Способ количественного определения @ , @ -метил- @ -(3,4-диоксифенил)-аланина Советский патент 1985 года по МПК G01N21/64 

Изобретение относится к аналитической химии, а именно к способам ко личественного люминесцентного определения Ь,оС-метил- 3-(3,4-диоксифенил)-аланина (метил-ДОФА). В СССР препарат импортируется из Венгрии и Югославии под названием Допегит и Альдомет соответственно и широко используется как эффективное гипотензивное средство, которое вызывает у больных меньше побочных явлений по сравнению с другими лекарственными веществами. В настоящее время в медицинской практике применяется много способов количественного и качественного опре деления катехоламинов и родственных им соединений - диоксифенилаланина и дофамина. Известен способ количественного определения диоксифенилаланина, осно ванный на переведении его во флуорес цирующий триоксииндол, Триоксииндоль ный метод применяется в различных модификациях,причем все они включаютстадию отделения с помощью адсорбента, элюацию, обработку окислителем для образования аминохромов, добавление щелочного раствора аскорбиново кислоты и измерение флуоресценции образовавшегося триоксииндола. Большое число опубликованных модификаций метода говорит о том, что само определение на границах чувствительности метода зависит от многих факторов и от наличия примесей Q} . К недостаткам этого способа можно отнести длительность выполнения, возможность наложения спектров люминесценции про дуктов окисления адреналина и норадреналина, что делает результаты анализа плохо воспроизводимыми. Наиболее близким к изобретению яв ляется способ количественного определения метйл-ДОФА в порции мочи. Ме тод предусматривает предварительное вьщеление метил-ДОФА на окиси алюминия, элюаЦию его с колонки. Б элюате проводят определение метил-ДОФА. Окисление с образованием флуоресциру ющих продуктов проводится следующим образом. Уксуснокислый элюат доводят до рН 4,2 каплями 1 н аммиака, затем отбирают по 1,0 мл в контрольные „ и опытные пробы, в которые предварительно помещают по 1,0 мп 0,1 М фосфатного буфера с рН 4,2. Затем остав шееся количество элюата доводят до рН 6,2, учитьшая количество аммиака, пошедшего на титрование, и во две пробы отбирают количество раствора, соответствующее 1,0 мп элюата. В эти пробы предварительно помещают по 1,0 мл 0,1 М фосфатного буфера с рН 6,2. Солянокислый элюат также доводят 1 н аммиаком до рН 6,2 в мерных пробирках, затем добавляют воды до 7,0 мл. Из этих растворов отбирают в опытную и контрольную пробы по 1,0 мл и предварительно в эти пробирки помещают по 1,0 мл 0,1 М фосфатного буфера с рН 6,2. Три полученные опытные пробы уксуснокислого элюата с рН 6,2 и 4,2 и солянокислого элюата окисляют 0,1 мл 0,25% феррицианида калия в течение 4 мин (контрольные пробы не окисляют) и затем добавляют как.в опытную, так и в контрольные пробы 1,0 мл 0,2% раствора аскорбиновой кислоты, свежеприготовленного в 5 н щелочи. Через 3 мин все пробы доводят,водой до 10 мл, а в контрольные пробы добавляют по 0,1 .мл 25%-ного феррицианида калия. Для большей стабилизации флуоресценции опытНые и контрольные пробы охлаждают на льду в период измерения флуоресценции. Измерение флуоресценции производят на спектрофлуориметре, используя два набора светофильтров (с диапазоном пропускания от 360 до 600 нм), при двух значениях рН (4,2;. 6,2). Путем решения трех уравнений с тремя неизвестными рассчитывают содержание ДОФА и катехоламинов. Путем суммирования содержания ДОФА в уксусно-кислом и соляно-кислом э.люатах рассчитывают его общее .содержание 2 . К недостаткам метода можно отнести трудоемкость, наличие множества операций, необходимость работы в широкой области спектра (360-600 нм), отсутствие селективности. Спектральные характеристики продукта окисления ДОФА близки к спектральным свойствам адренолютина и норадренолютина, и, следовательно, возмо.