Способ получения термически устойчивой бактериальной @ -амилазы Советский патент 1987 года по МПК C12N9/32 C12N9/32 C12R1/10 

1

Изобретение относится к способам получения ферментного препарата |,-амила зы иможет быть использовано в промьшшенностй моющих средств и при конверсии крахмала в водорастворимые углеводы в химической, ферментной или пищевой промьшшенностй.

Цель изобретения - повьш1ение активности it-амилазы,

Способ заключается в том,-что в качестве продуцента термостабильной 0 -амилазы используют штамм Bacillus licheniformis АТСС 39326, который культивируют в питательной ер де, содержащей в качестве источника углерода предпочтительно лактозу в условиях рН среды 5,5-8,0 при аэрировании и перемешивании. Целевой пр . дукт выделяют известными методами.

Штамм Bacillus licheniformis хранится в Американской коллекции типовых культур микроорганизмов под номром AT СС 39326,

Испытываемые природные источники

ttf.-амилазы высевают на среду, содержащую крахмал, цитрат, фосфат аммония

и Mg

fi

и небольшие количества Са и выращивают при 41 С, Культуры исследуют на .наличие осветленных зон вокруг колоний на агаре. Культуры, характеризующиеся большими зонами, распыляют на большие пластины с крах мало-агаровой средой, содержащей агаровую среду с 0,5% гелеобразного крахмала Линтнера, 0,5% дрожжевого экстракта, 0,2% цитрата натрия, 0,5% фосфата аммония, 0,5% сульфата магния и 0,008% Н,,0, 1,5% агара при рН 7, и выращивают при 40 С в течение 24-48 ч. Снова собирают культуры, продуцирующие большие осветленные зоны и сравнива от с контрольной культурой Б,licheniformis,

Культуры, выращенные в шейкерах в течение 5-8 сут, испытывают на аль фа-эмилазную активность в диапазоне 150 разжижений/мл. Затем культуры, проявляющие адекватную активность, отбирают для проверки амилазной активности при 87 с,

Полученный , штамм имеет типичные характеристики-В,licheniformis, т,е является грамположительным, спорооб- разующим микроорганизмом, способным к анаэробному росту и использующим пропинат аэробно. Особенностью этого организма является то, что его et.-амилаза не требует экзогенного

ь

3442472

Са для активности при 87 С, а также его необычайно высокий уровень активности фермента при этой температуре.

Сравнение коммерческого фермента.

Клинтона и предлагаемого при 80 и 95 С показывает, что для «получения

5

0

5

желаемого уровня декстринизации за определенное время требуется меньшее количество фермента.

Ферментацию обычно осуществляют в течение 2-6 дней при 25 - 55 С, с использованием обычных усвояемых источников углерода, азота и других питательных веществ. Подходящими источниками углерода являются углеводы (лактоза, глюкоза и крахмал) или ве-. щества, содержащие углеводы, такие как соя, кукурузная мука и т,п, и их смеси. Количество углевода можно значительно изменять 1 - 25 мас,%/об, предпочтительно от 5 - 15 мас ,%/об. Наиболее предпочтительным источником углерода является лактоза, поскольку в этом случае достигаются наилучшие показатели ферментной активности. Содержание лактозы в питательной среде 1 - 20 мае,7,/об, лред0 почтителен диапазон 5-15 мас,%/об. Лактозу можно использовать либо в качестве единственного источника углерода, либо в комплексе с другими источниками, такими как сыворотка и

5 соевая мука, при этом концентрация последних должна составлять не менее 5 мас,%/об.

Источник азота может быть органическим или неорганическим, например

0 растворимые нитраты или соли аммония. Источниками органического азота могут быть дрожжевой экстракт, кукурузный экстракт, мука земляного ореха и т,п,

5 Микроорганизм выращивают в питательной среде в аэробных условиях, которые обеспечивают путем аэрирования бродильных сосудов, обычно при скорости один объем воздуха на объем

0 среды.

Фермент выделяют из реакционной среды после достижения требуемых уровней ферментной активности изве- стньми способами, например осаждени5 ем фермента с использованием известных осадителей, таких как сульфат натрия или несмешиваемые с водой органические растворители ацетон или этанол, В результате центрифугирова313А4247

ния или фильтрования осадка с последующей его сушкой получают очищенный твердый фермент.

Способ осуществляют следующим образом.

