶⁷Cu, ⁶⁷Ga и ⁶⁸Ga. Для диагностических целей антитела по настоящему изобретению могут быть также мечены нерадиоактивными изотопами. Элементами, которые конкретно применимы для этого, являются ¹⁵⁷Gd, ⁵⁵Mn, ¹⁶²Dy, ⁵²Cr и ⁵⁶Fe.

Антиген по изобретению может быть выделен в существенно чистом виде, применяя антитела по настоящему изобретению. Таким образом, осуществление настоящего изобретения описывает для по существу чистой химеры рецептора T клетки, рецептора В клетки и F_c рецептора указанный антиген, характеризующийся тем, что он распознается по связыванию с антителами по настоящему изобретению. В другом осуществлении настоящее изобретение описывает способ выделения или очистки антигена химерного рецептора путем образования комплекса указанного антигена с одним или несколькими антителами, направленными против рецепторной химеры.

По существу чистые антигены химеры рецептора T клетки, рецептора В клетки или F_c рецептора в свою очередь могут быть использованы для определения или измерения антитела к химере в образце, таком как сыворотка или моча. Таким образом, одно осуществление настоящего изобретения включает метод обнаружения наличия или количества антитела к антигену химеры рецептора T клетки, рецептора В клетки или F_c рецептора в образце, включающий контактирование образца, содержащего антитело к химерному антигену, с меченной для определения химерой рецептора и обнаружение указанной метки. Будет понятно, что иммунореактивные фракции и иммунореактивные аналоги химеры также могут быть использованы.

Под термином "иммунореактивная фракция" обозначается любая часть химерного антигена, который проявляет эквивалентный иммунный ответ к антителу, направленному против рецепторной химеры. Под термином "иммунореактивный аналог" обозначается белок, который отличается от белка рецепторной химеры по одному или нескольким аминокислотам, но который проявляет эквивалентный иммунный ответ на антитело по изобретению.

Под термином "специфически распознает и связывает" обозначается, что антитело распознает и связывает полипептид химерного рецептора, но по существу не распознает и не связывает другие неродственные молекулы в образце, например, биологическом образце.

Под термином "аутоиммуногенерированная клетка" обозначаются клетки, продуцирующие антитела, которые реагируют с тканью хозяина или иммунного эффектора T клеток, которые являются иммунореактивными; такие клетки включают антитела против ацетилхолиновых рецепторов (приводящие, например, к миастении гревис) или антитела анти-ДНК, анти-эритроцита и анти-тромбоцита (приводящие, например, к эритроматозной волчанке).

Под "терапевтической клеткой" обозначается клетка, которая была трансформирована химерой по изобретению таким образом, чтобы она была способна распознавать и уничтожать специфический инфицирующий агент, клетку, инфицированную специфическим агентом, раковую или канцерогенную клетку, или аутоиммуногенерированную клетку; такие терапевтические клетки предпочтительно являются клетками гематопоэтической системы.

Под "инфекционным агентом мишени" обозначается любой инфекционный агент (например, вирусный, бактериальный, протозойный или грибковый), который может быть распознан терапевтической клеткой, несущей химерный рецептор. Под "клеткой мишенью" обозначается любая клетка хозяин, которая может быть распознана терапевтической клеткой, несущей химерный рецептор; клетки мишени включают, без ограничений, клетки хозяева, которые инфицируются вирусами, бактериями, простейшими или грибками, а также раковые или канцерогенные клетки и аутоиммуногенерированные клетки.

Под "внеклеточной" обозначается, по крайней мере, имеющаяся часть молекулы, экспонированная на клеточной поверхности. Под "внутриклеточной" обозначается, по крайней мере, имеющаяся часть молекулы, представленная в цитоплазме терапевтической клетки. Под "трансмембранной" обозначается, по крайней мере, имеющаяся часть молекулы, пронизывающая плазматическую мембрану. Употребляемые здесь "внеклеточная часть", "внутриклеточная часть" и "трансмембранная часть" могут включать окаймляющие последовательности аминокислот, которые простираются в примыкающие компартменты клетки.

Под "олигомеризацией" обозначается образование комплекса с другим белком для формирования димера, тримера, тетрамера или других олигомеров высшего порядка. Такие олигомеры могут быть гомоолигомерами или гетероолигомерами.

"Олигомеризующаяся часть" является такой областью молекулы, которая направляет образование комплекса (то есть олигомера).

Под "цитолитической" обозначается способность разрушения клетки, инфицированной патогеном, опухолевой или канцерогенной клетки или аутоиммуногенерированной клетки), или способность разрушения инфекционного агента (например, вируса).

Под "вирусом иммунодефицита" обозначается ретровирус, который в виде дикой формы способен инфицировать T4 клетки хозяина примата и проявлять вирусный морфогенез и морфологию, характеризующую подсемейство лентивирусов. Термин включает, без ограничений, все вариации HIV(ВИЧ) и SIV, включая ВИЧ-1, ВИЧ-2, SIVmac, SIVagm, SIVmnd, SIVsmm, SIVman, SIVmand и SIVcpz.

Под "МНС-независимым" обозначается, что клеточный цитолитический ответ не требует присутствия МНС антигена класса II на поверхности мишени.

Под "функциональным цитолитическим сигнал-передающим производным" обозначается функциональное производное (как определено выше), которое способно направлять, по крайней мере, 10%, предпочтительно 40%, более предпочтительно 70%, и наиболее предпочтительно, по крайней мере 90% биологической активности молекул дикого типа. Как используется здесь "функциональное цитолитическое сигнал-передающее производное" может действовать путем непосредственно сигнализирующей терапевтической клетки для разрушения рецептор-связанного агента или клетки (например, в случае внутриклеточной части химерного рецептора), или может действовать опосредованно путем способствования олигомеризации с цитолитическими сигнал-передающими белками терапевтической клетки (например, в случае трансмембранного домена). Такие производные могут быть исследованы на эффективность, например, используя исследование in vitro, описанное здесь.

Под "функциональным производным, связывающимся с оболочкой ВИЧ" обозначается функциональное производное (как определено выше), которое способно к связыванию любого белка оболочки ВИЧ. Функциональные производные могут быть идентифицированы, используя, например, исследование in vitro, описанное здесь.

ТЕРАПЕВТИЧЕСКОЕ ВВЕДЕНИЕ
Трансформированные клетки по настоящему изобретению могут быть использованы для лечения многих заболеваний. Настоящие методы введения таких трансформированных клеток включают приспособительную иммунотерапию или лечение путем пересадки клеток. Эти способы позволяют возвратить трансформированные клетки иммунной системы в кровяное русло. Rosenberg, Sci. Am. 62 (May 1990); Rosenberg et al., New Engl. J. Med. 323:570 (1990).

Фармацевтические составы по изобретению могут быть введены любому животному, которое может проявить благотворные эффекты соединений по изобретению. Главными среди таких животных являются люди, хотя изобретение не намерено ими ограничиться.

Подробное описание
Сначала будут описаны рисунки.

Краткое описание рисунков
Фиг. 1a представляет аминокислотную последовательность в районе сайта слияния между CD4 (остатки 1-369) и различными цепями рецептора (ПОСЛ. NN 28-31). Подчеркнутая последовательность показывает положение аминокислот, кодирующих сайт BamHI, используемый для конструкций слияния. Начало трансмембранного домена маркировано вертикальным столбиком. Последовательность η является идентичной последовательности ζ по аминоконцу, но различается по карбоксиконцу (Jin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:3319-3323 (1990)). Фиг. 1b представляет проточный цитометрический анализ экспрессии CD4, CD4:ζ, CD4: γ и CD4:η в CV1 клетках. Клетки инфицировали вирусом, экспрессирующим CD4 химеры или CD16_pI, инкубированные в течение 9 часов при 37^oC и окрашенные фикоэритрином, конъюгированным с aнти-CD4 Mab Leu3A.

Фиг. 2 показывает экспрессию на поверхности CD16_TM после совместной инфекции только CD16_TM (жирный пунктир) или совместно инфицированными с вирусом, экспрессирующим CD4:γ (штрих), или CD4:ζ (сплошная линия). Тонкий пунктир - клетки, инфицированные только CD4:ζ, окрашенные 3G8 (Fleit et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:3275-3279 (1982) (aнти-CD16 Mab).

Фиг. 3 показывает экспрессию на поверхности CD16_TM, после совместной инфекции вирусами, экспрессирующими CD16_TM и после ζ химер: CD4:ζ (жирная линия), CD4: ζ C11G (сплошная линия); CD4: ζ (штриховая линия); CD4:ζ C11G/D15G (жирный пунктир); не инфицированных (только CD16_TM - тонкий пунктир). Клетки инкубировали с анти-CD16 Mab 3G8 и конъюгированными с фикоэритрином Fab_2' козьими антителами к IgG мыши. Уровень экспрессии ζ химер был по существу идентичен для различных анализированных мутантов и совместная инфекция клеток вирусами, экспрессирующими CD16_TM и ζ химеры несущественно изменяла экспрессию на поверхности химер.

Фиг. 4a-d показывает увеличение внутриклеточного свободного кальция после перекрестного связывания с мутантом ζ химер в линии T клеток. Клетки Jurkat E6 (Weiss et al., J. Immunol. 133:123-128 (1984)) инфицировали рекомбинантным вирусом осповакцины и анализировали с помощью проточной цитометрии. Представлены результаты для прошедшей популяции CD⁺, таким образом анализировали только клетки, экспрессирующие родственный химерный белок. Среднее соотношение фиолетовой к синей флуоресценции Indo-1 отражает внутриклеточную концентрацию свободного кальция в популяции как единую, и процент отвечающих клеток отражает фракцию клеток, которые достигли преопределенного порога соотношения (установлен так, чтобы 10% необработанных клеток были положительными). Фиг. 4a и 4b показывают клетки Jurkat, экспрессирующие CD4: ζ (сплошная линия) или CD16:ζ (штриховая линия), которые выдерживали с анти-CD4 Mab Leu3a (конъюгат с фикоэритрином), затем при перекрестном связывании с козьим антителом к IgG мыши. Пунктирная линия показывает ответ неинфицированных клеток на анти-CD3 Mab ОКТ3. Фиг. 4c и 4d показывают клетки Jurkat, экспрессирующие CD4:ζ D15G (сплошная линия); CD4:ζ C11G/D15G (штрих) или CD4: ζ C11G (пунктир), которые обрабатывали и анализировали, как и на фиг. 4а и 4b.

Фиг. 5a-c показываeт, что CD4:ζ, CD4:η и CD4:γ рецепторы позволяют цитолитическим T лимфоцитам (CTL) убивать мишени, экспрессирующие gp120/41 ВИЧ-1. Фиг. 5a - сплошные кружки - CTL, экспрессирующие CD4:ζ, инкубированные с клетками HeLa, экспрессирующими gp120/41; открытые кружки - CTL, экспрессирующие CD4: ζ, инкубированные с неинфицированными клетками HeLa; закрытые квадраты - неинфицированные CTL, инкубированные с клетками HeLa, экспрессирующими gp120/41; открытые квадраты - неинфицированные CTL, инкубированные с неинфицированными клетками HeLa. Фиг. 5b: закрытые кружки - CTL, экспрессирующие CD4: η, инкубированные с клетками HeLa, экспрессирующими gp120/41; открытые кружки - CTL, экспрессирующие CD4:γ, инкубированные с клетками HeLa, экспрессирующими gp120/41; открытые квадраты - CTL, экспрессирующие C11G/D15G двойной мутант CD4:ζ химера, инкубированный с клетками HeLa, экспрессирующими gp120/41. Фиг. 5c: Цитометрический проточный анализ экспрессии CD4 при помощи CTL, использованных на фиг. 5b. Для коррекции соотношения мишени к эффектору был определен процент клеток, экспрессирующих химеру CD4 путем вычитания масштабированной негативной (неинфицированной) популяции путем наложения гистограмм; для сравнения на фиг. 5с неинфицированные клетки отмечены произвольным порогом, который дает, грубо говоря, такую же позитивную фракцию для других клеточных популяций, как вычитание гистограмм.

