ШТАММ BACILLUS SUBTILIS X-15, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ ЭНДОМЕТРИТОВ У КОРОВ Российский патент 2002 года по МПК A61K35/74 C12N1/20 C12N1/20 C12R1/125 

Изобретение относится к ветеринарной медицине и представляет собой новый штамм Bacillus subtilis Х-15, используемый в качестве пробиотического препарата для профилактики и лечения эндометритов у коров.

Одним из средств для повышения эффективности профилактики и лечения эндометритов является применение препаратов, содержащих живые культуры симбионтных микроорганизмов. Используемые для этой цели культуры должны обладать сильным антагонистическим действием на широкий спектр патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, вызывающих эндометриты. Также они должны быть безвредными для животного, не обладать острой и хронической токсичностью, не вызывать неблагоприятных побочных эффектов, таких как снижение репродуктивной способности, тератогенность и онкогенность. Используемые штаммы должны быть характерными для сложившегося микробиоценоза половых органов коров и приживаться на длительный срок на их слизистых оболочках. Также желательно наличие высокой резистентности к широко примиряемым антибиотикам и неприхотливость к условиям культивирования.

В настоящее время в ветеринарной медицине применяется штамм Bacillus subtilis 534, ВКМ B-1666D, позволяющий успешно профилактировать и лечить эндометриты у коров (см. 1,2,3). Однако указанный штамм, полученный из негнойной раны человека, не является характерным для микробиоценоза матки и влагалища коров. Он не обладает хорошей приживаемостью на слизистых оболочках половых путей и чувствителен к большинству антибиотиков. Антагонистические свойства этого штамма по отношению к патогенной и условно-патогенной микрофлоре при эндометритах также недостаточно сильны. Биотехнологические свойства штамма Bacillus subtilis 534, ВКМ B-1666D не позволяют достигать высокой концентрации микробных тел при культивировании в питательном бульоне, что делает технологию изготовления из него пробиотического препарата сложной и дорогостоящей (см. 4,5).

Задачей, на решение которой направлено изобретение, является получение штамма микроорганизма, обладающего всеми вышеперечисленными свойствами, а техническим результатом - повышение эффективности профилактики и лечения эндометритов у коров. (Повышение антагонистических свойств, лучшая адаптация к среде половых органов коров, улучшение приживаемости на слизистых оболочках, повышение резистентности к антибиотикам и улучшение биотехнологических свойств).

Полученный штамм Bacillus subtilis X-15 имеет следующие характеристики: морфологические свойства: 24-часовая культура на мясопептонном агаре представляет собой прямые и слегка изогнутые палочки с закругленными краями 1Х3-6 мкм, расположенные поодиночке, парами и в цепочках. На бульоне образуют длинные извитые нити, состоящие из нескольких неразделенных клеток При недостатке кислорода образуют кокковые формы. Характеризуется полиморфизмом. Образуют овальные споры, занимающие 1/2-2/3 клетки, расположенные центрально и субтерминально, отчетливой раздутости спорангия нет.

Биологические свойства. Спорообразование происходит на агаризованных средах на первые сутки, на бульонах - на первые-вторые сутки, при этом нити распадаются. Аэробы подвижные, оптимальная температура роста 38^oС, температурный диапазон роста от 6 до 50^oС. Палочки окрашиваются по Граму положительно, однако при некоторых условиях могут становиться грамотрицательными (первые несколько генераций после длительного хранения, после проводки через организм животного).

Культуральные свойства. На мясопептонном агаре растут в виде серо-белых матовых непрозрачных плоских складчатых сухих колоний округлой формы среднего размера (D=5-10 mm). Колонии плотно срастаются с субстратом, край изрезан, на вторые-третьи сутки приобретают желтый оттенок. При обильном посеве образуют сплошной налет, напоминающий иней. При посеве на мясопептонный агар из бульонной культуры кроме стандартных образуются еще два типа ревертантных колоний: рыхлой влажной консистенции и слизистые. На мясопептонном бульоне на первые сутки образуют серо-белую нежную морщинистую пленку на поверхности. Пленка не разбивается, прилипает к петле целиком, на вторые-третьи сутки становится рыхлой, появляется осадок. На пластинках картофеля на первые сутки образует кремово-белый или желтоватый, морщинистый налет. На вторые-третьи сутки образуется красно-бурый пигмент. На желатине пластинкой образуют серые округлые, вдавленные посередине колонии с разжижением среды. Молоко сворачивает и пептонизирует, среда нейтральная. В толще анаэробного агара не растет.

Биохимические свойства. Выделяет каталазу, ацетоин и ацетилметилкарбон, индол и сероводород не выделяет. Редуцирует нитраты в нитриты, гидролизует крахмал, не гидролизует гиппурат. Разлагает глюкозу, сахарозу, лактозу и маннит с образованием кислоты, но не газа. Выделяет протеолитические ферменты, желатину разжижает воронкой, затем послойно.

Биологические свойства. Не патогенны для белых мышей, крыс, морских свинок и кроликов.