Bacillus licheniformis АТСС 39326 сеют штрихом на пластинку крахмального агара Difco и выращивают при 40 С в течение 18 ч,

Суспензией клеток инокулируют бульон следующего состава, %: дрожжевой экстракт 0,5; триптон 0,5; , 0,1; D-глюкоза 0,1. 350 мл на колбу емкостью I л. Культивируют при 40 с в течение 1-2 дней при скорости вращения 200 об/мин, на встря- хивателе Брансвик G-50 (2 -орбита).

Все содержимое колбы используют в качестве прививочного материала в объеме 3150 мл среды, имеющей сле. дующий состав, %: лактоза 10; 1,4 (лактозу и обрабатывают в автоклаве отдельно от других компонентов) ; 0,6; (NH) SO 0,6; цитрат натрия 0,3; соевая мука 3,0; CaCL 0,05; 1 ,0 мл МАгиДР бООО - пеногаситель. Исходное значение рН 6,8 - 7,0.

Среду стерилизуют в автоклаве в течение 60 мин при 121 С, общее количество 6,8 кг.

Для оптимального получения . -амилазы рН культуральной среды должен быть ниже 8,0, но не ниже 5,5.

Для контроля за возможным вспениванием при размножении предусмотрен противовспениватель МагиДР 6000.

25 зы).Встряхивают содержимое, выливают его в калиброванную квадратную трубку (13 мм) и-сравнивают со стандартным окрашенным диском в компараторе Гел- лиже. 1 мл вносят в йодный раствор

Условия ферментации: скорость пе 40 для того, чтобы можно было более точремешивания 600 об/мин, температура культивирования 40 С, аэрация среды 1 л об/об, воздуха, рН через 72 ч 6,5 - 7,0.

Измерение активности фермента -амилазы осуществляют с помощью . стандартной технологии. Один из таких методов представляет собой видоизмененный метод Вохлегермута, при котором активность определяют во времени вываривания, необходимого для изменения окраски, характеризующего определенную стадию декстринизации крахмала. Метод тарируют так, что концентрацию амилазы можно рассчитать непосредственно в ликфонах на грамм.

Аналитическое определение содержания «(.-амилазы в ликфонах производят следующим образом.

но определить точку кипения. При приблизительном достижении времени точки кипения пробы необходимо извлекать через интервалы времени, равные 45 0,1 мин (6-12 с) .

Фиксируют, время и разбавление по завершении реакции и рассчитывают активность в ликфонах на грамм или 50 1 мл.

Расчет ферментативной активности производится по следующей формуле:

55

Ликфоны (или мл)

X растворение

Фактический вес (или объем в мл) пробы, X - время докстринизации, мин.

Готовят пробу раствора с использованием в качестве растворителя и разбавителя 0,025 М раствора CaCl. так, что для 5 мл готового разбавленного раствора время декстринизации составляет 10 мин. Если приблизительная активность ферментного препарата не известна, надлежащий размер пробы

0 и/или степень разбавления необходимо определить экспериментальньм путем. Вносят 5,0 мл разбавленного йодного раствора в пробирки диаметром 13 мм и высотой 200 мм, которые помё-

5 щают в водяную баню с температурой

Q

30 с. Вводят 10 мл крахмала Линтнера в пробирку диаметром 23 мм и высотой 200 мм и помещают ее в водяную баню с температурой 30 С.

0 25 мл разбавленного раствора о -амилазы вносят в пробирки 23 х X 200 мм и ставят их в водяную баню с температурой 30 С. 5 мл разбавленной пробы неизвестного фермента до5 бавляют в 10 мл раствора крахмала и после добавления половины неизвестного раствора ai -амилазы пускают се - кундомер и затем вливают оставшуюся половину раствора из пипетки.

0 В соответствующие интервалы времени в пробирку, в которой находится отрегулированный разбавленный йодный раствор, добавляют 1 мл гидролизую- ций смеси (крахмал, раствор о -амила5 зы).Встряхивают содержимое, выливают его в калиброванную квадратную трубку (13 мм) и-сравнивают со стандартным окрашенным диском в компараторе Гел- лиже. 1 мл вносят в йодный раствор

0 для того, чтобы можно было более точно определить точку кипения. При приблизительном достижении времени точки кипения пробы необходимо извлекать через интервалы времени, равные 45 0,1 мин (6-12 с) .

Фиксируют, время и разбавление по завершении реакции и рассчитывают активность в ликфонах на грамм или 50 1 мл.

