СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДИФТЕРИЙНОГО АНТИГЕННОГО ДИАГНОСТИКУМА Российский патент 2002 года по МПК A61K39/02 A61K39/05 

Изобретение относится к области медицины, а точнее - к микробиологии, и может быть использовано для диагностики дифтерии.

В настоящее время актуальность дифтерийной инфекции сохраняется несмотря на широко проводимую специфическую профилактику (В.В. Краснов, И.В. Орлов. Особенности дифтерии у детей на современном этапе //Современные проблемы педиатрии. Материалы YIII съезда педиатров России, - Москва, 24-26 февраля 1998, -с.150-151; С.С. Маркина, А.А. Монисов. Дифтерия в России в 1990-1994 годах// Проблемы эпидемиологии, микробиологии и клиники капельных и кишечных инфекций. - М., 1996,-с.18-20). Регистрируются случаи заболевания дифтерией и среди привитых, имеющих защитные уровни противодифтерийных антитоксических антител, а также перенесших дифтерию (А. Г. Рахманова, В.К. Пригожина. Смертельные исходы дифтерии у взрослых, привитых против дифтерии// Клиническая медицина, - 1996.- N9.- с.67-69). Дифтерийная инфекция характеризуется большим разнообразием клинических форм. Различают дифтерию ротоглотки, носа, гортани, трахеи, бронхов, глаз, кожи. а также возможно формирование носительства токсигенных C.diphtheriae (М.Х. Турьянов, Н.М. Беляев, А.Д. Царегородцев и др. Дифтерия. - М.,- 1996.-254 с.). Ведущую роль в возникновении дифтерии играет дифтерийный токсин, который является политропным ядом, поражающим клетки нервной системы, почек, миокарда, надпочечников, легких (Ж.И. Возианова, А.К. Дуда, Е.Н. Амисова. Диагностические критерии дифтерийного миокардита// Врачебное дело.-1999,- N4,-с.22-27; В.А. Капустян, В.В. Болдырев, Е.Ф. Седак. Осложнения дифтерии// Терапевтический архив.-1993,-том 65. -N3, -с.75-77). Однако важную роль в патогенезе дифтерии играют и бактериальные антигены, входящие в состав клеточных стенок C.diphtheriae и обусловливающие прикрепление возбудителя на эпителиальных клетках организма человека (Л.А. Фаворова, Н.Ф. Астафьева, М.П. Корженкова и др. Дифтерия. - М., - 1998.- 208 с.) В связи с этим в организме человека при дифтерийной инфекции идет выработка как антитоксических, так и антибактериальных антител, определение уровня которых может быть использовано с целью диагностики дифтерии. Определение противодифтерийных антител осуществляют с помощью эритроцитарных дифтерийных антигенных диагностикумов.

Проведенными исследованиями по патентной и научно-медицинской литературе выявлены различные методы приготовления дифтерийных диагностикумов.

Н.М. Булатова (Н.М. Булатова. К методике получения антимикробных антигенов коринебактерий дифтерии и изучение их антигенных и иммуногенных свойств в эксперименте// Вопросы эпидемиологии и прикладной иммунологии. - часть 1.- Казань,-1975.- с.63-69) предложила способ получения дифтерийного антигенного диагностикума на основе антигена коринебактерий дифтерии, выделенного путем экстракции хлороформом и дезоксихолатом натрия. Однако полученный диагностикум обладал сниженной антигенной активностью, так как для его приготовления авторы использовали химические вещества (хлороформ и дезоксихолат натрия), которые обладали повреждающим действием на белковые антигены коринебактерий дифтерии.

В работе В.А. Шмелевой с соавт. (Е.А. Шмелева, С.И. Лещук, С.М. Попкова. Использование эритроцитарного диагностикума для выявления антибактериальных противодифтерийных антител// Состояние и перспективы разработки препаратов для диагностики вирусных гепатитов и инфекций, управляемых средствами массовой профилактики. - Пермь, -1993.- с.137-138) описан способ получения эритроцитарного дифтерийного диагностикума на основе антигена, выделенного из клеточных стенок коринебактерий дифтерии по методике Н.Н. Кондрашиной (Н.Н. Кондрашина, С.Ф. Берестень, Е.А. Шмелева. Способ получения антигена коринебактерий дифтерии//а.с. N 1471857, МПК G 01/N 33/531). Однако данный способ не получил широкого распространения, так как для получения целевого продукта требовалась дорогостоящая аппаратура (ультрацентрифуги, установки для гель-фильтрации).

