СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПОРАЖЕНИЯ ПЕЧЕНИ У БОЛЬНЫХ ЛЕПРОЙ Российский патент 2002 года по МПК G01N33/92 

Изобретение относится к области медицины, а именно к лепрологии, и может быть, в частности, использовано для определения степени поражения печени у больных лепрой.

Из практики медицины известен способ определения поражения печени у больных лепрой, заключающийся в том, что в сыворотке крови биохимическим методом многократно определяется содержание бром-сульфалеина (Frank E., Lundin Jr. , M.D. and Sister Hilary Ross, B.S. Liver disfunction in leprosy Results of the bromsulfalein retention test in 150 cases // International Journal of Leprosy, 1959. -Vol. 27.-NL- P.43-47). Недостатками этого способа являются: возможность развития тромбофлебита и аллергической реакции на внутривенное введение бромсульфалена (краситель), дефицитность и дороговизна красителя, большая инвазивность методики, так как за время ее выполнения необходимо провести от 2 до 6 венепункций, использование для анализа до 10 мл сыворотки, необходимость предварительного определения уровня билирубина в крови, а также снижение диагностической чувствительности и диагностической эффективности способа при ряде патологических синдромов (лейкопения, холестаз, нарушение водного баланса и белкового обмена), что не позволяет получить конкретный технический результат - повышение точности способа.

Известен также способ определения поражения печени у больных лепрой, заключающийся в том, что в сыворотке крови биохимическим методом определяют показатели белкового, жирового обмена и ферментов (Venkatesan К., Bharadwaj V.P. Sequential biochemical investigations in lepromatous leprosy // Leprosy in India, 1978. -Vol.50.-N2.- P.166-172). Недостатками этого способа являются: невысокая диагностическая чувствительность и диагностическая эффективность, так как выявленные изменения оцениваемых биохимических показателей характерны и для других заболеваний, и поэтому могут быть не связаны с поражением печени, что не позволяет получить конкретный технический результат - повышение точности способа.

Наиболее близким к предлагаемому является способ определения поражения печени у больных лепрой, заключающийся в том, что в сыворотке крови биохимическим методом определяют активность гамма-глютамилтранспептидазы (В. Kumar, A.P.S. Narang and S. Kaur. Gamma-glutamil transpeptidase (GGT) in leprosy // Indian Journal of Leprosy, 1985.-Vol.57.-N4.-P.763-766). Сходство данного способа с предлагаемым заключается в том, что оба они относятся к биохимическим методам определения поражения печени. Для анализа используется сыворотка крови, полученная способом однократной венепункции. Недостатками известного способа являются:
- повышение активности фермента в сыворотке крови при острых и хронических панкреатитах, заболеваниях миокарда;
- изменения активности фермента в результате воздействия этанола и лекарственных веществ (наркотики, седативные средства, индукторы микросомального окисления);
- изменения активности фермента в сыворотке крови характеризуют лишь два из шести основных патологических синдромов поражения печени (холестатический и токсический);
- низкие или нормальные показатели активности фермента в сыворотке крови при тяжелых прогрессирующих формах поражения печени.

Таким образом, перечисленные недостатки свидетельствуют о том, что сывороточная активность гамма-глютамилтранспептидазы не всегда связана с поражением печени, что не позволяет определить поражение органа. При поражении печени изменения активности фермента носят разнонаправленный характер, не в полной мере отражая патофизиологические механизмы поражения органа, что снижает диагностическую эффективность и, следовательно, точность способа при его использовании для определения поражения печени.

Предлагаемое изобретение решает основную задачу - повышение точности способа определения поражения печени у больных лепрой, что позволяет оценить тяжесть течения лепрозного процесса и осуществлять динамический контроль функционального состояния печени в условиях проводимой химиотерапии. Сущность изобретения выражена совокупностью существенных признаков, достаточных для обеспечиваемого изобретением технического результата.

Поставленная задача решается тем, что при биохимическом исследовании сыворотки крови больных лепрой в ней определяют количество перекисно-модифицированных гепариносажденных апо-В-содержащих липопротеидов и при уровне 3,45 мкмоль/грамм белка в пробе и ниже судят о поражении печени.

Повышение точности определения поражения печени у больных лепрой дает возможность осуществлять ее раннюю диагностику на фоне длительно проводимой химиотерапии лепры, в условиях преобладания малосимптомных клинических форм поражения органа, независимо от типа, активности и продолжительности лепрозного процесса, что обеспечивает высокую информативность и достоверность способа.