Фиг. 6а-b показываeт специфичность CD4 направленного цитолиза. Фиг. 6a: закрытые кружки - CTL, экспрессирующие CD4:ζ, инкубированные с клетками HeLa, экспрессирующими CD16_PI; открытые кружки - CTL, экспрессирующие CD4, инкубированные с клетками HeLa, экспрессирующими gp120; закрытые квадраты - VTL, экспрессирующие CD16: ζ, инкубированные с клетками HeLa, экспрессирующими gp120/41; открытые квадраты - CTL, экспрессирующие CD16_PI; инкубированные с клетками HeLa, экспрессирующими gp120/41. Фиг. 6b: закрытые кружки - CTL, экспрессирующие CD4:ζ, инкубированные с клетками Raji (MHC класс II⁺); открытые квадраты - CTL, экспрессирующие CD4:ζ, инкубированные с клетками RJ2.2.5 (MHC класс II^-). Шкала ординат увеличена.

Фиг. 7a-b представляет характеристику CD16:ζ химерного рецептора. Фиг. 7a является схематической диаграммой белка слияния CD12:ζ. Внеклеточная часть фосфатидилинозитолсвязанной формы мономерного CD16 была присоединена к димерной ζ, непосредственно снаружи к трансмембранному домену. Последовательность белка в сочленении слияния представлена снизу (ПОСЛ. NN 32, 33). Фиг. 7b представляет цитометрический проточный анализ мобилизации кальция после перекрестного соединения CD16: ζ'химеры или в TCR положительной, или в TCR отрицательной линии клеток. Показано среднее соотношение фиолетовой к синей флуоресценции (мера относительной концентрации иона кальция) среди популяции клеток, обработанных антителами в 0 время. Закрытые кружки - ответ клеток Jurkat на анти-CD3 Mab ОКТ3; закрытые треугольники - ответ GD16:ζ на анти-CD16 Mab 3G8, перекрестно сшитым с REX33A TCR^- мутантом; открытые квадраты - ответ CD16: ζ, перекрестно сшитых с Jurkat TCR^- мутантной линией JTR.T3.5; открытые треугольники - ответ на CD16:ζ перекрестное сшивание в клетках Jurkat; крестики - ответ на химерный CD16 в клетках Jurkat и штрих - ответ на не химерный CD26 в линии клеток 4 REX33A TCR^-.

Фиг. 8a-b показываeт анализ делеций цитолитического потенциала. Фиг. 8a показывает расположение точки окончания ζ делеций. Здесь, как и везде, мутации в ζ представлены посредством оригинального условного обозначения остатка остаток - положение - мутант таким образом, что D66⁺, например, обозначает замену Asp-66 кодоном терминации. Фиг. 8b демонстрирует результаты исследования цитолиза CD16: ζ без выпадения и молчащих ζ делеций. Клетки гибридомы, экспрессирующие антитело на поверхности к CD16, нагружали ⁵¹Cr и инкубировали с увеличивающимся количеством цитолитических лимфоцитов человека (CTL), инфицированных рекомбинантами вируса осповакцины, экспрессирующими CD16: ζ химеры. Процент вышедшего ⁵¹Cr выражали в виде функции соотношения клеток эффектора (CTL) к мишени (гибридома) (e/t). Закрытые кружки - цитолиз, опосредованный клетками, экспрессирующими CD16:ζ (mfi 18.7); закрытые квадраты - цитолиз, опосредованный клетками, экспрессирующими CD16:ζAsp 66^* (mfi 940.2); открытые квадраты - цитолиз, опосредованный клетками, экспрессирующими CD16:ζGlu60^* (mfi 16.0); открытые кружки - цитолиз, опосредованный клетками, экспрессирующими CD16:ζTyr51^* (mfi 17.4); закрытые треугольники - цитолиз, опосредованный клетками, экспрессирующими CD16:ζPhe34^* (mfi 17.8), и открытые треугольники - цитолиз, опосредованный клетками, экспрессирующими нехимерный CD16 (mfi 591). Хотя в этих экспериментах экспрессия CD16:ζAsp66^* не отмечалась в сравнении с таковой у других белков слияния, цитолиз клетками, экспрессирующими CD16:ζ на эквивалентных уровнях в том же эксперименте дает результаты, по существу идентичные таковым, представленным клетками, экспрессирующими CD16:ζAsp66^*.

Фиг. 9a-d показываeт, что элиминация возможности для трансмембранных взаимодействий обнаруживает короткий сегмент, способный опосредовать цитолиз. Фиг. 9a является схематической диаграммой мономерной двухчастной и трехчастной химер. На вершине CD16:ζ конструкция оборвана по остатку 65 и лишена трансмембранных остатков Cys и Asp. Ниже имеются конструкции CD16: CD5: и CD16:CD7:ζ и близкие контроли. Последовательности пептидов внутриклеточных доменов представлены ниже (ПОСЛ. NN 35-37). Фиг. 9b показывает цитолитическую активность делеционных мутантов мономерной химеры. Цитолитическая активность клеток, экспрессирующих CD16:ζ (закрытые кружки; mfi 495) сравнивали с таковой у клеток, экспрессирующих CD16:ζAsp66^* (закрытые квадраты; mfi 527) или мутантов CDi6:ζCys11Gly/Asp15Gly/Asp66^* (открытые квадраты; mfi 338) и CD16:ζGys11Gly/Asp15Gly/Glu60^* (заполненные треугольники; mfi 259). Фиг. 9c показывает цитолитическую активность, опосредуемую трехчастными белками слияния. Закрытые треугольники - CD16:ζAsp66^*; открытые квадраты - CD16: 5:ζ(48-65); закрытые квадраты - CD16:7:ζ(48-65); открытые треугольники - CD16:7:ζ(48-59); открытые кружки - CD16:5; закрытые кружки - CS16:7. Фиг. 9d показывает мобилизацию кальция мутантом и трехчастными химерами у TCR отрицательной мутантной линии клеток Jurkat JRT3.T3.5. Открытые кружки - ответ клеток, экспрессирующих димерный CD16:ζAsp66^*; закрытые квадраты - ответ клеток, экспрессирующих CD16:ζCys11Gly/Asp15Gly/Asp66^*; открытые квадраты - ответ клеток, экспрессирующих CD16: ζCys11Gly/Asp15Gly/Glu60^*; закрытые треугольники - ответ клеток, экспрессирующих CD16: 7: ζ(48-65) и открытые треугольники - ответ клеток, экспрессирующих CD16:ζ(48-59).

Фиг. 10a-f показываeт вклад индивидуальных аминокислот в активность сигнал-передающего цитолитического фрагмента из 18 остатков. Фиг. 10a и 10b показывают цитолитическую активность и фиг. 10с показывает мобилизацию ионов кальция, опосредованную химерами, несущими точечные мутации около карбокси концевого тирозина (Y62). Фиг. 10а и 10b представляют данные, полученные на клетках, экспрессирующих низкое и высокое количество, соответственно, CD16:ζ белков слияния. Идентичные символы используются для мобилизации кальция и исследования цитолиза и показываются в однобуквенном коде справа. Закрытые кружки - клетки, экспрессирующие CD16:ζ (mfi в A, 21; В, 376); закрытые
квадраты - клетки, экспрессирующие CD16:7:ζ (48-65) (mfi A, 31; В, 82); открытые квадраты CD16: 7:ζ (48-65)Glu60Gln (mfi A, 33; В, 92); крестики - CD16:7:ζ (48-65)Asp63Asn (mfi A, 30; В, 74); закрытые треугольники - CD16:7: ζ (48-65)Tyr62Phe (mfi A, 24; В, 88); открытые кружки - CD16:7:ζ (48-65)Glu61Gin (mfi A, 20; В, 62); и открытые треугольники - CD16:7:ζ (48-65)Tyr62Ser (mfi В, 64). Фиг.10d и 10e показывают цитолитическую активность и Фиг. 10f показывает мобилизацию ионов кальция под действием химеры, несущей точечную мутацию около аминоконцевого тирозина (Y51). Идентичные символы используются для мобилизации кальция и исследования цитолиза и представляются справа. Закрытые кружки - клетки, экспрессирующие CD16:ζ (mfi в D, 21.2; в E, 672); закрытые квадраты - клетки, экспрессирующие CD16:7:ζ (48-65) (mfi D, 31.3; E, 179); закрытые треугольники - GD16:7:ζ (48-65)Asn48Ser (mfi D, 22.4; E, 209); открытые квадраты - CD16:7:ζ (48-65)Leu50Ser (mfi D, 25.0; E, 142) и открытые треугольники - CD16:7:ζ (48-65)Tyr51Phe (mfi D, 32.3; E, 294).

Фиг. 11a-b показываeт выравнивание внутренних повторов ζ и сравнение их способности поддерживать цитолиз. Фиг. 11a является схематической диаграммой химер, полученных делением ζ внутриклеточного домена на три и дополнение его до трансмембранного домена GD16:7 химеры. Последовательность внутриклеточных доменов представляется ниже (ПОСЛ. NN 38-40), общие остатки заключены в квадраты, а родственные остатки отмечены звездочками. Фиг. 11b показывает цитолитическую способность трех ζ субдоменов. Закрытые кружки - клетки, экспрессирующие CD16:ζ (mfi 476); закрытые квадраты - CD16:7:ζ (33-65) (mfi 68); открытые квадраты CD16:7:ζ (71-104) (mfi 114) и закрытые треугольники - CD16:7:ζ (104-138) (mfi 104).

Фиг. 12 является схематической диаграммой CD16F_cRγII химер.

Фиг. 13a-b показывает мобилизацию кальция после перекрестного связывания CD4: F_cRγII и CD16:F_cRγII химер. Фиг.13a показывает соотношение фиолетовой к синей флуоресценции, излучаемой клетками, нагруженными кальцийчувствительным флуорофором Indo-1, показанное в виде функции времени после перекрестного связывания CD16 внеклеточного домена с антителами. Фиг. 13b показывает аналогичный анализ увеличения соотношения фиолетовой к синей флуоресценции клеток, несущих CD4:F_cRγII химеры, после перекрестного связывания с антителами.

Фиг. 14a-b показывают исследование цитолиза CD4:F_cR γII и CD16F_cR γII химерами. Фиг. 14a показывает процент выхода ⁵¹Cr из клеток гибридомы анти-CD16 (мишень), если клетки выдерживаются с увеличивающимися количествами цитотоксических T лимфоцитов, экспрессирующих CD4:F_cRγ химеры (эффекторные клетки). Фиг. 14b показывает аналогичный анализ цитотоксичности, опосредуемой CD4: F_cRγII химерами против клеток мишеней, экспрессирующих гликопротеины оболочки ВИЧ.

Фиг. 15a-e показываeт идентификацию остатков в хвосте F_cRγIIA, который является важным для цитолиза. Фиг. 15b и 15c показывают мобилизацию кальция и цитолиз под действием варианта с карбокситерминальной делецией CD16: F_cRγIIA. Фиг. 15d и 15e показывают мобилизацию кальция и цитолиз под действием трехчастной химеры, имеющей постепенно уменьшающиеся аминоконцы внутриклеточного хвоста CD16:F_cRγIIA.

Фиг. 16 (ПОСЛ. N 24) показывает аминокислотную последовательность CD3 дельта рецепторного белка; в прямоугольник заключена последовательность, представляющая предпочтительную передающую сигнал цитолитическую часть.

Фиг. 17 (ПОСЛ. N 25) показывает аминокислотную последовательность T3 гамма белка рецептора; в прямоугольник заключена последовательность, представляющая предпочтительную передающую сигнал цитолитическую часть.

Фиг. 18 (ПОСЛ. N 26) показывает аминокислотную последовательность mbl белка рецептора; в прямоугольник заключена последовательность, представляющая предпочтительную передающую сигнал цитолитическую часть.

Фиг. 19 (ПОСЛ. N 27) показывает аминокислотную последовательность белка В29 рецептора; в прямоугольник заключена последовательность, представляющая предпочтительную передающую сигнал цитолитическую часть.

ПРИМЕР I
Конструкция IgGl:рецепторных химер человека.