Н. Н. Басова с соавт. (Н. Н. Басова, О.И. Ивченко, Г.И. Коростылева. Способ определения состояния иммунитета при дифтерийной инфекции//а.с.N 1534401, МПК G 01 N/33/53) предложили способ определения состояния иммунитета для диагностики дифтерии с помощью дифтерийного антигенного эритроцитарного диагностикума. Однако данный диагностикум мог быть использован только при обследовании больных, которым не вводили с целью лечения противодифтерийную сыворотку (ПДС).

Наиболее близким техническим решением, принятым в качестве прототипа, является опубликованный в ЖМЭИ, 1967, 1, с. 133-134 в статье М.И. Леви, Г.А. Фоменко, Ф. Е. Крацова "Стойкий эритроцитарный диагностикум для обнаружения столбнячного и дифтерийного анатоксинов и антител к ним" способ получения диагностикума эритроцитарного дифтерийного антигенного (анотоксинного) (регистрационный номер 97/306/1, Государственный реестр лекарственных средств, МЗ России, Москва, 1998, с.194) на основе антигена (дифтерийного анатоксина), который получают по методу, описанному в сборнике "Вакцины и сыворотки", Москва, вып.21, 1974, с. 113-114.

Этот способ предусматривает культивирование дифтерийных микробов (С.diphtheriae, биовар gravis) в реакторе с питательной средой при 34...35^oС в течение 36-40 ч. После завершения культивирования микробную взвесь сливают в стерильные емкости-сборники и подают на суперцентрифугу ОГО-100 для отделения токсина от микробной массы. После центрифуги токсин поступает в стерильный герметически закрытый сборник, откуда под давлением подается на 3-7 рамные фильтры Сальникова со стерилизующими пластинами. После стерилизации токсин поступает в реакторы-детоксикаторы для перевода его в анатоксин. При повторном помешивании туда добавляют 0,65% формалина, инкубируют при 39... 40^oС в течение 5 суток. Затем частично обезвреженный токсин очищают, стерилизуют, добавляют 0,15% формалина и инкубируют при 39...40^oС в течение 15 суток. Полученный таким образом дифтерийный анатоксин (ДА) используют для приготовления дифтерийного диагностикума. Для этого смесь равных объемов 2,5% взвеси формализированных эритроцитов барана и раствора танина (1:20000) оставляют при комнатной температуре на 15-30 мин, после чего эритроциты 2-3 раза отмывают физиологическим раствором. Затем к 2,5% взвеси формалинизированных танинизированных эритроцитов добавляют очищенный анатоксин и фосфатный буфер, с тем, чтобы в смеси установилась рН 6,4 и определенная концентрация дифтерийного анатоксина (10-20 Lf в 1 мл). Смесь дифтерийных компонентов выдерживают в термостате при 37^oС 2 ч при периодическом встряхивании. За 1-1,5 ч до окончания сенсибилизации добавляют 1%-ный раствор формалина. После сенсибилизации эритроциты трижды отмывают на холоду 5-6 объемами физиологического раствора (по 5 мин) при 2000 об./мин, ресуспендируют до 2,5% взвеси в 0,4%-ном растворе нормальной кроличьей сыворотки, прогретой в течение 30 мин при 56^oС, и добавляют формалин до 1%-ной его концентрации. Полученный таким образом продукт используют в качестве эритроцитарного дифтерийного антигенного (анатоксинного) диагностикума.

Существенным недостатком данного способа является длительный срок получения целевого продукта (порядка 522 ч) и его недостаточная эффективность. Это связано с тем, что больным с подозрением на дифтерию при поступлении в стационар вводят противодифтерийную антитоксическую сыворотку (ПДС), содержащую антитела к ДА. При исследовании крови с помощью данного диагностикума у больных выявляют как собственные антитела к ДА, так и антитела к ДА, входящие в состав ПДС, тогда как для диагностики дифтерии необходимо определять только собственные противодефтерийные атитела.

Целью настоящего изобретения является сокращение сроков получения диагностикума и повышение его эффективности.

