СПОСОБ НЕИНВАЗИВНОЙ ДИАГНОСТИКИ СЕНСИБИЛИЗАЦИИ К ХИМИЧЕСКИМ СОЕДИНЕНИЯМ Российский патент 2002 года по МПК G01N33/536 G01N33/84 

Изобретение относится к области медицины, медицинской экологии, и предназначено для выявления сенсибилизации, обусловленной воздействием низкомолекулярных химических соединений и возникновением аллергического заболевания.

В настоящее время более широкое распространение получили инвазивные методы диагностики сенсибилизации, т.е. с исследованием проб сыворотки крови. Однако указанные способы можно использовать лишь в условиях крупных учреждений практического здравоохранения, где есть в наличии необходимая лабораторная база.

Неинвазивная же диагностика несравнимо проще, дешевле, менее травматична, более безопасна для пациента и может быть использована медицинскими учреждениями и в экспедиционных условиях.

Известен способ неинвазивной диагностики бактериальной аллергии, согласно которому с использованием лейкоцитов слюны пациентов проводят реакцию лейкоцитолиза и диагностируют наличие сенсибилизации организма к специфическому антигену при наличии индекса лейкоцитолиза 0,1 и выше, при этом в качестве специфического антигена используют бруциллезный антиген (1).

Однако данный способ является неприемлемым для определения сенсибилизации к химическим соединениям, т.к. предусматривает проведение специфических реакций лишь в отношении особого вида антигена.

Наиболее близким к предлагаемому изобретению по назначению и совокупности признаков является способ неинвазивной диагностики сенсибилизации к сульфитам, включающий обработку полости рта сульфитом натрия, установление в исследуемом материале - смыве из полости рта с помощью инструментальных методов содержания лейкотриенов - липидных медиаторов аллергии, анализ полученного показателя по отношению к контролю (смыв из полости рта без обработки сульфитом натрия) и диагностирование сенсибилизации по увеличению уровня лейкотриенов в опытной пробе относительно контроля (2).

Недостатком указанного известного способа является его узкая направленность, позволяющая диагностировать лишь сенсибилизацию к сульфитам.

Кроме того, известный способ является недостаточно точным и достоверным, т. к. при смыве из полости рта невозможно абсолютно бесперекрестное одновременное получение опытного и контрольного образцов смывов, а разнесение их по времени будет искажать результат, поскольку каждый последующий смыв будет механически изменен за счет предыдущего.

Кроме того, известный способ является некомфортным для пациентов, особенно детей, т.к. введение сульфитов в ротовую полость может вызвать рвотный рефлекс.

Техническая задача, решаемая предлагаемым способом, состоит в обеспечении универсальности способа, позволяющего диагностировать сенсибилизацию к различным химическим веществам и у разновозрастных пациентов, а также в повышении точности и достоверности.

Поставленная техническая задача достигается тем, что в качестве исследуемого материала используют секрет слизистой носа, при этом предварительно слизистую носа обрабатывают хемотаксином, после чего на слизистую одной половины носовой полости накладывают опытную нитроцеллюлозную подложку с адсорбированным на ней аллергеном, а на слизистую второй половины носовой полости - контрольную нитроцеллюлозную подложку без аллергена, после выдержки каждую нитроцеллюлозную подложку помещают в физиологический раствор, инкубируют, удаляют подложки из опытного и контрольного растворов, методом иммуноферментного анализа определяют в последних содержание гистамина и/или иммуноглобулина Е (Ig E) и по повышению уровня гистамина в опытном образце по отношению к контрольному и (или) по повышению содержания IgE в контрольном образце по отношению к опытному с кратностью 1,5 и выше диагностируют сенсибилизацию организма к данному аллергену.

Достижение поставленного технического результата можно объяснить следующим.

Сенсибилизация приводит к продукции иммуноглобулинов или эффекторных Т-клеток, которые способны вступать в специфическую реакцию с антигеном. Иммунный ответ долгое время считался только защитным механизмом, пока не выяснилось, что он может быть причиной ряда патологий. Сама сенсибилизация заболевания не вызывает - лишь повторный контакт с тем же антигеном может привести к нежелательному эффекту (реакция антиген-антитело). Из выделенных четырех типов аллергических реакций наибольший интерес представляют реакции первого типа, или, как их еще называют, реакции немедленного типа, анафилактические реакции, IgE-опосредованные реакции. В анафилактической реакции различают три фазы:
-в первой (специфической) протекает непосредственно сама реакция антиген-антитело;
-во второй (неспецифической) выделяются медиаторы анафилактической реакции (вазоактивные амины, например гистамин);
-в третьей проявляются функциональные или морфологические изменения.