Проблема поражения печени при лепре остается одной из наиболее актуальных в современной лепрологии. Важнейшим ее аспектом является своевременное выявление поражения печени, тем более, что современный арсенал биохимических методов способен определить лишь 20-30% такой патологии.

Изменения функционального состояния печени при лепре могут быть результатом воздействия на орган, как специфического процесса, так и современных противолепрозных химиотерапевтических средств. Специфическое поражение печени наблюдается уже на ранних стадиях болезни и клинически проявляется как хронический персистирующий гепатит, исходом которого может стать цирроз печени. Не всегда степень поражения печени пропорциональна длительности лепрозного процесса. Наступление его регресса не свидетельствует об интактности печени.

В условиях терапевтического патоморфоза, связанного с использованием в лечении лепры современных противолепрозных препаратов, выраженные проявления поражения печени у больных лепрой встречаются довольно редко. У определенной категории больных возможно наличие латентных малосимптомных форм такой патологии. В этой ситуации диагностическая информативность уже известных способов определения поражения печени у больных лепрой снижается. В то же время, при наличии функциональной недостаточности органа возрастает вероятность проявления неблагоприятных эффектов со стороны противолепрозных химиопрепаратов, которые больные получают на протяжении длительных периодов. Таким образом, поиск новых способов определения поражения печени остается актуальной задачей лепрологии.

Печень - орган, активно участвующий в обмене веществ, в том числе липидном. Ее поражение сопровождается нарушением обмена липопротеидов. Не вызывает сомнения и роль активации процессов перекисного окисления липидов при ее патологии. С другой стороны, процессы перекисного окисления липидов, сопровождающиеся накоплением малонового диальдегида (МДА), интенсивно протекают именно в циркулирующих липопротеидах, причем в сыворотке крови человека эти реакции идут исключительно в апо-В-содержащих липопротеидах, вызывая их перекисную модификацию. Выделение апо-В-содержащих липопротеидов не влияет на содержание в них продуктов пероксидации.

Предлагаемый способ осуществляется следующим образом. Выделение апо-В-содержащих липопротеидов осуществляли химическим методом по М. Ледвиной (1960), а определение в них содержания малонового диальдегида по Л.И. Андреевой и соавт. (1988). По количеству малонового диальдегида в гепариносажденных апо-В-содержащих липопротеидах судят об их перекисной модификации.

Для исследования использовалась сыворотка крови. Забор крови в количестве 1-1,5 мл осуществляют утром натощак через 14-16 часов после последнего приема пищи в сухую чистую пробирку путем пункции локтевой вены. Для получения сыворотки кровь ценрифугируют при 900 g течение 15 минут.

В пробирку с 2 мл 0,025 М раствора хлористого кальция добавляют 200 мкл сыворотки, встряхивают и определяют исходную оптическую плотность (Е₁) при длине волны 680 нм в кювете с толщиной слоя 1 см против дистиллированной воды. После измерения содержимое из кюветы переносят обратно в ту же самую пробирку и добавляют 40 мкл раствора гепарина с концентрацией 1000 ME в 1 мл, несколько раз ополаскивая пипетку содержимым пробирки. Через 4 мин повторно измеряют оптическую плотность пробы (Е₂) при длине волны 680 нм против дистиллированной воды. После измерения содержимое из кюветы снова переносят в ту же самую пробирку. Для лучшего выделения гепариносажденных апо-В-содержащих липопротеидов пробу выдерживают 30 мин при температуре +4-6^oС. По окончании времени инкубации пробирки центрифугируют 30 мин при 1400 g при температуре +4-6^oС. После этого, осторожно, чтобы не нарушить плотный осадок гепариносажденных апо-В-содержащих липопротеидов, супернатант удаляют с помощью пастеровской пипетки. В полученном осадке гепариносажденных апо-В-содержащих липопротеидов определяют содержание МДА.