Были получены последовательности тяжелых цепей IgGl человека путем присоединения последовательностей в C_H3 домене к фрагменту кДНК, произведенной от 3' конца трансмембранной формы мРНК антитела. Был получен 3' концевой фрагмент путем полимеразной цепной реакции, используя библиотеку кДНК миндалины в качестве субстрата и олигонуклеотидов, имеющих последовательности:
CGC GGG GTG АСС GTG CCC ТСС AGC AGC TTG GGC (ПОСЛ. N7) и CGC GGG GAT CCG TCG ТСС AGA GCC CGT CCA GCT CCC CGT CCT GGG CCT CA (ПОСЛ. N 8),
соответствующих 5' и 3' концам желаемых фрагментов ДНК, соответственно. 5' олиго является комплементарным сайту в C_H1 домене IgGl человека и 3' олиго является комплементарным как раз сайту 5' последовательностей, кодирующих пронизывающий мембрану домен. Продукт ПЦР расщепляли при помощи BstXI и BamHI и лигировали между свитами BstXI и BamHI полусинтетического гена IgGl антитела, несущего вариабельные и константные области. После введения BstXI во фрагмент BamHI, амплифицированную часть конструкции помещали после сайта SmaI в C_H3 путем замены рестрикционного фрагмента таким образом, чтобы только часть между сайтом SmaI и 3' олиго была производной реакции ПЦР.

Для создания химерного рецептора lgGl:ζ человека ген тяжелой цепи, оканчивающийся в сайте BamHI, присоединяли к сайту BamHI ζ, химеры, описанной ниже, таким образом, чтобы последовательности антител образовывали внеклеточную часть. Проточная цитометрия клеток COS, трансфецированных плазмидой, кодирующей химеру, показала высокий уровень экспрессии детерминант антител, когда плазмида экспрессии, кодирующая кДНК легкой цепи, была совместно трансфецирована, и умеренную экспрессию детерминант антител, когда плазмида экспрессии легкой цепи отсутствовала.

Похожие химеры, включающие IgG1 человека, слитые с η или γ (см. ниже), или любой передающей сигнал частью рецептора T клетки или белка F_c рецептора могут быть в целом сконструированы, как описано выше, используя обычные способы молекулярной биологии.

Для создания единичной транскрипционной единицы, которая позволяла бы экспрессироваться обеим тяжелой и легкой цепям из единого промотора, была получена из кодирующих последовательностей тяжелой и легкой цепей плазмида, кодирующая бицистронную мРНК, и 5' нетранслируемая часть мРНК, кодирующая регулирующий глюкозу белок из 78kD, иначе известный как grp78 или BiP. Последовательности grp78 получали путем ПЦР из геномной ДНК человека, используя праймеры, имеющие последовательности:
CGC GGG CGG CCG CGA CGC CGG CCA AGA CAG CAC (ПОСЛ. N9) и
CGC GTT GAC GAG CAG CCA GTT GGG CAG CAG CAG (ПОСЛ. N10)
по 5' и 3' концам, соответственно. Полимеразная цепная реакция вместе с этими олигонуклеотидами была проведена в присутствии 10% диметилсульфоксида. Фрагмент, полученный путем ПЦР, был расщеплен при помощи NotI и HincII и вставлен между сайтами NotI и HpaI против направления кодирующих последовательностей IgG1 человека. Затем последовательности, кодирующие кДНК легкой цепи IgG каппа, вводили против направления от лидера grp78, используя сайт HincII и другой сайт в векторе. Плазмида экспрессии, полученная в результате этих манипуляций, состояла из полусинтетического гена тяжелой цепи, следовавшего за последовательностями лидера grp78, следовавшей за последовательностями кДНК легкой цепи каппа, следовавшей за сигналами полиаденилирования, производными от фрагмента ДНК SV40. Трансфекция клеток COS плазмидой экспрессии дает заметно увеличенную экспрессию детерминант легкой цепи по сравнению с трансфекцией плазмидой, кодирующей только детерминанты тяжелой цепи.

Для создания бицистронного гена, содержащего химеру тяжелой цепи/рецептора и легкой цепи, последовательности по направлению тяжелой цепи могут быть замещены на любой ген химеры тяжелой цепи/рецептора, описанный здесь.

ПРИМЕР II
Конструкция рецепторных химер CD4
Выделяли кДНК цепей ζ (Weissman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 9709-9713 (1988b) и γ (Kuster et al., J. Biol. Chem. 265:6448-6452 (1990)) человека при помощи полимеразной цепной реакции из библиотек, полученных из опухолевой линии клеток HPB-ALL (Aruffo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 8573-8577 (1987b)) и из природных киллерных клеток человека, хотя кДНК η (Jin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:3319-3323 (1990)) выделяли из библиотеки тимоцитов мыши. кДНК ζ,η и γ присоединяли к внеклеточному домену сконструированного вида CD4, проявляющего сайт BamHI как раз по направлению пронизывающего мембрану домена (Aruffo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:8573-8577 (1987b); Zett lmeissl et al., DNA Cell Biol. 9:347-353 (1990)), который был присоединен к сайту BamHI, естественно присутствующему в кДНК ζ и η по близкому расположению на несколько остатков по направлению пронизывающего мембрану домена (ПОСЛ. NN 1, 3, 4 и 6). Для образования белка слияния с γ, сайт BamHI сконструировали в последовательности по приблизительно тому же положению (фиг. 1; ПОСЛ. N 2 и 5). Ген слияния был введен в плазмиду экспрессии вируса осповакцины, несущего ген gpt E.coli в качестве маркера отбора, и вводили в геном штамма WR вируса осповакцины путем рекомбинации и отбора по росту в среде с микофеноловой кислотой (Falkner et al., J. Virol. 62:1849-1854 (1988); Boyle et al., Gene 65:123-1228 (1988)). Цитометрический анализ в потоке показал, что рекомбинанты вируса осповакцины направляют на обильную продукцию белков слияния CD4:γ и CD4:ζ на клеточной поверхности, тогда как экспрессия CD4:η существенно слабее (фиг. 1b). Последнее обнаружение находится в соответствии с недавним сообщением, что трансфекция плазмиды экспрессии η кДНК в линию клеток гибридомы мыши дает существенно меньшую экспрессию, чем трансфекция сравнимой плазмидой экспрессии ζ (Clayton et al., J. Exp. Med. 172: 1243-1253 (1990)). Иммунопреципитация клеток, инфицированных рекомбинантами вируса осповакцины, показывает, что белки слияния образуют ковалентные димеры, отличные от естественно наблюдаемого антигена CD4. Молекулярные массы мономерных белков слияния CD4:ζ и CD4:γ и природного CD4, как было обнаружено составляют 63, 55 и 53 kD, соответственно. Большие массы белков слияния приблизительно соответствуют большей длине внутриклеточной части, которая превышает таковую у природного CD4, достигая 75(CD4:ζ ) или 5 (CD4:γ) остатков.

ПРИМЕР III
Химеры CD4 могут ассоциироваться с другими цепями рецептора
Клеточная поверхностная экспрессия макрофаговой природной киллерной клеточной формы F_cγRIII человека (CD16_TM) на трансфектантах, усиливается путем совместной трансфекции γ мыши (Kurosaki et al., Nature 342:805-807 (1989)) или человека (Hibbs et al., Science 246:1608-1611), а также ζ человека (Lanier et al., Nature 342:803-805 (1989)).

В соответствии с этими сообщениями экспрессия химер также разрешала поверхностную экспрессию CD16_TM, если доставляли к клетке мишени, или путем совместной трансфекции, или путем совместной инфекции с рекомбинантными вирусами осповакцины (фиг. 2). Способствование поверхностной экспрессии CD16_TM при помощи ζ было более выражено, чем способствование под действием γ (фиг. 2) в клетках исследованных линий, тогда как природный CD4 не усиливал экспрессии CD16_TM на поверхности.

ПРИМЕР IV
Мутанты ζ Asp не ассоциируются с F_c-рецептором
Для создания химер, которые не будут ассоциированы с существующим антигеном или F_c- рецепторами, были получены мутантные белки слияния, которые лишены остатков, или внутримембранного Asp, или внутримембранного Cys, или обоих. Проточная цитометрия показала, что интенсивность экспрессии на клеточной поверхности под действием различных мутантных химер существенно не отличалась от немутировавшего предшественника, и эксперименты по иммунопреципитации показали, что общая экспрессия под действием химер была сходной. Как ожидалось, было обнаружено, что мутантные химеры, лишенные остатка трансмембранного цистеина, не образуют димеров с дисульфидной связью. Две мутантные химеры, лишенные Asp, были не способны поддерживать экспрессию на поверхности CD16^TM, тогда как мономерные химеры, лишенные Cys, но имеющие Asp, позволяли проявляться CD16^TM при совместной экспрессии, но с более низкой эффективностью, чем родительский димер (фиг. 3).

ПРИМЕР V
Мутантные рецепторы сохраняют способность инициировать кальциевый ответ
Для определения того, что перекрестное связывание белков слияния будет позволять аккумуляцию свободного внутриклеточного кальция способом, подобным наблюдающемуся в T клетках с антигеном рецептора, клетки линии Т клеток лейкемии человека, Jurkat E6 (ATCC Accessior Number (Номер доступа) TIB 152, American Type Culture Collection, Rockvilie, MD) инфицировали рекомбинантами вируса осповакцины и измеряли относительную концентрацию кальция в цитоплазме после перекрестного связывания внеклеточного домена с антителами. Измерение проточной цитометрии проводили с клетками, нагруженными кальций-чувствительным зондом Indo-1 (Grynkiewicz et al., J. Biol. Chem. 260:3340-3450 (1985); Rabinovitch et al., J. Immunol. 137:952-961 (1986)). Фиг. 4a-d показывает результаты экспериментов с кальциевыми токами на клетках, инфицированных CD4: ζ и Asp^- и Cys^- мутантами ζ. Перекрестное связывание химер воспроизводимо увеличивает внутриклеточный кальций. CD4:η и CD4:γ аналогично позволяет аккумуляцию кальция в инфицированных клетках. Клетки Jurkat экспрессируют низкие уровни CD4 на клеточной поверхности, однако, перекрестное связывание природного CD4 в присутствии или отсутствие CD16:ζ не изменяет уровни внутриклеточного кальция (фиг. 4-b).

ПРИМЕР VI
Химеры CD4:ζ,η и γ опосредуют цитолиз мишеней, экспрессирующих gp120/41 ВИЧ
Для определения того, что химерные рецепторы будут запускать цитолитические эффекторные программы была разработана модель мишень:эффекторная система, основанная на распознавании CD4 комплекса gp120/gp41 оболочки ВИЧ. Клетки HeLa инфицировали рекомбинантными вирусами осповакцины, экспрессирующие gp120/gp41 (Chakrabarti et al., Nature 320:535-537 (1986); Earl et al., J. Virol. 64:2448-2451 (1990)) и метили ⁵¹Cr. Меченые клетки инкубировали с клетками из аллоспецифической линии (CD8⁺, CD4^-) цитотоксических лимфоцитов человека, которые были инфицированы рекомбинантами вируса осповакцины, экспрессирующими CD4: ζ, CD4: η или CD4:γ химеры, или CD4:ζ Cys11Gly:Asp15Gly двойную мутантную химеру. Фиг. 5a-c показывает, что клетки HeLa, экспрессирующие gp120/41, специфически лизировались цитотоксическими T лимфоцитами (CTL), экспрессирующими химеры CD4. Неинфицированные клетки HeLa не были мишенью для CTL, вооруженных химерами CD4:ζ, a клетки HeLa, экспрессирующие gp120/41 не распознавались неинфицированными CTL. Для сравнения эффективности различных химер подбирали соотношения эффектора к мишени для фракции CTL, экспрессирующей химеры CD4, и для фракции клеток HeLa, экспрессирующих gp120/41, проточной цитометрией. Фиг. 5c показывает цитометрический анализ экспрессии CD4 под действием CTL, используемых в экспериментах по цитолизу, представленному на фиг. 5a и 5b. Хотя средняя плотность на поверхности CD4:ζ значительно превышает среднюю плотность CD4:η, цитолитические эффективности клеток, экспрессирующих обе формы, были близкими. При коррекции фракции мишеней, экспрессирующих gp120, эффективность цитолиза, опосредуемого белками CD4: ζ и CD4:η, является сравнимой с высшими эффективностями, докладываемыми для специфических рецепторных пар мишень:эффектор T клеток (среднее соотношение эффектора к мишени для 50% выхода под действием T клеток, экспрессирующих CD4:ζ, составляло 1,9 ± 0,99, n = 10. Слияние CD4:γ было менее активно, чем для слияния CD4:ζ, лишенного трансмембранных остатков Asp и Cys. Однако в обоих случаях наблюдался заметный цитолиз (фиг. 5b-c).