Эта цель достигается путем выращивания дифтерийных микробов на плотной питательной среде, приготовления из них суспензии густотой 1000 ОЕ/мл, прогревания ее при 56...58^oС в течение 40 мин, обработки формалином и мертиолятом, отмывания 0.15М раствором хлорида натрия, дезинтеграции, выделения из нее посредством диализа через мембрану с порами 40-60 нм дифтерийного диализатного антигена (ДДА), разведения его до концентрации 250-400 мкг/мл по белку и соединения его в объеме 1 мл с 3 мл 50%-ных ФЭБ, отмытых 0.15М раствором хлорида натрия, с 5 мл 20%-ного раствора полиэтиленгликоля с мол. массой 6000 кД и 4 каплями формалина. После этого полученную взвесь выдерживают 2 ч при 22...24^oС и 1 сутки при 4...8^oС.

Предлагаемый способ осуществляется следующим образом.

Микробные штаммы С. diphtheriae, биовар gravis, серотип 2, полученные из Государственного НИИ стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л. А.Тарасовича, предварительно выращивают на плотной питательной среде с добавлением 20...25% сыворотки крупного рогатого скота в течение 24 ч, суспендируют в стерильном 0,5M растворе хлорида натрия, доводя густоту микробной взвеси до 1000 ОЕ/мл, контролируя ее с помощью стандартного образца мутности (Государственный НИИ стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А.Тарасевича), прогревают при 56... 58^oС в течение 40 мин, добавляют формалин до концентрации 0,5% и мертиолят до концентрации 0,001% и выдерживают в термостате при 37^oС в течение 24 ч. После этого взвесь отмывают 0,15М раствором хлорида натрия при 3000 об/мин с помощью центрифуги лабораторной клинической ОПН-3 в течение 20 мин. Полученный осадок ресуспендируют в исходном объеме хлорида натрия и дезинтегрируют воздействием низкочастотного ультразвука в течение 15 мин с помощью низкочастотной ультразвуковой установки ДБУ-1. Полученный дезинтеграт диализуют через мембрану с размерами пор 40-60 нм (диализ проводят против 0,15М раствора хлорида натрия, содержащего 0,001% мертиолята, в шуттель-аппарате при 3. . . 5⁰С в течение 6 дней) и выделяют дифтерийный диализатный антиген (ДДА).

ДДА разводят 0,15М раствором хлорида натрия до концентрации по белку (Лоури) - 250-400 мкг/мл. Затем 1 мл полученного раствора ДДА соединяют с 3 мл отмытых в 0,15М растворе хлорида натрия коммерческих 50%-ных формалинизированных эритроцитов барана (ФЭБ), с 5 мл 20%-ного раствора полиэтиленгликоля с мол. массой 6000 кД и 4 каплями формалина. Взвесь выдерживают 2 ч при 22...24⁰С и 1 сутки при 4...8^oС в холодильнике.

Весь процесс приготовления диагностикума занимает порядка 219 ч.

Эффективность полученного дифтерийного антигенного диагностикума была проверена с использованием стандартных сывороток (Таблица 1).

Исходя из данных, приведенных в таблице, видно, что дифтерийный антигенный диагностикум обладал высокой активностью при исследовании агглютинирующих дифтерийных сывороток. Специфичность диагностикума подтвердили отрицательные результаты исследования стандартных недифтерийных сывроток (столбнячной, коклюшной, эшерихиозной, сальмонелпезной), а также отрицательный результат исследования стандартной дифтерийной антитоксической сыворотки, свидетельствующий о том, что данный диагностикум не выявляет антител к дифтерийному анатоксину, входящих в состав ПДС.

Применение полученного антигенного диагностикума. приготовленного согласно предлагаемому способу, и сопоставительный анализ его активности по сравнению с прототипом поясняется примерами из клинической практики VI инфекционного отделения БСМП N 1 г. Ростова-на-Дону.

Пример 1. У 50 больных с диагнозом "дифтерия" забрали кровь на 1-2 день заболевания (после введения ПДС) и 7-10 день заболевания (после введения ПДС) и исследовали ее с дифтерийным антигенным диагностикумом на основе ДА и с дифтерийным антигенным диагностикумом на основе ДДА с целью подтверждения диагноза. (Таблица 2).