Для этого готовят опытную и холостую пробы, которые параллельно проходят все последующие этапы. Опытная проба содержит осадок гепариносажденных апо-В-содержащих липопротеидов. Холостая пробасили проба на реактивы, состоит из раствора семиводного сульфата железа, ортофосфорной и тиобарбитуровой кислот, взятых в тех же объемах и концентрации, что и для опытной пробы. Осадок гепариносажденных апо-В-содержащих липопротеидов растворяют в 100 мкл свежеприготовленного раствора семиводного сульфата железа (28 мг на 10 мл дистиллированной воды). Пробирки осторожно встряхивают, закрывают притертыми пробками и помещают на 30 мин в термостат при температуре +37^oС. По окончании времени инкубации пробирки достают из термостата и в пробы добавляют 3 мл 1,0% раствора ортофосфорной кислоты с рН=2,0 и 1 мл 0,6% свежеприготовленного раствора тиобарбитуровой кислоты. Пробирки закрывают притертыми пробками и помещают в кипящую водяную баню (+100^oС) на один час. Затем пробирки охлаждают в токе холодной воды, добавляют к пробам по 3 мл бутанола и тщательно перемешивают встряхиванием в течение 2 мин до образования однородной белой суспензии, имеющей розовый оттенок. Для разделения фаз пробы центрифугируют в течение 15 мин при 1400g. Сразу после центрифугирования прозрачную верхнюю бутанольную фазу осторожно, чтобы не захватить осадок, отсасывают пастеровской пипеткой в чистую сухую пробирку и измеряют оптическую плотность опытной (Еоп) и холостой (Ехол) проб относительно бутанола в кювете с толщиной слоя 1 см при двух длинах волн: 535 нм и 580 нм (Е₅₃₅ и E₅₈₀).

Проводят расчет результатов. Рассчитывают количество гепариносажденных апо-В-содержащих липопротеидов по разности (ΔE) измереной оптической плотности пробы до (Е₁) и после (Е₂) внесения в пробу раствора гепарина
ΔE = E₂-E₁.
Для выражения результата в грамм/литр белка гепариносажденных апо-В-содержащих липопротеидов (С₁) значение разности оптической плотности (ΔE) умножают на пересчетный коэффициент, равный 2,44 (М.Ледвина, 1960).

Содержание перекисно-модифицированных гепариносажденных апо-В-содержащих липопротеидов рассчитывают по формуле

С₂ - содержание перекисно-модифицированных гепариносажденных апо-В-содержащих липопротеидов в мкмоль/грамм белка в пробе;
С₁ - количество гепариносажденных апо-В-содержащих липопротеидов в грамм/литр белка;
Д_оп - оптическая плотность опытной пробы, определенная по разнице Е₅₃₅ - Е₅₈₀;
Д_хол - оптическая плотность холостой пробы, определенная по разнице Е₅₃₅-Е₅₈₀;
4 - объем бутанольной фазы в мл;
1,56•10 - коэффициент молярной экстинкции малонового диальдегида в моль^-1•см ^-1;
10⁶ - коэффициент перевода показателя C₂ в мкмоль/литр;
0,2 - объем сыворотки крови, из которого выделяли гепариносажденные апо-В-содержащие липопротеиды в мл.

Все применявшиеся реактивы имели категорию "Чистые Для Анализа" (ЧДА). Работа осуществлялась с использованием спектрофотометра "SPECORD" (Германия) и рефрижераторной центрифуги РС-6 (Россия).

Статистическая обработка полученных результатов осуществлялась с использованием электронных таблиц MICROSOFT EXCEL с вычислением следующих статистических параметров: средней арифметической (М), среднего квадратического отклонения (S) и критерия Стьюдента.

Изложенная сущность изобретения поясняется таблицами.

Из таблицы 1 видно, что среднее значение содержания перекисно-модифицированных гепариносажденных апо-В-содержащих липопротеидов (М) у больных лепрой, имеющих поражение печени (первая группа), составило 2,40 мкмоль/грамм белка в пробе. С учетом среднего квадратического отклонения (S) верхняя граница допустимого интервала равнялась 3,45 мкмоль/грамм белка в пробе. Она была принята в качестве критерия, при значениях равных и ниже которого у больных лепрой определяли поражение печени. В группе больных, не имевших поражения печени (вторая группа), среднее значение содержания перекисно-модифицированных гепариносажденных апо-В-содержащих липопротеидов равнялось 5,45 мкмоль/грамм белка в пробе. С учетом среднеквадратического отклонения нижняя граница доверительного интервала соответствовала 3,80 мкмоль/грамм белка в пробе. Обследованные группы больных не имели достоверных различий (Р>0,05) по средним показателям активности гамма-глутамилтранспептидазы сыворотки крови (способ-прототип), но значительно и достоверно (Р<0,05) отличались по содержанию перекисно-модифицированных гепариносажденных апо-В-содержащих липопротеидов (предлагаемый способ). Таким образом, точность предлагаемого способа в сравнении со способом-прототипом оказалась выше, что делает его предпочтительным для определения поражения печени у больных лепрой.