жно наложение спектров люминесценции продуктов их окисления. Это обуславливает плохую воспроизводимость результатов и недостаточную точность. Цель изобретения - упрощение способа определения метил-ДОФА, повышение экспрессности, воспроизводимости и точности результатов. Поставленная цель достигается тем что согласно способу количественного определения L ,с ;-метил-/3-(3,4-диоксифенил)-аланина вклю шющему приготовление анализируемой пробы, взаимодей ствие ее с химическим реагентом и измерение спектра, анализируемую про бу подвергают взаимодействию с раствором хлорида тербия в среде вода изопропанол в соотношении 1:10 при рН 8,0-8,5 в присутствии борогидрида натрия с последующим измерением интенсивности полос спектра сенсибилизированной люминесценции тербия, по которой определяют концентрацию исследуемого вещества. Отличиями в предлагаемом способе по сравнению с известным:, является взаимодействие анализируемой пробы со стандартным раствором хлори/да тербия в присутствир боротидрида нат рия при рИ 8,0-8,5 и регистрация сенсибилизированной люминесценции тербия в его соединении с метил-ДОФА обусловленной поглоп1;ением света органической частью молекулы и передачей энергии возбужденного состоятся ионам тербия, приводит к тому, чГо . снижается предел обнаружения по срав нению с известным, значительно упрощается анализ и сокращается время ег вьполнения. Поскольку в щелочной среде возмож но окисление продуктов реакции кислородом воздуха (аналогично тому, как это наблюдается в реакциях с 1,2-диоксибензол-3,5 дисульфо1шслотой), в предлагаемом способе в реакционную смесь добавляется борогидрид натрия. В известном способе в качестве растворителя используется вода, в предлагаемом - изопропанол. Интенсивность люминесценции тербия в комплексах с метил-ДОФА в изопропанольных растворах на два порядка выше, чем в водных. Способ определения осуществляется следующим образом. I К анализируемому раствору добавляют стандартный раствор хлорида тербия, создают в растворе щелочную сре,ду (рЫ 8,0-8,5) с помощью борогидрида натрия, регистрируют интенсивность люминесценции тербия при Л 546 нм. Содержание метил-ДОФА в пробе определяют либо по калибровочному графику, либо по методу добавок. Наименьшее :обнаруживаемое количество метил-ДОФА- 8314 0,001 мкг/мп. При определении метилДОФА в биологических жидкостях и тканях, отделение его от катехоламинов осуществляется хроматографическим способом. Пример. Количественное определение метил-ДОФА в лекарственном препарате Допегит. Одну таблетку препарата Допегит тщательно измельчают, растворяют в дистиллированной воде при подкислении соляной кислотой до рН 4,0-5,0, раствор переносят в мерную колбу на 250 мл. Раствор отфильтровьшают и в фильтрате определяют содержание метил-ДОФА. Для получения стандартногораствора хлорида тербия (1 мг/мл) точную навеску оксида тербия растворяют в соляной кислоте, выпаривают до получения влажных солей и разбавляют дистиллированной водой. В пробирку помещают 0,1 мл исследуемого раствора с содержанием метилДОФА 0,1-0,01 мкг/мл, пр11пивают 0,2 мц стандартного раствора хлорида тербия (содержащего 1 мг/мл TbCl,), добавляют 0,7 мл дистиллированной воды и 9 мл изопропанола; после этого добавляют 1 мг борогидрида натрия для создания необходимого рН раство.ра и предотвращения окисления растворов комплексов. Спектры люминесценции регистрируют с помощью спектрографа ИСП-51 с ФЭП-1 (либо другого спектрофлуориметра) npHA qj, 546 нм. Люминесценцию возбуждают ртутно-кварцевфй лампой СВД-120А со сфетофильтром УФС-2. Растворы комплексов устойчивы во времени и сохраняют люминесцентные свойства в течение получаса. Содержание метилДОФА определяют по калибровочноьгу графику, а также по методу добавок, учитывая величину пиков люминесценции пробы и пробы с добавками. При малых содержаниях метил-ДОФА в пробе необходимо регистрировать интенсивность люминесценции холостого опыта и вычитать ее из интенсивности люминесценции пробы. Точность и достоверность способа были проверены в лабораторных условиях, путем статической обработки результатов анализа препарата Допегит. Результаты определения метил-ДОФА в препарате До-, пегит (, ,28) представлены в таблице.

0,001 ,0,000980,001+0,000039.4,0

0,005 0,00496О,OOStO,000159 3,2

0,015-0,015080,015tO,000417 3,6

0,030 0,02960,03010,00040 1,35

0,050 0,049700,050+0,00051 1,42

0,080 0,07980,080±0,00075 1,26

0.600- 0,60300,600±0,00068 1,43

Предложенный способ обладает следующими преимуществами по сравнению с прототипом:

сокращается время проведения анализа и упрощение его за счет исключения множества операций, необходимых для переведения метил-ДОФА в флуоресцирующие оксииндолы; измерение

интенсивности люминесценции проводится в видимой области спектра при одной длине волны; повышение точности и воспроизводимости определения за счет исключения наложения спектров

люминесценции продуктов окисления других катехоламинов.

СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕЩШ Ь,о6-метил-/3-