Для контроля возможности того, что инфекция вирусом осповакцины может способствовать артефактному распознаванию под действием CTL, были проведены аналогичные эксперименты по цитолизу с клетками мишенями, инфицированными рекомбинантами вируса осповакцины, экспрессирующими связанную с фосфатидилинозитолом форму CD16 (CD16_pI) и меченными ⁵¹Cr, вместе с CTL, инфицированными контрольными рекомбинантами, экспрессирующими или CD16_pI, или CD16: ζ. Фиг. 6a показывает, что T клетки, экспрессирующие не CD4 химеры, не распознают нативные клетки HeLa или клетки HeLa, экспрессирующие gp120/41, и аналогично, T клетки, экспрессирующие химеры CD4, не распознают клетки HeLa, экспрессирующие другие, кодируемые вирусом осповакцины белки поверхности. Кроме того, CTL, экспрессирующие не химерные CD4, по существу не лизируют клетки HeLa, экспрессирующие gp120/41 (фиг. 6a).

ПРИМЕР VII
Клетки, несущие МНС класса II, не являются мишенью для химер
Предполагается, что CD4 взаимодействует с неполиморфной последовательностью, экспрессированной под действием антигена МНС класса II (Gay et al., Nature 328:626-629 (1987); Sleckman et al., Nature 328:351-353 (1987)). Хотя специфическое взаимодействие между очищенными белками CD4, и антигеном класса II никогда не было документировано, при определенных условиях может быть показана адгезия между клетками, экспрессирующими CD4 и клетками, экспрессирующими молекулы класса II (Doyle et al., Nature 330:256-259 (1987); Clayton et al., J. Exp. Med. 172:1243-1253 (1990); Lamarre
et al. , Science 245:743-746 (1989)). Далее исследовали, могло ли быть зарегистрировано поражение клеток, несущих антиген класса II. Фиг. 6b показывает, что не имеется специфического цитолиза, вызванного CD4:ζ, в отношении линии В клеток Raji, которые обильно экспрессируют антиген класса II. Хотя наблюдается умеренный (≈ 5%) цитолиз, отрицательный мутант Raji по классу II, RJ. 2.5, (Accolla, J. Exp. Med. 157:1053-1058 (1983)) проявляет близкую восприимчивость, как клетки Raji, инкубированные с неинфицированными T клетками.

ПРИМЕР VIII
Требования к последовательности для индукции цитолиза под действием антигена T клеток/Зета цепи F_c рецептора
Хотя химеры между CD4 и ζ могут вооружать цитотоксические T лимфоциты для поражения клеток мишеней, экспрессирующих gp120 ВИЧ, для того чтобы без сомнения сравнить свойства зета химер, введенных в линии T клеток человека, был задуман альтернативный CD4. Такие линии могут экспрессировать CD4, создавая трудности для специфического определения взаимодействия между видом и степенью мобилизации кальция и цитотоксической возможностью различных химер. Для того чтобы обойти это, были созданы химеры между ζ и CD16, в которых внеклеточный домен CD16 прикрепляется к трансмембранной и внутриклеточной последовательностями ζ (фиг. 7а). Генные слияния были введены в плазмиду экспрессии вируса осповакцины, несущую ген gpt E.coli, в качестве маркера отбора, и введен в геном штамма WR вируса осповакцины путем гомологической рекомбинации и селекции по росту в микофеноловой кислоте (Falkner and Moss, J. Virol. 62:1849 (1988); Boyle and Coupar, Gene 65:123 (1988)).

Линии T клеток инфицировали рекомбинантами вируса осповакцины и измеряли относительную концентрацию ионов кальция в цитоплазме после перекрестного связывания внеклеточных доменов с антителами. Проводили спектрофлуометрическое (для всей популяции) измерение и измерение проточной цитометрии (для единичных клеток) для клеток, нагруженных красителем Indo-1 (Grynkiewicz et al., J. Biol. Chem. 260:3440 (1985); Rabinovitch et al., J. Immunol. 137:952 (1986)). Фиг. 7b показывает анализ данных, полученных на линии T клеток лейкемии человека Jurkat, инфицированных рекомбинантами вакцинии, экспрессирующими CD16:ζ белок слияния. Перекрестное связывание химер воспроизводимо увеличивает внутриклеточный кальций, хотя аналогичная обработка клеток, экспрессирующих не химерный CD16, имеет небольшой эффект, или он отсутствует. Когда химеру экспрессировали в линии мутантных клеток, лишенных рецептора антигена, либо REX33A (Breitmeyer et al. , J. Immunol. 138:726 (1987); Sancho et al., J.Biol. Chem. 264:20760 (1989)), либо мутанта Jurkat JRT3. T3.5 (Weiss et al. , J. Immunol. 135:123 (1984)), наблюдали сильный ответ на CD16 перекрестное связывание антитела. Аналогичные данные были получены на мутантной линии клеток REX20A (Breitmeyer et al., выше, 1987; Blumberg et al., J. Biol. Chem. 265:14036 (1990)) и на отрицательном мутанте CD3/Ti линии клеток Jurkat, полученной в этой лаборатории. Инфицирование рекомбинантами, экспрессирующими CD16: ζ не восстанавливает ответ на анти- CD3 антитело, показывая, что белок слияния не действует путем сохранения цепей внутриклеточного комплекса CD3.

Для оценки способности химер перенаправливать опосредованный клеточный иммунитет CTL инфицировали рекомбинантами вируса осповакцины, экспрессирующими CD16 химеры, и использовали для специфического лизиса клеток гибридомы, экспрессирующих мембраносвязанные анти-CD16 антитела. Это исследование является продолжением исследования цитотоксичности гибридомы, исходно разработанного для анализа эффекторных механизмов клеток, несущих F_c рецепторы (Graziano and Fanger J. Immunol. 138:935,1987; Graziano and Fanger, J. Immunol. 139: 35-36, 1987; Shen et al., Mol. Immunol. 26:959, 1989; Fanger et al. , Immunol. Today 10:92, 1989). Фиг. 8b показывает, что экспрессия CD16:ζ в цитотоксических лимфоцитах позволяет вооруженным CTL уничтожать 3G8 (анти CD16; Fleit et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:3275, 1982) клетки гибридомы, тогда как CTL, экспрессирующие фосфатидилинозитол-связанную форму CD16, являются неактивными. CTL, вооруженные CD16:ζ, также не убивают клетки гибридомы, экспрессирующей неродственное антитело.

Для идентификации минимальных ζ последовательностей, необходимых для цитолиза, были получены серии мутантов с делециями, в которых больше ζ внутриклеточных доменов последовательно удалены с карбоксиконца (фиг. 8a). Большинство из внутриклеточных доменов зета могут быть удалены с небольшими последствиями для цитолитической способности; химера полной длины CD16:ζ была по существу равна по эффективности химере с делециями по остатку 65, CD16: ζ Asp66^* (фиг. 8b). Существенное снижение цитотоксичности наблюдалось при делеции в ζ остатка 59 (химера CD16:ζ:Glu60^*), далее, делеция по остатку 50 приводит к небольшому снижению активности. Однако полной потери активности не наблюдалось даже, если внутриклеточный домен был укорочен до трех остатков трансмембранного якоря (фиг. 8b).

Поскольку ζ является димером с дисульфидной связью, имелось одно объяснение сохранения цитолитической активности, эндогенная ξ образует гетеродимеры с химерной ζ с делецией, посредством этого восстанавливая активность. Для проверки этой идеи остатки 11 и 15 в ζ были заменены с Asp и Cys на, соответственно, Gly (Cys11Gly/Asp15Gly), и была проведена преципитация следующим образом. Приблизительно 2•10⁶ клеток CV1 инфицировали рекомбинантом вируса осповакцины в течение одного часа в свободной от сыворотки среде DME, при кратности инфицирований (moi), составляющей, по крайней мере, десять. Через шесть-восемь часов после инфицирования клетки снимали с планшетов в PBS/1 мМ ЭДТА и метили поверхность I¹²⁵ 0,2 mci на 2•10⁶ клеток, используя лактопероксидазу и H₂O₂ по методу Clark и Einfeld (Leubocyte Typing II, стр, 155-167, Springer-Verlag, NY, 1986). Меченые клетки собирали путем центрифугирования и лизировали в 1% NP-40, 0,1% SDS, 0,15 M NaCl, 0,05 Трис, pH 8,0, 5 мМ MgCl₂, 5 мМ KCl, 0,2 M иодоацетамид и 1 мМ ФМСФ. Ядра удаляли путем центрифугирования, а белки CD16 иммунопреципитировали при помощи антитела 3G8 (Fleit et al., выше, 1982; Medarex) и анти-мышиной агарозы (Cappel, Durham, NC). Образцы подвергали электрофорезу на 8% полиакриламидном/SDS геле при невосстанавливающих условиях. Эти иммуноосаждения подтверждают, что химера CD16:ζCys11Gly/Asp15Gly не ассоциируется в димерные структуры с дисульфидной связью.

Была исследована также цитолитическая активность мутантных рецепторов. Мутантная химера, лишенная остатка 65 (CD16:ζCys11Gly/Asp15Gly/Asp66^*), была в два - восемь раз менее активна, в зависимости от условий определения, при исследовании цитолиза, чем немутированная химера сравнения (CD16:ζAsp66^*), которая обычно была в пределе фактора два, или неразличима от активности CD16:ζ (фиг. 9b). Снижение активности мутантных химер сравнимо с наблюдаемым снижением у CD4 химер близкой структуры (см. выше) и, по-видимому, наиболее связывается с пониженной эффективностью ζ мономеров по сравнению с димерами. В противоположность этому мутантная Asp^-, Cys^- химера, лишенная остатка 59, не обладала цитолитической активностью (фиг. 9b), поддерживая гипотезу, что ассоциация с другими цепями, опосредованная трансмембранными остатками Cys и/или Asp, была более ответственна за слабое сохранение цитолитической активности в амино-конце, чем остаток 65.

Исследования проточной цитометрии показали, что мутанты с делециями, лишенные трансмембранного остатка Asp и Cys, еще могут способствовать увеличению ионов свободного внутриклеточного кальция в ответ на перекрестное связывание антитела в мутанте TCR^- линии клеток Jurkat (фиг. 9d). Подобные результаты были получены для химер, экспресированных в родительской линии клеток Jurkat. В случае CD16:ζCys11Gly/Asp15Gly/Glu69^* эти данные показывают, что способность опосредовать кальциевые ответы может быть отделена при помощи мутации от способности поддерживать цитолиз.

Для того чтобы с определенностью устранить возможность вклада трансмембранных остатков ζ, трансмембранные остатки и первые 17 цитоплазматических остатков ζ были заменены на последовательности, кодирующие расположение в мембране, и первые 14, или первые 17 цитоплазматических остатков CD5 или CD7 антигенов, соответственно (фиг. 9a). Полученные трехчастные белки слияния CD16:5:ζ(48-65) и CD16:7:ζ(48-65) не образуют димеры с дисульфидной связью, как это делают более простые химеры CD16:ζ, поскольку они лишены остатка цистеина в трансмембранном домене ζ. Обе трехчастные химеры были способны мобилизовать кальций в клетках Jurkat и TCR негативной линии клеток (фиг. 9d) и устанавливать цитолитический ответ в CTL (фиг. 9c и данные не представлены). Однако обрыв ζ части по остатку 59 в химере CD16:7:ζ(48-59) устраняет способность трехчастного слияния направлять кальциевую чувствительность у TCR положительных клеток Jurkat, или цитолиз у зрелых CTL (фиг. 9c и 9d и данные не представлены).