Точность определения поражения печени в общей группе обследованных больных лепрой (38 человек) оценивали с учетом диагностической чувствительности (ДЧ) и диагностической эффективности (ДЭ) способа, которые рассчитывались по Griner P.F. et al. (1981) (таблица 2).

Как видно из таблицы 2, чувствительность и диагностическая эффективность предлагаемого способа составили соответственно 91,30% и 89,47%, что превышает таковые показатели при использовании способа-прототипа (соответственно 13,00% и 44,74%). Таким образом, точность определения поражения печени у больных лепрой предлагаемым способом оказалась выше, чем при использовании способа-прототипа.

Предлагаемый способ прошел успешную апробацию в клинике НИИ по изучению лепры МЗ РФ на 38 больных лепрой в течение 1999 года. Шесть пациентов страдало активной формой заболевания. У остальных 32 человек лепрозный процесс находился в состоянии клинической ремиссии. Все больные были разделены на две группы. Первая группа - больные с хроническим персистирующим гепатитом (23 человека), у которых на момент исследования отмечалось умеренное увеличение печени. У большинства больных этой группы имели место непостоянные диспептический и болевой синдромы. Во вторую группу было включено 15 больных лепрой, у которых в анамнезе и на момент исследования отсутствовали признаки поражения печени.

Ниже приводятся результаты апробации.

Пример 1.

Больной Л-й, 1947 г.р., (история болезни 3610). Болен лепрой на протяжении 44 лет. С апреля 1993 года и по настоящее время отмечается рецидив лепры. Диагноз: лепра, лепроматозный тип, LL_S. Хронический специфический гепатит. Клинически наблюдались болевой и диспептический синдромы, увеличение печени на 2 см из под края реберной дуги. Гистология: инфильтрат лепроматозной структуры с наличием единичных гомогенных и зернистых форм М. leprae. Бактериоскопический индеке (БИН) равен 1,17+. Сканирование печени: изменения по типу хронического гепатита. Для осуществления предлагаемого способа используют сыворотку крови и по показателю биохимического определения перекисно-модифицированных гепариносажденных апо-В-содержащих липопротеидов определяют поражение печени. Забор крови осуществляли утром натощак через 14-16 часов после последнего приема пищи в сухую чистую пробирку путем пункции локтевой вены. Для получения сыворотки кровь ценрифугируют.

В пробирку с 2 мл 0,025 М раствора хлористого кальция добавляют 200 мкл сыворотки, встряхивают и определяют исходную оптическую плотность (Е₁) при длине волны 680 нм в кювете с толщиной слоя 1 см против дистиллированной воды. После измерения содержимое из кюветы переносят обратно в ту же пробирку и добавляют 40 мкл раствора гепарина с концентрацией 1000 ME в 1 мл. Через 4 мин повторно измеряют оптическую плотность пробы (Е₂) при длине волны 680 нм против дистиллированной воды. Содержимое кюветы снова переносят в ту же самую пробирку. Пробу выдерживают 30 мин при температуре +4-6^oС, после чего пробирки центрифугируют 30 мин при 1400 g при температуре +4-6^oС. Затем супернатант удаляют с помощью пастеровской пипетки. В полученном осадке гепариносажденных апо-В-содержащих липопротеидов определяют содержание МДА.

Опытная проба содержит осадок гепариносажденных апо-В-содержащих липопротеидов. Холостая проба состоит из раствора сульфата железа, ортофосфорной и тиобарбитуровой кислот, взятых в тех же объемах и концентрации, что и для опытной пробы. Осадок гепариносажденных апо-В-содержащих липопротеидов растворяют в 100 мкл раствора сульфата железа. Пробирки встряхивают, закрывают пробками и помещают на 30 мин в термостат при температуре +37^oС. По окончании времени инкубации к пробам добавляют 3 мл 1,0% раствора ортофосфорной кислоты с рН=2,0 и 1 мл 0,6% раствора тиобарбитуровой кислоты. Пробирки закрывают пробками и помещают в кипящую водяную баню на один час. Затем пробы охлаждают в токе холодной воды, добавляют к ним по 3 мл бутанола, перемешивают до образования однородной белой суспензии, имеющей розовый оттенок. Для разделения фаз пробы центрифугируют. Сразу после центрифугирования бутанольную фазу осторожно переносят в чистую сухую пробирку и измеряют оптическую плотность опытной (Еоп) и холостой (Ехол) проб относительно бутанола в кювете с толщиной слоя 1 см при двух длинах волн: 535 нм и 580 нм (Е₅₃₅ И Е₅₈₀).