Антитела, вызывающие анафилактическую реакцию, относятся к определенным классам иммуноглобулинов - IgE (реагины) и IgG и связываются только с определенным типом клеток. Рецепторы для IgE чаще всего несут базофилы и тучные клетки. Тучные клетки содержатся в тканях (90% в слизистых оболочках), обладают высокоаффинными Fc-рецепторами к IgE, содержат базофильные гранулы с ферментами острой фазы и большим количеством гистамина. В результате реакции антиген-антитело происходит деформация молекулы иммуноглобулина, которая вызывает цепную реакцию с дегрануляцией тучных клеток и базофилов с выделением гистамина, вызывающего повышенную проницаемость сосудов и отек тканей.

Благодаря нанесению хемотаксина, например IgG, в предлагаемом способе инициируется движение клеток, в том числе с базофильной зернитостью, по направлению к созданному градиенту плотности, что обеспечивает максимальное попадание гистаминсодержащих клеток в составе секрета слизистой на нитроцеллюлозную подложку.

Благодаря инкубации нитроцеллюлозной подложки в физрастворе в предлагаемом способе обеспечивается максимальный контакт химического вещества - антигена с вариабельными доменами IgE, являющихся рецепторами клеток с базофильными гранулами, и в случае наличия гомологичных специфических участков и связывания антигенов с двумя активными центрами антитела, характеризующегося авидностью, происходит запуск цепной реакции и выброс гистамина из связанных с IgE Fac-фрагментом клеток с базофильной зернистостью. При наличии аллерген-специфичных IqE содержание гистамина в исследуемой пробе увеличивается в отличие от контрольной пробы.

Благодаря тому, что в качестве исследуемого материала используют секрет слизистой носа, обеспечивается доступность и простота обследования разновозрастных пациентов, в том числе и детей.

Кроме того, благодаря совокупности последовательных особых оригинальных приемов (смазывание слизистой носа хемотаксином, наложение подложки с аллергеном, последующая инкубация этой подложки в физрастворе) обеспечивается in vitro точное моделирование условий осуществления реакции антиген-антитело in vivo, что повышает точность и достоверность определения.

А благодаря использованию контрольной подложки без сорбированного на ней аллергена достигается чистота эксперимента и повышается точность, т.к. исключается неспецифическое влияние самого секрета слизистой.

При реализации предлагаемого способа осуществляют следующие операции в нижеуказанной последовательности:
-обрабатывают обе половины носовой полости пациента хемотаксином, например 1,5%-ным водным раствором человеческого IgG;
-через 40-60 мин на обработанную слизистую одной половины носовой полости накладывают опытную нитроцеллюлозную подложку, например, в форме диска с адсорбированным на ней аллергеном, например формальдегидом, фталиевым ангидридом и т.п., а на слизистую второй половины носовой полости накладывают контрольную нитроцеллюлозную подложку без аллергена;
-затем после непродолжительного промежутка времени (до полной пропитки нитроцеллюлозной подложки секретом) каждую подложку помещают в лунки планшета для иммуноферментного анализа, заполненные на 50 мкл физиологическим раствором;
-лунки с подложками герметично закрывают и инкубируют при 37^oС в течение 90 минут при постоянном шейкировании;
-по окончании инкубации подложки удаляют из лунок, берут по 25 мкл опытной и контрольной пробы и изучают их на содержание гистамина и/или IgE методом иммуноферментного анализа;
-оценку результатов производят по увеличению содержания гистамина в опытной пробе в 1,5 раза и более по сравнению с контрольной и/или по превышению содержания IgE в контрольной пробе по сравнению с опытной в 1,5 раза и более, что свидетельствует о наличии сенсибилизации организма к данному аллергену.

Пример конкретного осуществления.

В процессе испытаний было обследовано 10 детей, в возрасте от 3 до 12 лет, проживающих в г. Перми. Перед проведением исследований готовили нитроцеллюлозные подложки следующим образом.

Специальным перфоратором нарезали диски диаметром 5,5 мм из фильтра обеззоленного "белая лента" (ТУ 6-09-1678-86), затем их помещали в водный раствор 0,25%-ной концентрации тестируемого аллергена - формальдегида. Причем было установлено, что именно такая концентрация является щадящей, то есть не оказывающей повреждающего действия на волокна диска. Диски инкубировали в этом растворе 120 мин при постоянном перемешивании, в результате чего получили бумажные диски с прикрепленным к нему тестируемым аллергеном в максимальном сорбционном количестве. В качестве контрольной подложки использовали такой же диск без аллергена.

Слизистую обеих половин носовой полости пациентов смазывали хемотаксином - 1,5%-ным раствором IgG и выдерживали 40 мин. Затем на слизистую одной половины носовой полости накладывали до полной пропитки секретом слизистой опытный диск с аллергеном, а на слизистую второй половины носовой полости - диск без аллергена. Перед наложением оба диска подвергали однократной промывке фосфатным буфером (0,02 М раствором КH₂РO₄ и Na₂HPO₄).