Для исследования вклада отдельных остатков внутри фрагмента из 18 остатков авторами были получены многие мутантные варианты путем сайт направленного мутагенеза и оценена их способность опосредовать рецептор-направленное уничтожение в условиях низкой (фиг. 10a и 10d) или высокой (фиг. 10b и 10e) экспрессии химерного рецептора. Фиг. 10a-f показываeт, что пока количество относительно консервативных замен (то есть замена кислотных остатков на их родственные амиды или тирозина на фенилаланин), которые охватывают остатки 59-63, приводят к умеренному компромиссу с цитолитической эффективностью, в целом варианты сохранили способность мобилизовать кальций. Однако совместно эти остатки содержат важный субфрагмент ввиду того, что его удаление устраняет цитолитическую активность. Перевод Tyr 62 в или Phe, или Ser устраняет и цитотоксический, и кальциевый ответы. Замена Tyr 51 на Phe по аминоконцу сегмента из 18 аминокислот лишает и кальциевой мобилизации, и цитолитической активности, хотя замена Leu на Ser по положению 50 устраняет кальциевый ответ, хотя только частично ослабляет цитолиз. Не будучи привязанным к конкретным гипотезам, предполагается, что неспособность мутанта Leu50Ser мобилизовать кальций путем исследования проточной цитометрией в течение короткого времени, не полностью отражает их способность опосредовать существенное увеличение концентрации свободного кальция, по сравнению с долговременным исследованием цитолиза. Однако сообщалось о кальций-нечувствительной цитолитической активности для тех же цитолитических линий T клеток, и возможности того, что аналогичный феномен подчеркивает описанные здесь результаты, не выходя из правила. Замена Asn48 на Ser частично ослабляет цитотоксичность в некоторых экспериментах, хотя имеет незначительное влияние в других.

Для исследования возможной роли лишних элементов последовательности внутриклеточный домен ζ разделили на три сегмента, охватывающих остатки 33-65, 71-104 и 104-138. Каждый из этих сегментов был прикреплен к химере CD16:CD7 через сайт Mlul, введенный дистально от основных якорных мембранных последовательностей внутриклеточного домена CD7 (см. ниже, фиг. 11a). Сравнение цитолитической эффективности трех элементов показало, что они по существу равноэффективны (фиг. 11b). Сравнение последовательности (фиг. 11a) показывает, что второй фрагмент несет одиннадцать остатков между тирозином, тогда как первый и третий фрагменты имеют десять.

Хотя точного подсчета способов активации T клетки не было сделано, ясно, что агрегация антитела рецептора, или рецепторных химер, которые обладают внутриклеточными последовательностями ζ, запускает мобилизацию кальция, выход цитокинов и гранул и появление на поверхности клетки маркеров активации. Активный сайт ζ, короткая линейная пептидная последовательность, возможно две, столь маленькие, чтобы иметь собственную ферментативную активность, по-видимому, взаимодействуют с одним, или в лучшем, с несколькими белками, для опосредования активации клеток. Ясно также, что мобилизация свободного кальция сама по себе не является достаточной для клеточной активации, как и способность опосредовать цитолиз, могут быть разделены при помощи мутации от способности опосредовать аккумуляцию кальция.

Как здесь показано, добавление 18 остатков от внутриклеточного домена ζ к трансмембранному или внутриклеточному домену двух неродственных белков позволяет полученным химерам перенаправлять цитолитическую активность против клеток мишеней, которые связываются с внеклеточной частью белков слияния. Хотя химеры, несущие фрагмент из 18 остатков являются приблизительно в восемь раз менее активными, чем химеры на базе полной длины ζ, пониженная активность может быть приписана к потере трансмембранных взаимодействий, которые обычно позволяют дикому типу ζ образовывать димеры с дисульфидной связью. То есть конструкция, лишенная ζ, которая имеет то же карбокси окончание, как и фрагмент, и лишенная трансмембранных остатков Cys и Asp, обычно проявляет немного меньшую активность, чем химеры, несущие только фрагмент из 18 остатков.

Цитолитически компетентный элемент, на который обращено внимание, имеет два тирозина и не имеет серинов или треонинов, ограничивая возможности вклада фосфорилирования в активность. Мутация по любому тирозину нарушает активность, однако несмотря на предварительные эксперименты, не свидетельствует о существенности фосфорилирования после перекрестного связывания химерных поверхностных антигенов, имеющих фрагмент из 18 остатков, возможное участие такого фосфорилирования на низком уровне не может быть исключено. В дополнение к эффектам, отмеченным для двух остатков тирозина, многие аминокислотные замены по амино- и карбоксиконцам фрагмента ослабляют активность в условиях низкой рецепторной плотности.

Последовательности, близкие к активному фрагменту ζ, могут быть найдены в цитоплазматических доменах нескольких других трансмембранных белков, включая CD3 δ и γ молекулы, поверхностные, ассоциированные с IgM белки mbl и В29, и цепи β и γ высокоаффинного рецептора IgE, F_cεRI (Reth, Nature 338: 383, 1989). Хотя функция этих последовательностей не определена, каждая может быть способна автономно активировать T клетку, если достаточно экспрессированы, и такая активность может объяснить остаточную чувствительность TCR, наблюдаемую у зета-отрицательной мутантной линии клеток (Sussman et al. , Cell 52:85, 1988).

Сама по себе ζ имеет три таких последовательности, приблизительно одинаково расположенных, и грубое разделение на три части внутриклеточного домена показывает, что каждая часть способна инициировать цитолитический ответ. η-Cплайсинговая изоформа ζ (Jin et al., выше, 1990; Clayton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:5202, 1991), лишенная карбокси половины третьего фрагмента. Поскольку удаление карбокси половины первого фрагмента лишает активности, предполагается, по-видимому, что большинство биологических эффективностей η могут быть приписаны к первым двум фрагментам. Хотя при различных измерениях η является одинаково активной как ζ, по стимулированию опосредованного антигеном выхода цитокинов (Bauer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:3842, 1991) или перенастройке цитолиза (см. выше), η не является фосфорилированной в ответ на стимуляцию рецептора (Bauer et al., выше, 1991). Таким образом, для фосфорилирования требуется либо наличие всех трех фрагментов, либо третий фрагмент представляет благоприятный субстрат для неизвестной тирозинкиназы.

ПРИМЕР IX
Передача цитолитического сигнала F_c рецептором человека.

Для оценки действия различных подтипов F_c рецептора человека были созданы химерные молекулы, у которых внеклеточные домены антигенов CD4, CD5 или CD16 человека присоединены к трансмембранному или внутриклеточному доменам F_cRIIγA, подтипов В1, В2 и С (номенклатура Ravetch and Kinet, Ann. Rev. Immunol. 9: 457, 1991). В особенности, последовательности ДНК, соответствующие трансмембранному и цитоплазматическому доменам ранее описанных изоформ F_cRIIA-B1 и В2, амплифицировали из предсуществующего клона РС23 или из библиотеки кДНК миндалины человека (сконструированных при помощи обычных способов), используя следующие синтетические олигонуклеотидные праймеры:
CCC GGA ТСС CAG CAT GGG CAG CTC TT (ПОСЛ. N 18; F_cRII A прямая);
CGC GGG GCG GCC GCT TTA GTT ATT ACT GTT GAC ATG GTC GTT (ПОСЛ. N 19; F_cRII A обратная);
GCG GGG GGA ТСС CAC TGT CCA AGC TCC CAG CTC TTC ACC G (ПОСЛ. N 20; F_cRII В1 и F_cRII В2 прямая); и
GCG GGG GCG GCC GCC TAA ATA CGG TTC TGG TC (ПОСЛ. N21; F_cRII В1 и F_cRII В2 обратная).

Эти праймеры, содержащие сайты расщепления для ферментов BamHI и Notl, соответственно, вырезали 6 остатков из 5' конца. Сайт Notl следовал непосредственно за антисмысловым стоп кодоном, либо СТА или ТТА. Все праймеры содержали 18 или более остатков, комплементарных 5' и 3' концам желаемых фрагментов. Фрагмент кДНК, соответствующий цитоплазматическому домену F_cRIIγC, который отличается от 11A изоформы только по одному аминокислотному остатку (L на P по остатку 268) получали путем сайт направленного мутагенеза путем прерывания ПЦР, используя праймеры последовательностей:
TCA GAA AGA GAC AAC CTG AAG AAA CCA ACA A (ПОСЛ. N 22) и
TTG TTG GTT TCT TCA GGT TGT GTC TTT CTG A (ПОСЛ. N 23).

Фрагменты ПЦР вводили в вектор экспрессии вируса осповакцины, который содержал внеклеточные домены CD16 или CD4, соответственно, введенные в дикий тип вируса осповакцины посредством рекомбинации в локус тимидинкиназы, используя отбор для совместной интеграции с gpt E.coli для улучшения идентификации желаемых рекомбинантов. Идентичность всех изоформ (показанная на фиг.12) подтверждена путем дидезоксисиквенса.

Продукция белков химерного рецептора далее подтверждена при помощи исследований иммунопреципитации. Приблизительно 10⁷ клеток JRT.T3.5 инфицировали на 1 час в лишенной сыворотки среде IMDM с рекомбинантом вируса осповакцины при кратности инфицирований, по крайней мере, составляющей 10 раз. Через двенадцать часов после инфицирования клетки собирали и метили поверхность I¹²⁵ 0,5 mCi на 10⁷ клеток, используя лактопероксидазный/глюкозооксидазный метод (Clark and Einfeld, выше). Меченые клетки собирали путем центрифугирования и лизировали 1% NP-40, 0,1 мМ MgCl₂, 5 мМ KCl, 0,2 М иодацетамида и 1 мМ ФМСФ. Ядра удаляли путем центрифугирования и иммунопреципитировали белок слияния CD16 с антителами и антимышиной IgG агарозой. Образцы подвергали электрофорезу в восстанавливающих условиях. Все молекулы иммунопреципитированных химерных рецепторов были ожидаемых молекулярных масс.

Для исследования способности химерных рецепторов опосредовать увеличение свободного цитоплазматического иона кальция использовали рекомбинанты вирусов для инфицирования TCR^- мутанта линии клеток Jurkat JRT3.T3.5 (как здесь описано) и измеряли свободный кальций в цитоплазме клеток (как здесь описано) после перекрестного связывания внеклеточных доменов с моноклональным антителом 3G8 или Leu-3А (как здесь описано). Эти эксперименты показали, что внутриклеточные домены F_cRγII A и C были способны опосредовать увеличение в цитоплазме свободного иона кальция после перекрестного связывания внеклеточных доменов, тогда как внутриклеточные домены F_cRγII В1 и В2 были неактивны в сравнимых условиях (фиг. 13a и 13b). Гибриды CD4, CD5 и CD16:F_cRII А обладали по существу равной способностью стимулировать кальциевый ответ (фиг. 13a-b). Другие линии клеток от дифференцирующихся линий моноцитов и лимфоцитов были способны к ответу на сигнал, инициируемый путем перекрестного связывания внеклеточных доменов.

Для изучения участия различных внутриклеточных доменов F_cRγII в цитолизе цитотоксические T лимфоциты человека (CTL) инфицировали рекомбинантами вируса осповакцины, экспрессирующими химеры CD16: F_cR γII А, В1, В2 и C. Инфицированные клетки затем совместно культивировали с нагруженными ⁵¹Cr клетками гибридомы (то есть, 3G8 10-2 клетками), которые экспрессировали клеточные поверхностные антитела к CD16. В этом исследовании CTL, несущие CD16 химеру, поражающую клетки мишени гибридомы (позволяющие выходу свободного ⁵¹Cr), если внеклеточный домен химеры CD16 был присоединен к внутриклеточному сегменту, способному активировать лимфоцитарную эффекторную программу; это исследование цитолиза описывается в деталях ниже. Фиг. 14a показывает, что CTL, вооруженные CD16:F_cRγII А и С, но не В1 или В2, являются способными к лизису клеток мишеней, экспрессирующих клеточное поверхностное анти-CD16 антитело.