Результаты исследования крови больных дифтерией (50 чел.) с диагностикумом на основе ДДА в 88% случаев совпали с диагнозом "дифтерия", что было подтверждено нарастанием уровня антител у них в динамике заболевания. При исследовании крови этих же больных (50 чел.) с диагностикумом на основе ДА диагноз "дифтерия" не был подтвержден ни в одном случае, так как нарастания уровней антител ни у кого из обследуемых обнаружено не было. Это можно объяснить тем, что после введения ПДС уровень антител к ДА у обследуемых не изменяется в течение заболевания и диагностикум на основе ДА не позволяет проводить подтверждение диагноза "дифтерия".

Пример 2.

У 20 больных с подозрением на дифтерию забрали кровь на 1-2 день заболевания (до введения ПДС) и на 7-10 день заболевания (после введения ПДС) и исследовали ее с дифтерийным антигенным диагностикумом на основе ДА и с дифтерийным антигенным диагностикумом на основе ДДА с целью подтверждения диагноза "дифтерия". (Таблица 3).

Результаты исследования крови больных (20 чел.) с диагностикумом на основе ДДА в 90% случаев совпали с окончательным диагнозом, тогда как при использовании диагностикума на основе ДА процент совпадений с окончательным диагнозом составил 70%. Это связано с тем, что у всех больных после введения ПДС, независимо от наличия у них дифтерии, выявляли нарастание уровней антител к ДА, а уровень антител к ДДА не зависел от введения ПДС и возрастал только у больных дифтерией.

Таким образом, предлагаемый способ получения дифтерийного антигенного диагностикума имеет следующие преимущества перед прототипом: позволяет сократить сроки приготовления диагностикума с 523 до 219 ч и повысить эффективность диагностикума, с помощью которого практически в 90% случаев независимо от введения ПДС возможно подтверждать диагноз "дифтерия" исключительно посредством определения собственных противодифтерийных антител, не входящих в состав ПДС.

Изобретение относится к медицине, в частности к микробиологии, и может быть использовано для диагностики дифтерии. Сущностью изобретения является получение диагностикума путем выращивания дифтерийных микробов на плотной питательной среде, приготовления из них суспензии густотой 1000 ОЕ/мл, прогревания ее при 56...58^oС в течение 40 мин, обработки формалином и мертиолятом, отмывания 0,15М раствором хлорида натрия, дезинтеграции, выделения из нее посредством диализа через мембрану с порами 40-60 нм дифтерийного диализатного антигена (ДДА), разведения его до концентрации 250-400 мкг/мл по белку и соединения его в объеме 1 мл с 3 мл 50%-ных формалинизированных эритроцитов барана, отмытых 0,15М раствором хлорида натрия, 5 мл 20%-ного раствора полиэтиленгликоля с мол. массой 6000 кД и 4 каплями формалина. После этого полученную взвесь выдерживают 2 ч при 22...24^oС и 1 сутки при 4... 8^oС. Техническим результатом является сокращение сроков получения диагностикума и повышение его эффективности. 3 табл.

Способ получения дифтерийного антигенного диагностикума путем выращивания дифтерийных микробов, соединения формалинизированных эритроцитов барана и дифтерийного антигена, отличающийся тем, что дифтерийные микробы выращивают на плотной питательной среде (питательный агар с добавлением 20. . . 25% сыворотки крупного рогатого скота), готовят из них суспензию густотой 1000 ОЕ/мл, прогревают при 56. . . 58^oС в течение 40 мин, добавляют формалин до концентрации 0,5% и мертиолят до концентрации 0,001%, выдерживают в термостате при 37^oС 24 ч, отмывают 0,15 М раствором хлорида натрия, дезинтегрируют, выделяют дифтерийный диализатный антиген путем диализа через мембрану с порами 40-60 нм, разводят антиген до концентрации 250-400 мкг/мл по белку и соединяют его в объеме 1 мл с 3 мл 50%-ных формалинизированных эритроцитов барана, отмытых 0,15 М раствором хлорида натрия, с 5 мл 20%-ного раствора полиэтиленгликоля с молекулярной массой 6000 кД и 4 каплями формалина и выдерживают 2 ч при 22. . . 24^o и 1 сутки при 4. . . 8^oС.