Затем диски извлекали из носа и помещали в лунки стандартной планшеты для иммуноферментного анализа, куда предварительно было помещено по 50 мкл физраствора. После инкубирования при +37^oС и постоянного встряхивания диски извлекались из лунок, а в оставшихся в пробах (по 25 мкл) проводили определение содержания гистамина и/или IgE известным методом иммуноферментного анализа, описанным в инструкциях к тест-системам по определению гистамина ("Biomerica", США) и определению IgE ("Вектор-Бест", Новосибирск, Россия).

Устанавливали разность в содержании гистамина и/или IgE в опытной и контрольной пробах и по увеличению этих показателей в 1,5 раза и более в опытной пробе относительно контроля для гистамина и в контрольной над опытной для IgE диагностировали сенсибилизацию организма к формальдегиду.

Данные, полученные в ходе испытаний, приведены в таблице.

При наличии специфической сенсибилизации к химическому соединению содержание IgE в опытной пробе будет ниже, так как после удаления подложки вместе с ней из пробы будут изыматься специфические IgE к данному соединению, образовавшие комплекс "антиген-антитело" с адсорбированным па подложке изучаемым веществом. С другой стороны, имеющиеся в супернатанте клетки с базофильной зернистостью за счет специфической реакции "антиген-антитело" будут дегранулированы, что отразится на повышении содержания гистамина в опытной пробе по сравнению с контрольной. Таким образом, положительная реакция па специфическую сенсибилизацию должна проявляться повышенным уровнем гистамина в опытном образце по отношению к контрольному и/или повышенным содержанием IgE в контрольном образце по отношению к опытному с кратностью 1,5 и выше.

Данные, приведенные в таблице, показывают, что сенсибилизация к формальдегиду у пациентов 2,5,6,8,10 наблюдается как по критерию гистамина, так и по критерию IgE. Диагностически значимые уровни изучаемых критериев совпадают с повышенным содержанием формальдегида в крови обследуемых детей. Таким образом, для установления факта сенсибилизации предложенным способом достаточно идентифицировать превышение заданного диагностического уровня по одному из предложенных критериев.

Источники информации
1. Патент РФ 2157537, кл. G 01 N 33/536, от 1998 г.

2. Патент РФ 2155963, кл. G 01 N 33/84, от 1995 г. (прототип).

Использование: в медицине и медицинской экологии. Способ универсален и обеспечивает повышение точности и достоверности диагностики. Устанавливают параметры исследуемого материала организма с помощью диагностических методов, определяют значимые показатели, анализируют их по отношению к контролю с последующим диагностированием сенсибилизации, при этом в качестве исследуемого материала используют секрет слизистой носа, причем предварительно слизистую носа обрабатывают хемотаксином, после чего на слизистую одной половины носовой полости накладывают опытную нитроцеллюлозную подложку с адсорбированным на ней аллергеном, а на слизистую второй половины носовой полости - контрольную нитроцеллюлозную подложку без аллергена, после выдержки каждую нитроцеллюлозную подложку помещают в физиологический раствор, инкубируют, удаляют подложки из опытного и контрольного растворов, в последних методом иммуноферментного анализа определяют содержание гистамина и/или иммуноглобулипа Е (IgE) и по увеличению уровня этих показателей в 1,5 раза и более в опытной пробе относительно контроля для гистамина и в контрольной пробе относительно опытной для IgE диагностируют сенсибилизацию организма к данному аллергену. 1 табл.

Способ неинвазивной диагностики сенсибилизации к химическим соединениям, включающий установление параметров исследуемого материала организма с помощью диагностических методов, определение значимых показателей, анализ полученных показателей по отношению к контролю и диагностирование сенсибилизации, отличающийся тем, что в качестве исследуемого материала используют секрет слизистой носа, при этом предварительно слизистую носа обрабатывают хемотаксином, после чего на слизистую одной половины носовой полости накладывают опытную нитроцеллюлозную подложку с адсорбированным на ней аллергеном, а на слизистую второй половины носовой полости - контрольную нитроцеллюлозную подложку без аллергена, после выдержки каждую нитроцеллюлозную подложку помещают в физиологический раствор, инкубируют, удаляют подложки из опытного и контрольного растворов, в последних методом иммуноферментного анализа определяют содержание гистамина и/или иммуноглобулина Е (IgE) и по увеличению уровня этих показателей в 1,5 раза и более в опытной пробе относительно контроля для гистамина и в контрольной пробе относительно опытной для IgE диагностируют сенсибилизацию организма к данному аллергену.