Для устранения возможности того, что специфический цитолиз был в некотором виде приписываемым к взаимодействию с радикалом CD16, были проведены эксперименты по цитолизу, в которых внутриклеточные домены F_cRII были прикреплены к внеклеточному домену CD4. В этом случае клетками мишенями были клетки HeLa, экспрессирующие белки оболочки ВИЧ gp120/41 (клетки HeLa специфически инфицировали вектором вируса осповакцины vPE16, доступному из National Institute of Allergy and Infections Disease AIDS Depository, Bethesda, MD). Как и в системе CD16, клетки мишени, экспрессирующие оболочку ВИЧ, были восприимчивы к лизису под действием T клеток, экспрессирующих химеру CD4:F_cR γIIА, но не F_cRγII B1 или В2 (фиг. 14b).

Внутриклеточные домены F_cRγII А и С не разделяли заметной гомологии с любым другим белком, включая членов расширенного семейства F_cRγ/TCRζ. Для определения последовательности элементов, ответственных за индукцию цитолиза, были получены 5' и 3' делеции внутриклеточного домена, кодирующих последовательностей (описанных ниже и показанных на фиг. 15a), и оценены по эффективности мобилизации кальция и исследования цитолиза (как здесь описано). В экспериментах, в которых аминоконцевая часть внутриклеточного домена удалена, трансмембранный домен F_cRγII был замещен на трансмембранный домен неродственного антигена CD7 для устранения возможности вклада взаимодействий, опосредованных пронизывающим мембрану доменом.

Фиг. 15b и 15c показывают, что удаление 14 карбоксиконцевых остатков, включая тирозин 298, приводит к полной потере цитолитической способности и существенному снижению возможности мобилизации кальция. Дальнейшая делеция как раз перед тирозином 282 дает идентичный фенотип (фиг. 15b и 15c). Делеции из N-конца внутриклеточного домена до остатка 268 не имеют существенного влияния на или кальциевый профиль, или цитолитическую способность, тогда как делеция до остатка 275 заметно ослабляет выход свободного кальция, но имеет небольшое влияние на цитолиз (фиг. 15d и 15e). Дальнейшие делеции до остатка 282 дают F_cRγII хвосты, которые лишены способности и мобилизовать кальций, и запускать цитолиз (фиг. 15d и 15e). "Активным элементом", определенным по этим грубым измерениям, представляется относительно большой (36 аминокислот) фрагмент, и содержащий два тирозина, разделенных 14 остатками.

ПРИМЕР X
Дополнительные триггерные белки рецептора T клетки и рецептора В клетки
Другими внутриклеточными и трансмембранными передающими сигнал доменами согласно изобретению могут быть производные рецепторных белков T клетки - CD3 дельта и T3 гамма, и рецепторных белков В клетки - mb1 и В29. Аминокислотные последовательности этих белков представлены на фиг. 16 (CD3 дельта; ПОСЛ. N 24), фиг. 17 (T3 гамма; ПОСЛ. N 25), фиг. 18 (mb1; ПОСЛ. N 26) и фиг.19 (В29; ПОСЛ. N 27). Части последовательностей, достаточные для передачи цитолитического сигнала (и, следовательно, предпочтительно включенные в химерный рецептор по изобретению), представлены в скобках. Химерные рецепторы, которые включают эти белковые домены конструируются и используются в терапевтических способах по изобретению, как описано выше.

ПРИМЕР XI
Химерные рецепторы CD28
Поскольку активация T клетки, как было показано, увеличивается при участии CD28, изобретение также включает терапевтические клетки, экспрессирующие пары химерных рецепторов: первая химера включает внутриклеточный домен CD28, а вторая химера включает любой внутриклеточный или трансмембранный сигнал-передающий домен, описанный здесь. В данных парах химерных рецепторов внеклеточные домены могут быть идентичными (например, оба могут происходить от белка CD4 и поэтому оба распознают ВИЧ-инфицированные клетки) или каждый могут быть сконструированы для распознавания различных молекул мишеней на поверхности клетки или патогена.

В одном конкретном примере пара химер может включать два различных внеклеточных домена, каждый распознающий различную антигенную характеристику опухоли мишени.

ПРИМЕР XII
Экспериментальные методы
Инфицирование вирусом осповакцины и радиоиммунопреципитация
Приблизительно 5±10⁶ клеток CV1 были инфицированы в течение одного часа в среде DME без сыворотки рекомбинантом вируса осповакцины при кратности инфицирований (moi), по крайней мере, составляющей десять (титр измеряли по клеткам CV1). Клетки после инфицирования помещали в свежую среду и метаболическим способом метили ³⁵S-метионином 200 мкCi/мл плюс цистеин (Tran ³⁵S-меченный, ICN. ; Costo Mesa, CA) в среде DMEM без метионина и цистеина (Gibco; Grand Island, NY) в течение шести часов. Меченые клетки снимали в PBS, содержащем 1 мМ ЭДТА, собирали при помощи центрифугирования и лизировали в 1% NP-40, 0,1% SDS, 0,15 M NaCl, 0,05 М Трис pH 8,0, 5 мМ ЭДТА и 1 мМ ФМСФ. Ядра удаляли путем центрифугирования, а белки CD4 иммуноосаждали с ОКТ4 антителом и анти-мышиной IqG агарозой (Cappel, Durham, NC). Образцы подвергали электрофорезу на 8% полиакриламидном/-SDS геле при не восстанавливающих (HB=NR) и восстанавливающих (B=R) условиях. Гели, содержащие меченные ³⁵S образцы, импрегнировали En ³Hance (New Ingland Nuclear, Boston, MA) перед авторадиографией. Усиление экспрессии трансмембранной формы CD16, CD16_TM измеряли путем сравнения его экспрессии в клетках CV1, однократно инфицированных CD16_TM с экспрессией в клетках, совместно инфицированных вирусами, кодирующими CD16_TM и химеры ζ и γ. После инфекции и инкубации в течение шести часов или более клетки снимали с планшетов в PBS, 1 мМ ЭДТА и измеряли экспрессию CD16_TM или химер путем непрямой иммунофлуоресценции и проточной цитометрии.

Определение кальциевого тока
Клетки Jurkat, подлиния Е6 (Weiss et al. , J. Immunol. 133:123-128 (1984)) инфицировали рекомбинантными вирусами осповакцины в течение одного часа в среде IMDM без сыворотки при 10-кратном moi и инкубировали в течение от трех до девяти часов в IMDM и 10% FBS. Клетки собирали центрифугированием и ресуспендировали до концентрации 3±10⁶ клеток/мл в полной среде, содержащей 1 мМ ацетометоксиэфира Indo-1 (Grynkiewicz et al., J. Biol. Chem. 260: 3340-3450 (1985)) (Molecular Probes) и инкубировали при 37^oC в течение 45 минут. Клетки, нагруженные Indo-1, осаждали и ресуспендировали до 1 • 10⁶ мл в среде IMDM без сыворотки и хранили при комнатной температуре в темноте. Клетки исследовали на свободный ион кальция при помощи одновременного измерения эмиссии фиолетовой и синей флуоресценции путем проточной цитометрии (Rabinovitch et al., J. Immunol. 137:952-961 (1986)). Для инициации кальциевого тока к суспензии клеток добавляли либо фикоэритрин (РЕ), конъюгированный Leu-3А (анти-CD4) (Becton Dickinson, Lincoln Park, NJ) в концентрации 1 мкг/мл после неконъюгированного анти-мышиного IgG в 0 время, или к клеточной суспензии добавляли неконъюгированный 3G8 (анти-CD16) моноклональное антитело в концентрации 1 мкг/мл после 10 мкг/мл РЕ-конъюгированного Fab' козьего анти-мышиного IgG в 0 время. От популяции РЕ-положительных (инфицированных) клеток, которые обычно представляли 40-80% от всех клеток, набирали гистограммы соотношения фиолетовой/синей эмиссии. Ответ в неинфицированных T клетках с антигеном рецептора запускали под действием антитела ОКТ3 без перекрестного связывания. Для экспериментов, включающих химерные рецепторы CD16, образцы, проявляющие базальную линию, смещенную в направлении низких концентраций кальция (без антитела), исключали из анализа. Данные гистограммы сразу же анализировали путем преобразования бинарных данных в ASCII коды, используя программу Write Hand Man (Cooper City, FL), после анализа с набором программ FORTRAN. Перед добавлением второго реагента антитела использовали соотношение синей/фиолетовой эмиссии для установления нормализованного начального соотношения, принятого равным единице, и соотношения порога покоя, установленного так, чтобы 10% от покоящейся популяции достигали порога.

Исследование цитолиза
Линию T клеток человека WH3 CD8⁺ CD4^- HLA B44, линия с вырезанным цитолизом, поддерживали в IMDM с 10% сыворотки человека в присутствии 100 ЕД/мл ИЛ-2 и периодически стимулировали или неспецифически облученными (3000 рад) HLA-нетипированными лимфоцитами периферической крови и 1 мкг/мл фитогемагглютинина или специфически облученными, имеющими В44, моноядерными клетками. После одного дня неспецифической стимуляции ФГА разбавляли до 0,5 мкг/мл путем добавления свежей среды и через три дня сменяли среду. Клетки выращивали, по крайней мере, в течение трех дней после стимуляции пeред использованием в исследовании цитотоксичности. Клетки инфицировали рекомбинантом вируса осповакцины при кратности инфицирований, по крайней мере, составляющей 10 раз в течение одного часа в среде без сыворотки, после инкубации в полной среде в течение трех часов. Клетки собирали путем центрифугирования и ресуспендировали до плотности 1•10⁷ клеток/мл. В каждую ячейку планшета с U-образным дном добавляли 100 мкл суспензии, содержащей 100 мкл/ячейку полной среды. Клетки разбавляли в два раза сериями этапов. Две ячейки для каждого образца не содержали лимфоцитов, позволяя измерение спонтанного выхода хрома и общего захвата хрома. Клетки мишени подлинии S3 инфицировали в 6,0 или 10,0 см планшетах при приблизительно 10 moi в час в среде без сыворотки, после инкубации в полной среде в течение трех часов. Затем клетки снимали с планшетов в PBS и ЭДТА и подсчитывали. Аликвоты по 10⁶ клеток мишеней (HeLa, Raji или RJ2.2.5 для экспериментов с химерным рецептором CD4 и клетки 3G8 10-2; Shen et al., Mol. Immunol. 26:959 (1989) для экспериментов с химерным рецептором CD16) центрифугировали и ресуспендировали в 50 мкл стерильного ⁵¹Cr-натрий хромата (1 mCi/мл, Dupont Wilmington, DE) в течение одного часа при 37^oC при умеренном перемешивании, затем промывали три раза в PBS. В каждую ячейку добавляли по 100 мкл меченых клеток, ресуспендированных в среде при 10⁵ клеток/мл. Клетки мишени Raji и RJ2.2.5 метили аналогичным образом, как и клетки HeLa. Микротитровальные планшеты откручивали при 750 • g в течениe 1 минуты и инкубировали в течение 4 часов при 37^oC. В конце периода инкубации клетки в каждой ячейке ресуспендировали путем осторожного пипетирования, образцы переносили для определения счета общего включения, и откручивали микротитровальные планшеты при 750 • g в течение 1 минуты. Отбирали аликвоты супернатанта по 100 мкл и просчитывали в сцинтиляционном счетчике гамма-излучения. Рассчитывали процент гибели для каждой фракции инфицированных клеток мишеней (обычно 50-90%), измеренный путем проточной цитометрии. Для инфицированных эффекторных клеток соотношение эффектор:мишень рассчитывали на процент инфицированных клеток (обычно 20-50% для экспериментов с химерным рецептором CD4 и > 70% для экспериментов с химерным рецептором CD16).