Проводят расчет результатов. Рассчитывают количество гепариносажденных апо-В-содержащих липопротеидов. Результат выражают в грамм/литр белка гепариносажденных апо-В-содержащих липопротеидов с учетом пересчетного коэффициента.

Содержание перекисно-модифицированных гепариносажденных апо-В-содержащих липопротеидов расчитывают по формуле

Концентрация перекисно-модифицированных гепариносажденных апо-В-содержащих липопротеидов составила 3,45 мкмоль/грамм белка в пробе. Таким образом, предложенный способ позволил достоверно определить поражение печени.

Пример 2.

Больной К-н, 1936 г.р.,( история болезни 3866). Болен лепрой на протяжении 18 лет. Диагноз: лепра, лепроматозный тип, LLp, активная стадия с висцеральными проявлениями. Клинически непостоянные болевой и диспептический синдромы. Печень увеличена на 1,5-2 см из под края реберной дуги. Гистология: инфильтрат лепроматозной структуры содержащий большое количество гомогенных и зернистых, часто образующих скопления типа "сигаретных палочек" и "шаров" М. leprae. БИН=2,5+. Сканирование печени: выраженные изменения по типу хронического гепатита. Определение поражения печени проводилось способом, описанным в примере 1. Концентрация перекисно-модифицированных гепариносажденных апо-В-содержащих липопротеидов составила 2,46 мкмоль/грамм белка в пробе. Таким образом, предложенный способ позволил достоверно определить поражение печени.

Пример 3.

Больной М-в, 1936 г.р.,(история болезни 3866). Болен лепрой на протяжении 37 лет. Диагноз: лепра, недифференцированный тип, стадия регресса. Хронический персистирующий гепатит. Клинически непостоянный диспептический синдром. Печень увеличена на 2 см из под края реберной дуги. БИН=0. Сканирование печени: выраженные изменения по типу хронического гепатита. Определение поражения печени проводилось способом, описанным в примере 1. Концентрация перекисно-модифицированных гепариносажденных апо-В-содержащих липопротеидов составила 1,58 в мкмоль/грамм белка пробе. Таким образом, предложенный способ позволил достоверно определить поражение печени.

Пример 4.

Больная У-ва, 1928 г.р.,(история болезни 3737). Больна лепрой на протяжении 14 лет. Диагноз: лепра, лепроматозный тип, LL_S, стадия регресса. Клинически отсутствовали данные о поражении печени. БИН=0. Сканирование печени: признаки поражения печени отсутствуют. Определение поражения печени проводилось способом, описанным в примере 1. Концентрация перекисно-модифицированных гепариносажденных апо-В-содержащих липопротеидов составила 3,89 мкмоль/грамм белка пробе. Таким образом, полученный результат свидетельствует об отсутствии поражения печени.

Применением предложенного способа по сравнению со способом-прототипом достигается положительный результат, заключающийся в повышении точности определения поражения печени у больных лепрой на фоне лепрозного процесса и проводимой химиотерапии. Результаты проведенного клинического испытания предлагаемого способа свидетельствуют о его высокой диагностической чувствительности и диагностической эффективности, что позволяет осуществить своевременную и точную диагностику поражения печени у больных лепрой.

Таким образом, авторами предложен новый, никем ранее не предлагаемый способ определения поражения печени у больных лепрой.

Применение предлагаемого способа позволяет осуществлять точную диагностику поражения печени у больных лепрой на фоне длительно проводимой химиотерапии. В перспективе предполагается его использование в качестве биохимического теста для определения поражения печени у больных лепрой, и способ может быть рекомендован к клиническому использованию в противолепрозных учреждениях.

Изобретение относится к области медицины, в частности к лепрологии. Способ обеспечивает повышение точности определения поражения печени у больных лепрой. Проводят биохимическое исследование сыворотки крови больных лепрой, при этом в сыворотке крови определяют количество перекисно-модифицированных гепаринсодержащих апо-В-содержащих липопротеидов и при уровне 3,45 мкмоль/г белка в пробе и ниже судят о поражении печени. 2 табл.

Способ определения поражения печени у больных лепрой путем биохимического исследования сыворотки крови больных лепрой, отличающийся тем, что в сыворотка крови определяют количество перекисно-модифицированных гепариносажденных апо-В-содержащих липопротеидов и при уровне 3,45 мкмоль/г белка в пробе и ниже судят о поражении печени.