Дополнительные сведения. Растет при концентрации хлористого натрия 7%, этилового спирта 10%, сахарозы 10%. Сохраняет свойства при длительном культивировании.

Для получения штамма была изучена микрофлора влагалища и шейки матки здоровых коров в Вологодской области.

В результате отбора и исследований в Белозерской районной ветеринарной лаборатории Вологодской области штамм Bacillus subtilis X-15 был выделен из канала шейки матки здоровой глубокостельной коровы.

При лабораторной проверке антагонистических свойств установлено, что штамм Bacillus subtilis Х-15 подавляет развитие штаммов E.colli, Staph albus, Staph. flavus, Staph. aureus. Salmonella sp., Clostridium sporogenes, Clostridium oedematiens, Clostridium perfringens, Peptostreptococcus anaerobius, выделенных от коров, больных клинической формой эндометрита.

Штамм Bacillus subtilis Х-15 хорошо адаптирован к среде половых органов коров и приживается на длительный срок на их слизистых оболочках.

Штамм Bacillus subtilis Х-15 чувствителен к левомицетину, гентамицину, неомицину и ампициллину, малочувствителен к стрептомицину, полимиксину и тетрациклину, не чувствителен к бензилпенициллину, эритромицину и линкомицину.

ПРИМЕР 1. При культивировании штамма в среде состава: 10 г пептона, 20 г глюкозы, 50 мл дрожжевого гидролизата, капустного отвара 1:10 до 1000 мл, при температуре 38^oС и рН=7,0 в аэробных условиях в течении трех суток достигается концентрация 55 млрд. м.т./мл.

ПРИМЕР 2. При испытании в производственных условиях полученной бульонной культуры с профилактической целью при внутриматочном введении в дозе 20 мл однократно удалось снизить заболеваемость на 35,6% и повысить оплодотворяемость на 25,3% по сравнению с использованием препарата "Споробактерин", содержащего штамм Bacillus subtilis 534, ВКМ B-1666D. При использовании культуры нового штамма для лечения эндометритов (внутриматочное введение в дозе 20 мл один раз в день, ежедневно, на протяжении 5-8 дней) удалось уменьшить среднюю продолжительность лечения на 4,2 дня по сравнению с препаратом "Споробактерин".

Источники информации
1. Никитенко В.И. Вместо лекарств - бактерии //Наука в СССР, 1991, 4, с. 116-121.

2. Подберезный В. В., Париков В.А., Полянцев Н.И. Превентивная терапия при послеродовых болезнях и мастите коров // Ветеринария, 1996, 2, с. 40-42.

3. Ивановский А.А. Новый пробиотик- бактоцеллолактин при различных патологиях у животных // Ветеринария, 1996, 11, с.34- 35.

4. Жданов П.И. Биологический и эпизоотологический аспекты производства и применения нового пробиотика из бактерий рода Bacillus в свиноводстве: Дис.. .д-ра вет. наук .- Оренбург, 1997, 332 с.

5. Патент РФ 5015232/13, приоритет 02.12.91, класс 6 А 61 К 35/74, С 12 1/20. Способ получения препарата "Споробактерин". Михайлова Н.А., Кузнецова Г.П., Шаяхметов А.Ш., Кунягана О.В., Шаймухаметов Ф.А. опубл. 1996 г. Бюлл. 9, с. 163.

Изобретение относится к ветеринарной медицине и представляет собой новый штамм Bacillus subtilis X-15. Штамм характеризуется комплексом морфологических и культурально-биохимических признаков. Представляют собой прямые и слегка изогнутые палочки с закругленными краями 1Х3-6 мкм, расположенные поодиночке, парами и в цепочках. На бульоне образуют длинные извитые нити, состоящие из нескольких неразделенных клеток. Характеризуется полиморфизмом. Образуют овальные споры, занимающие 1/2-2/3 клетки, расположенные центрально и субтерминально, отчетливой раздутости спорангия нет. Аэробы, подвижные, оптимальная температура роста - 38^oС. Палочки окрашиваются по Граму положительно. На мясопептонном агаре растут в виде серо-белых матовых непрозрачных, плоских складчатых сухих колоний округлой формы среднего размера ( D= 5-10 mm). Колонии плотно срастаются с субстратом, край изрезан, на вторые-третьи сутки приобретают желтый оттенок. Выделяют катализу, ацетоин и ацетилметилкарбон, индол и сероводород не выделяет. Редуцирует нитраты в нитриты, гидролизует крахмал, не гидролизует гиппурат. Разлагает глюкозу, сахарозу, лактозу и маннит с образованием кислоты, но не газа. Выделяет протеолитические ферменты, желатину разжижает воронкой, затем послойно. Использование этого штамма обеспечивает снижение средней продолжительности лечения по сравнению с известным препаратом "Споробактерин".

Штамм бактерий Bacillus subtilis X-15, депонированный в коллекции чистых культур микроорганизмов кафедры эпизоотологии и микробиологии факультета ветеринарной медицины Вологодской государственной молочнохозяйственной академии им. Н. В. Верещагина, используемый для профилактики и лечения эндометритов у коров.