Мутагенез последовательности ζ in vitro
Для получения точечных мутаций по аминокислотным остаткам 11 или 15 последовательности ζ, были получены синтетические олигонуклеотидные праймеры, простирающиеся по направлению от
сайта BamHI трансмембранного домена ζ, и переводящие природный 11 остаток ζ Cys в Gly (C11G) или 15 остаток из Asp в Gly (D15G), или оба (C11G/D15G) и использованы в реакциях ПЦР для получения мутагенных фрагментов, которые были повторно введены в дикий тип конструкции CD4:ζ.
Для получения ζ делеций последовательность ζ ДНК амплифицировали при помощи ПЦР, используя синтетические олигонуклеотидные праймеры, сконструированные для создания стоп кодона (UAG) после остатков 50, 59 или 65. Праймеры, содержащие сайт расщепления, для фермента Notl заключали 5 или 6 остатков с 5' конца. Обычно в последовательности от CGC GGG CGG CCG СТА (ПОСЛ. N 11), где последние три остатка соответствовали стоп антикодону. Последовательности NotI и стоп антикодона следовали за 18 или более остатками, комплементарными желаемому 3' концу фрагмента. Полученные химеры были обозначены CD16:ζY51^*, CD16:ζ60^* и CD16:ζ66^*, соответственно. Сайт BamHI по направлению трансмембранного домена и сайт NotI использовали для получения фрагментов, которые обратно вводили в конструкцию дикого типа CD16:ζ. Мономерные химеры ζ получали путем высвобождения трансмембранной ζ и проксимальной мембранной внутриклеточной последовательностей путем гидролиза под действием BamHI и SacI конструкции Asp^- и Cys^- CD4:ζ, описанной выше и вводящей фрагмент в конструкцию CD16:ζE60^* и CD16:ζD66^*, соответственно.

Конструкция трехчастной химеры CD16:7:ζ(48-65) и CD16:7:ζ(48- 59)
Для получения конструкции GD16:ζD66^* кДНК последовательности ζ, соответствующая трансмембранному домену и 17 последующим остаткам цитоплазматического домена заместили на соответствующий трансмембранный и цитоплазматический домен, полученный из кДНК CD5 и CD7. Фрагменты CD5 и CD7 получали путем реакции ПЦР, используя прямые олигонуклеотиды, включая сайт рестрикционного расщепления BamHI и соответствующий области, как раз по направлению трансмембранного домена CD5 и CD7, соответственно, и после обратных олигонуклеотидов, перекрывающих последовательности CD5 и CD7, соответственно, и последовательности ζ, которая содержит сайт рестрикционного расщепления SacI.

CD5: ζ: CGC/GGG CTC GTT ATA GAG CTG GTT CTG GCG CTG CTT CTT CTG (ПОСЛ. N 12)
CD7: ζ: CGC GGG GAG CTC GTT ATA GAG CTG GTT TGC CGC CGA ATT CTT ATC CCG (ПОСЛ. N 13).

Продукты ПЦР CD5 и CD7 гидролизовали при помощи BamHI и SacI и лигировали к CD16:ζ60^*, гидролизованного BamHI и SacI, и замещали последовательность ζ из BamHI на SacI при помощи фрагмента CD7. Для получения конструкций CD16:CD5 и CD16:CD7 получали фрагменты CD5 и CD7 путем ПЦР, используя олигонуклеотид, содержащий сайт рестрикционного расщепления NotI и кодирующий стоп кодон (UAA) после остатка Gln416 и Ala193 CD5 и CD7, соответственно. Фрагменты ПЦР CD5 и CD7 гидролизовали при помощи BamHI и NotI и вводили в конструкцию CD16:ζAsp66^*.

Мутагенез N-концевых остатков в цитолитическом сигнал-передающем фрагменте ζ
Синтетические олигонуклеотидные праймеры, простирающиеся от сайта SacI вне фрагмента ζ, и переводящие остаток 48 из W Asn и Ser (N48S), остаток 50 из Leu в Ser (L50S) и остаток 51 из Tyr в Phe(Y51F), синтезировали и использовали в реакции ПЦР для получения фрагментов, которые заново внедряли в конструкцию дикого типа CD16:7:ζ(48-65).

Мутагенез С-концевых остатков в цитолитическом сигнал-передающем фрагменте ζ
Синтетические олигонуклеотидные праймеры, простирающиеся от сайта 3' NotI до стоп кодона и заменяющие природный остаток 60 из Glu на Gln (E60Q), остаток 61 из Glu на Gln (E61Q), остаток 62 из Tyr на Phe или Ser (Y62F или Y62S) и остаток 63 из Asp на Asn (D63N), были синтезированы и использованы ПЦР для получения фрагментов, которые субклонировали в конструкцию дикого типа CD16:ζD66^* из сайта BamHI в сайт NotI.

Конструкции химер CD16:7:ζ(35-65), CS16:7:ζ(71-104), CD16:7:ζ(104-137)
Трансмембранный фрагмент CD7, несущий сайты MluI и NotI по соединению между трансмембранным и внутриклеточным доменами получали путем ПЦР, используя олигонуклеотиды со следующими последовательностями: CGC GGG GCG GCC ACG CGT CCT CGC CAG CAC ACA (ПОСЛ. N 14). Полученный фрагмент ПЦР гидролизовали при помощи BamHI и NotI и повторно вводили в конструкцию CD16:7:ζ(48-65). Фрагмент ζ, кодирующий остатки 33-65, 71-104 и 104-137, получали путем реакции ПЦР, используя пары праймеров, содержащие сайты MluI по 5' концу прямых праймеров и стоп кодоны, следующие за свитами NotI по 5' концу обратных праймеров. В каждом случае сайты рестрикции заключали шесть остатков от 5' конца праймера для уверенного расщепления рестрикционным ферментом.

ζ 33: CGC GGG ACG CGT TTC AGC CGT CCT CGC CAG CAC ACA (ПОСЛ. N 15);
ζ 71: CGC GGG ACG CGT GAC CCT GAG ATG GGG GGA AAG (ПОСЛ. N 16); и
ζ 104: CGC GGG ACG CGT ATT GGG ATG AAA GGC GAG CGC (ПОСЛ. N 17).

Конструкция мутантов F_cR γIIA с делецией
Карбокси концевые мутанты F_cRIIA с делецией конструировали при помощи ПЦР таким же образом, как конструкции полной длины, переводя последовательности, кодирующие тирозин по положениям 282 и 298 в стоп кодоны (TAA). N-концевые делеции получали путем амплифицирования фрагментов при помощи ПЦР, кодирующих последовательно меньше во внутриклеточном домене, используя олигонуклеотиды, которые позволяют полученным фрагментам встраиваться между MluI и NotI сайтами рестрикции в ранее сконструированную плазмиду экспрессии, кодирующую внеклеточный домен CD16, слитый с трансмембранным доменом CD7, ранее оканчивающийся в сайте MluI, и соединении между трансмембранным и внутриклеточным доменом.

ДРУГИЕ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ
Вышеописанные примеры показывают, что агрегация ζ,η и γ химер достаточна для инициации цитолитического эффекторного клеточного ответа у T клеток. Известный ряд экспрессии ζ,η и γ, который включает T лимфоциты, природные киллерные клетки, базофильные гранулоциты, макрофаги и тучные клетки предполагает, что фрагменты консервативной последовательности могут взаимодействовать с сенсорным аппаратом, общим для клеток гематопоэтической природы и, что важный компонент защиты хозяина в иммунной системе может быть опосредован путем феномена агрегации.

Способность к цитолитическому ответу и отсутствие способности у клетки мишени, несущей рецепторы МНС II класса показывает, что химеры на основании ζ,η и γ образуют основу для генетического вмешательства в СПИД посредством приспособительной иммунотерапии. Широкое распространение эндогенных ζ и γ и доказательство того, что F_c-рецепторы, связанные с γ, опосредуют цитотоксичность у различных типов клеток (Fanger et al., Immunol. Today 10:92-99 (1989)), позволяют разнообразным клеткам быть предназначенным для этой цели. Например, нейтрофильные гранулоциты, которые имеют очень короткое время жизни (≈ 4 часа) в циркуляторном русле и являются сильно цитотоксичными, являются привлекательными клетками мишенями для экспрессии химер. Инфицирование нейтрофилов ВИЧ, по-видимому, не приводит к выходу вируса, и обилие этих клеток (наиболее преобладающих из лейкоцитов) должно усиливать защиту хозяина. Другой привлекательной возможностью для клеток хозяев являются зрелые T клетки, популяция в настоящее время доступная для ретровирусной инженерии (Rosenberg, Sci. Am. 262:62-69 (1990)). При помощи рекомбинантного ИЛ-2 популяцию T клеток можно сравнительно легко размножать в культуре, и размноженная популяция обычно имеет ограниченную продолжительность жизни при повторном слиянии (Rosenberg et al., N.Engl. Med. 323:570-578 (1990)).

В подходящих условиях распознавание ВИЧ клетками, экспрессирующими химеры СВ4, должно также обеспечивать митогенный стимул, позволяющий возможность того, чтобы вооруженная популяция клеток смогла динамически отвечать на вирусоносительство. Хотя здесь обращается внимание на поведение белков слияния в цитолитических T лимфоцитах, экспрессия химер в лимфоцитах-хелперах может обеспечивать источник цитокинов, которые могут противостоять сокращению набора хелперных клеток при СПИДе. Недавно описанные несколько схем для конструирования устойчивости к инфекции на стадии, отличающейся от стадии проникновения вируса (Friedman et al., Nature 335:452-454 (1988); Green et al. , Cell 58:215-223 (1989); Malim et al., Cell 58:205-214 (1989); Trono et al. , Cell 59:113-120 (1989); Buonocore et al., Nature 345:625-628 (1990)) предполагают, что клетки, несущие химеры CD4 смогут быть сконструированы для противостояния продукции вируса путем экспрессии подходящих агентов, обладающих внутриклеточным сайтом действия.

Способность передавать сигналы на T лимфоциты посредством автономных химер также обеспечивает способность для регуляции ретровирусно-сконструированных лимфоцитов in vivo. Стимулы перекрестного связывания, опосредованные, например, путем конструирования специфических антител IgM для удаления доменов, связывающих комплемент, могут позволить для таких лимфоцитов увеличиться in situ, тогда как обработка близкими специфическими антителами IgG (например, распознающими вариации аминокислот, сконструированных в цепи химеры), сможет специфически обеднить сконструированную популяцию. Дополнительно, анти-CD4 антитела IgM не требуют дополнительного перекрестного связывания для мобилизации кальция в клетках Jurkat, экспрессирующих химеры CD4:ζ. Способность регулировать популяцию клеток без обращения за помощью к экстракорпоральной амплификации, может существенно расширить область и эффективность настоящего использования, предлагаемую для генноинженерных T клеток.

Для создания других химер, содержащих ζ,η и γ внутриклеточные последовательности, кДНК или геномные последовательности, кодирующие внутриклеточный домен рецептора, могут быть окончены сайтом рестрикции, введенным по положению, непосредственно предшествующему выбранному трансмембранному домену. Затем к ζ,η и γ последовательностям может быть присоединен фрагмент терминации внеклеточного домена в сайте рестрикции. Обычными внеклеточными доменами могут быть производные от рецепторов, которые распознают комплемент, углеводы, вирусные белки или индуцируемые ими белки. Аналогично. К последовательностям ζ,η и γ могут быть присоединены лиганды или рецепторы, экспрессируемые патогенами или опухолевыми клетками, для нацеливания иммунного ответа против клеток, несущих 4 рецепторы, распознающие те лиганды.

Несмотря на то, что изобретение описано в связи с его специфическими осуществлениями, будет понятно, что оно способно к дальнейшим модификациям, и это применение предназначено для охвата вариантов, использования или приспособления изобретения и, включающее такие отклонения от настоящего описания, какие приходят в технике, к которым имеет отношение изобретение, и какие могут быть применимы к существенным свойствам, установленным выше, как следует из объема прилагаемой формулы изобретения.

Изобретение относится к области медицинской биотехнологии. Описывается способ направления клеточного ответа у млекопитающих путем экспрессии в клетке млекопитающего двух химерных рецепторов, которые запускают специфическое распознавание и разрушение инифицирующего агента, клетки, инифицированной инфицирующим агентом, опухолевой или раковой клетки, или аутоиммуногенерированной клетки. Один из экспрессируемых химерных рецепторов включает внеклеточный белок, который способен к специфическому распознаванию и связыванию клетки-мишени или агента, инифицирующего мишень, и внутриклеточную или трансмембранную часть, которая способна к передаче сигнала на терапевтическую клетку для разрушения связанной с рецептором клетки-мишени или связанного с рецептором агента, инифицирующего мишень. Второй химерный рецептор включает внеклеточную часть, которая способна к специфическому распознаванию и связыванию клетки-мишени или агента, инифицирующего клетку, и внутриклеточную часть, которая является производной от CD28. Описываются также пары применимых химерных рецепторов, клетки, которые экспрессируют химерные рецепторы, и ДНК, кодирующего химерные рецепторы. Техническим результатом изобретения является расширение арсенала средств против опухолевых и инфекционных заболеваний. 7 с. и 23 з.п.ф-лы, 19 ил.