Расчет ферментативной активности производится по следующей формуле:

Ликфоны (или мл)

X растворение

Фактический вес (или объем в мл) пробы, X - время докстринизации, мин.

Растворы, используемые при описанном анализе, получают следующим образом,

Раствор крахмала. Растворимый крахмал Линтнера (Юг) смешивают с 35 мл дистиллированной воды в колбе, которую затем нагревают до кипения и выдерживают в течение 5 мин при температуре кипения с постоянным перемешиванием. После этого раствор охлаждают до комнатной температуры и добавляют 125 мл ацетатного буферного раствора и достаточное количество воды, доводят общий объем колбы до 500 мл. Добавляют 1 мл толуола. Стабильность этого раствора проверяют с помощью стандартной пробы с. -амилазы известной концентрации.

Ацетатный буферный раствор. Взвешивают I моль ацетата натрия (82,Ог) и растворяют его в 800 мл воды. Доводят рН до 6,2-0, с помощь уксусной кислоты и разбавляют содержимое до 1 л. При приготовлении I л крахмального субстрата требуется 20 мл раствора.

Разбавительный раствор хлористого кальция 0,025 М - растворяют 11,1 г химически чистого безводного хлористого кальция в 4 л воды.

Буферный раствор. Растворяют 25,3 г гранул гидроокиси натрия и 340 г первичного кислого фосфата калия в дистиллированной воде и доводят содержимое в мерной колбе до 2 л При достижении буферным раствором комнатной температуры доводят содержимое до объема (рН 6,2+0,1).

Основной йодный раствор. Растворяют 5,50 г химически чистых кристаллов йода и 11,0 -г KI в и,0 и разбавляют содержимое до 250 мл. Хранят раствор в темной бутыли.

Разбавленный йодный раствор, Раст- 45 пользуют лактозу в концентрации 5 - воряют 20,0 г KI в Н20, добавляют 15 мас,%,

ор Н.Гунько 4840/59

Составитель Е.Воробьева Техред А.Кравчук

Корре Подпи

Тираж 499 ВНИИПИ Государственного комитета СССР

по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб,, д.4/5

.Производственно-полиграфическое предприятие, г.Ужгород, ул.Проектная, 4

2,00 мл основного йодного раствора

и разбавляют до 500 мл,

1

С помощью описанной методики активность полученной о(.-амилазы превышает 1500 - 2000 ликфон/мл против культуры В. licheniformis, 125 лик- фон/мл, полученных в ферментативной среде для известного продуцента в то время, как те же культуры демонстрируют даже более низкие активности, а именно ниже 50 ликфон/мл, в известной среде.

Другим методом измерения активности oL-амилазы является видоизмененная SKB технология. В этих единицах известные культуры продуцируют менее 500 SKB единиц/мл, в то время как активность Bacillus licheniformis АТСС 39326 10000 SKB ед./мл.

Формула изобретения

1,Способ получения термически устойчивой бактериальной о(. -амилазы, предусматривающий культивирование продуцента бактерий Bacillus licheniformis в питательной среде, содержаей источники углерода, азота, минеральные компоненты и воду, в условиях аэрации и перемешивания с послеующим вьщелением целевого продукта, отлич ающийся тем, что,

с целью повышения активности лазы, в качестве продуцента из вида Bacillus licheniformis используют штамм бактерий Bacillus licheniforis АТСС 39326, а культивирование

осуществляют в условиях рН среды 5,5 - 8,0.

2.Способ поп,1, отличающий с я тем, что в качестве источника углерода в питательной среде исКорректор А.Зимокосов Подписное

Изобретение относится к спосо- , бам получения ферментных препаратов «(-амилазы и может быть использовано в химической, ферментной или пищевой промьшшенности. Цель ияобретения - повышение активности ai -амилазы.Сущность изобретения заключается в том, что в качестве продуцента термоста- , бильной J, -амилазы используют штамм Bacillus licheniformis АТСС 39326, который культивируют в питательной среде, содержащей источники углерода, азота, минеральные компоненты и воду при рН 5,5-8,0, причем в качестве источника углерода предпочтительно используют лактозу в концентрации 5-15 мас.%. Изобретение позволяет получить -амилазу с активностью 1500-2000 ликфон-мл или 10000 SKB единиц/мл после 72 ч культивирования продуцента. 1 з.п. ф-лы. Ct (О О) 4: 4 Ю iU 1 СМ