1. Способ воздействия на направленность клеточного иммунного ответа у млекопитающего, который включает введение млекопитающему эффективного количества терапевтических клеток, экспрессирующих, по крайней мере, два мембранно-связанных белковых химерных рецептора, причем один из указанных рецепторов, включает внеклеточную часть, которая способна к специфическому распознаванию и связыванию указанной клетки-мишени или указанного инфекционного агента мишени и внутриклеточную или трансмембранную часть, которая способна к передаче сигнала для указанной терапевтической клетки для разрушения связанной с рецептором клетки-мишени или связанного с рецептором инфекционного агента мишени; и второй из указанных рецепторов, включает внеклеточную часть, которая способна к специфическому распознаванию и связыванию указанной клетки мишени или указанного инфекционного агента-мишени и внутриклеточную часть, производную антигена CD28. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанная клетка-мишень является клеткой-хозяином, инфицированной инфекционным агентом, опухолевой или канцерогенной клеткой, или аутоиммунно-генерированной клеткой. 3. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанный клеточный ответ является независимым от антигена главного комплекса гистсовместимости МНС. 4. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанная внутриклеточная или трансмембранная часть является сигнал передающей частью рецепторного белка T-клетки, рецепторного белка B-клетки или рецепторного белка Fc, или ее функциональным производным. 5. Способ по п.1, отличающийся тем, что после связывания указанной внеклеточной части с указанным агентом или указанной клеткой, трансмембранная часть олигомеризуется с цитолитическим сигнал-передающим белком указанной терапевтической клетки, приводя к разрушению рецептор-связанной клетки или агента. 6. Способ по п.4, отличающийся тем, что указанный внутриклеточный или трансмембранный домен произведен от T-клеточного рецептора ξ,η, дельта CD3 или гамма T3 белка; γ белка Fc рецептора; или белка mb1 или B29 рецептора B клетки. 7. Способ по п. 6, отличающийся тем, что указанный химерный рецептор включает аминокислотные остатки 421-532 SEQ ID NO:6 или ее функциональное цитолитическое передающее сигнал производное, или аминокислотные остатки 423-455, 438-455, 461-494, 494-528 SEQ ID NO:6 аминокислотные остатки 400-420 SEQ ID NO:6, аминокислотные остатки 421-575 SEQ ID NO:4 или ее функциональное цитолитическое передающее сигнал производное, аминокислотные остатки 423-455, 438-455, 461-494, 494-528 SEQ ID NO:4, или аминокислотные остатки 400-420 SEQ ID NO:4, или аминокислотные остатки 421-462 SEQ ID NO:5 или ее функциональное цитолитическое передающее сигнал производное, или аминокислотные остатки 402-419 SEQ ID NO:5; или аминокислотные остатки Tyr282-Tyr298, представленные на фиг.15А, или аминокислотные остатки 132-171 фиг.16 (SEQ ID NO: 24) или аминокислотные остатки 140-182 фиг.17 (SEQ ID NO:25) или аминокислотные остатки 162-220 фиг.18 (SEQ ID NO:26) или аминокислотные остатки 183-228 фиг.19 (SEQ ID NO:27). 8. Способ по п. 4, отличающийся тем, что указанный белок рецептора Fc является FcγRIII человека, FcγRIIγA человека или FCRIIγC человека. 9. Способ по п.4, отличающийся тем, что указанные терапевтические клетки выбираются из группы, состоящей из или T лимфоцитов, или цитотоксических T лимфоцитов, или природных киллерных клеток, или нейтрофилов или гранулоцитов, или макрофагов, или тучных клеток, или клеток HeLa, или эмбриональных стволовых клеток (ES). 10. Способ по п.4, отличающийся тем, что указанный инфекционный агент-мишень является вирусом иммунодефицита. 11. Способ по п.4, отличающийся тем, что указанная внеклеточная часть включает часть антигена CD4, связывающую оболочку ВИЧ, или ее функциональное производное антигена CD4, связывающее оболочку ВИЧ. 12. Способ по п.4, отличающийся тем, что указанная часть антигена CD4, связывающая оболочку ВИЧ, содержит пептид, кодируемый нуклеотидами 1-369 SEQ ID NO:1. 13. Способ по п. 4, отличающийся тем, что указанные терапевтические клетки разрушают связанную с рецептором клетку мишень или инфекционный агент-мишень путем цитолиза. 14. Терапевтическая клетка, представляющая собой лимфоцит, макрофаг, химерную клетку, гранулоцит, тучную клетку или нейтрофил, способная экспрессировать, по крайней мере, два белковых мембрано-связанных химерных рецептора, причем один из указанных рецепторов содержит внеклеточную часть, которая способна специфически распознавать и связывать клетку-мишень или инфекционный агент-мишень и внутриклеточную или трансмембранную часть, производную от рецептора T клетки, рецептора B клетки или Fc рецептора, которая способна передавать сигнал указанной клетке для разрушения связанной с рецептором клетки-мишени или связанного с рецептором инфекционного агента-мишени; и второй из указанных рецепторов, содержит внеклеточную часть, которая способна специфически распознавать и связывать указанную клетку-мишень или указанный инфекционный агент-мишень и внутриклеточную часть, производную антигена CD28. 15. Клетка по п.14, отличающаяся тем, что указанная клетка-мишень является клеткой-хозяином, инфицированной инфекционным агентом, раковой или канцерогенной клеткой или аутоиммунно-генерированной клеткой. 16. Клетка по п.14, отличающаяся тем, что указанное связывание является независимым от антигена МНС. 17. Клетка по п.14, отличающаяся тем, что указанный внутриклеточный или трансмембранный домен произведен от или ξ,η, CD3 дельта T-клеточного рецептора или гамма T3 белка; γ белка Fc рецептора; или mb1 или B29 белка рецептора B клетки. 18. Клетка по п.17, отличающаяся тем, что указанный химерный рецептор включает аминокислотные остатки 421-532 SEQ ID NO:6 или ее функциональное цитолитическое передающее сигнал производное, или аминокислотные остатки 423-455, 438-455, 461-494, 494-528 SEQ ID NO:6, или аминокислотные остатки 400-420 SEQ ID NO:6, или аминокислотные остатки 421-575 SEQ ID NO:4 или ее функциональное цитолитическое передающее сигнал производное, или аминокислотные остатки 423-455, 438-455, 461-494, 494-528 SEQ ID NO:4, 400-420 SEQ ID NO: 4, 421-462 SEQ ID NO:5 или ее функциональное цитолитическое передающее сигнал производное, или аминокислотные остатки 402-419 SEQ ID NO:5, или аминокислотные остатки Tyr282-Tyr298 представленные на фиг.15А, или аминокислотные остатки 132-171 фиг. 16 (SEQ ID NO:24), или аминокислотные остатки 140-182 фиг. 17 (SEQ ID NO:25), или аминокислотные остатки 162-220 фиг.18 (SEQ ID NO:26), или аминокислотные остатки 183-228 фиг.19 (SEQ ID NO:27). 19. Клетка по п.14, отличающаяся тем, что указанный белок рецептора Fc является FcγRIII человека, FCRIIγA человека или FCRIIγC человека. 20. Клетка по п.14, отличающийся тем, что указанная внеклеточная часть содержит лиганд-связывающую часть рецептора, рецептор-связывающую часть лиганда, антигенсвязывающую часть антитела или их функциональное производное. 21. Клетка по п. 20, отличающаяся тем, что указанный инфекционный агент-мишень является вирусом иммунодефицита или указанная клетка мишень является клеткой-хозяином, инфицированной вирусом иммунодефицита. 22. Клетка по п.21, отличающаяся тем, что указанная внеклеточная часть включает часть антигена CD4, связывающую оболочку ВИЧ, или ее функциональное производное. 23. Клетка по п.22, отличающаяся тем, что указанная часть антигена CD4, связывающая оболочку ВИЧ, включает пептид, кодируемый нуклеотидами 1-369 SEQ ID NO:1. 24. Клетка по п. 14, отличающаяся тем, что указанная клетка разрушает связанную с рецептором клетку-мишень или инфекционный агент-мишень путем цитолиза. 25. Терапевтическая клетка, представляющая собой лимфоцит, макрофаг, химерную клетку, гранулоцит, тучную клетку или нейтрофил, способная экспрессировать, по крайней мере, два белковых мембрано-связанных химерных рецептора, причем один из указанных рецепторов содержит внеклеточную часть, которая способна специфически распознавать и связывать клетку-мишень или инфекционный агент-мишень и внутриклеточную или трансмембранную часть, производную CD3 рецептора T клетки, "зета" или "эта" полипептида, рецептора B клетки или Fc рецептора; и второй из указанных рецепторов содержит внеклеточную часть, которая способна специфически распознавать и связывать указанную клетку-мишень или указанный инфекционный агент-мишень и внутриклеточную часть, производную антигена CD28. 26. Клетка по пп. 14 или 25, отличающаяся тем, что указанный химерный рецептор включает или внеклеточную часть антигенов CD16, CD7 или CD5 или трансмембранную часть антигенов CD5 или CD7 или внутриклеточную часть антигена CD5. 27. Пара белковых мембрано-связанных химерных рецепторов, причем один из указанных рецепторов содержит внеклеточную часть, которая способна специфически распознавать и связывать клетку-мишень или инфекционный агент-мишень и внутриклеточную или трансмембранную часть, производную рецептора T клетки, рецептора B клетки или белка Fc рецептора, который способен передавать сигнал указанной клетке для разрушения рецептор-связанной клетки-мишени или рецептор-связанного инфекционного агента-мишени; и второй из указанных рецепторов содержит внеклеточную часть, которая способна специфически распознавать и связывать указанную клетку-мишень или указанный инфекционный агент-мишень и внутриклеточную часть, производную антигена CD28. 28. Пара белковых мембрано-связанных химерных рецепторов, причем один из указанных рецепторов содержит внеклеточную часть, которая способна специфически распознавать и связывать клетку-мишень или инфекционный агент-мишень и внутриклеточную или трансмембранную часть, производную CD3 рецептора T клетки, "зета" или "эта" полипептида, рецептора B клетки или Fc рецептора; и второй из указанных рецепторов содержит внеклеточную часть, которая способна специфически распознавать и связывать указанную клетку-мишень или указанный инфекционный агент-мишень и внутриклеточную часть, производную антигена CD28. 29. Пара молекул ДНК, каждая из которых кодирует белковый мембрано-связанный химерный рецептор, причем один из указанных рецепторов содержит внеклеточную часть, которая способна специфически распознавать и связывать клетку-мишень или инфекционный агент-мишень и внутриклеточную или трансмембранную часть, производную рецептора T клетки, рецептора B клетки или белка Fc рецептора, который способен передавать сигнал указанной клетке для разрушения рецептор-связанной клетки-мишени или рецептор-связанного инфекционного агента-мишени; и второй из указанных рецепторов содержит внеклеточную часть, которая способна специфически распознавать и связывать указанную клетку-мишень или указанный инфекционный агент-мишень и внутриклеточную часть, производную антигена CD28. 30. Пара молекул ДНК, каждая из которых кодирует белковый мембрано-связанный химерный рецептор, причем один из указанных рецепторов содержит внеклеточную часть, которая способна специфически распознавать и связывать клетку-мишень или инфекционный агент-мишень и внутриклеточную или трансмембранную часть, производную CD3 рецептора T клетки, "зета" или "эта" полипептида, рецептора B клетки или Fc рецептора; и второй из указанных рецепторов содержит внеклеточную часть, которая способна специфически распознавать и связывать указанную клетку-мишень или указанный инфекционный агент-мишень и внутриклеточную часть, производную антигена CD28.