АВИРУЛЕНТНЫЙ ШТАММ БАКТЕРИЙ VIBRIO CHOLERAE КМ 169 СЕРОГРУППЫ О139 - ПРОДУЦЕНТ КАПСУЛЬНОГО АНТИГЕНА Российский патент 2005 года по МПК C12N1/21 A61K39/106 C12N1/21 C12R1/63 

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к конструированию штамма с повышенной продукцией капсульного антигена, и может быть использовано при производстве химических холерных вакцин против возбудителя холеры О139 серогруппы.

Прошедшее десятилетие было отмечено появлением возбудителя холеры новой О139 серогруппы - V.cholerae О139. Отсутствие иммунитета к нему у населения, ранее сталкивавшегося только с возбудителем холеры серогруппы O1 - V.cholerae O1, послужило причиной больших эпидемий холеры в странах Юго-Восточной Азии и привело к выносу инфекции на территорию других стран и континентов, в том числе и в США и республики СНГ. Большое число случаев холеры, вызываемых патогенными вибрионами О139 серогруппы (17%), и наблюдаемая в последнее время тенденция к их увеличению делают необходимым создание эффективных средств профилактики этого патогена.

Химические вакцины являются действенным средством профилактики инфекционных заболеваний, в том числе и холеры. В их состав входят препараты протективных бактериальных антигенов, которые вызывают развитие иммунитета к возбудителю инфекции у вакцинированных людей. Появление возбудителя холеры новой О139 серогруппы - V.cholerae О139 с новыми поверхностными антагенами - О139 - антигеном и полисахаридной капсулой делает необходимым введение в состав химических вакцин против диарейных инфекций этих антигенов.

В настоящее время разработаны и применяются в производстве профилактических противохолерных средств штаммы - продуценты с высоким уровнем биосинтеза О139 антигена. В то же время отсутствуют штаммы - продуценты капсульного антигена серогруппы О139, которые могут быть использованы для получения капсульного полисахарида.

Известен штамм Р16064 серогруппы О139, полученный из клинических источников, который продуцирует полисахаридную капсулу. Однако высокая вирулентность этого штамма ограничивает его применение в производственных условиях, а небольшое количество образуемого капсульного вещества делает штамм малоэффективным при его использовании в качестве продуцента этого антигена (Смирнова Н.И., Чеховская Г.В., Давыдова Н.И. и др. Филогенетический анализ двух морфологически разных типов колоний V.cholerae О139 // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология -1995. - №3. - С.30-34).

Известен также авирулентный штамм V.cholerae KM115, не содержащий генов токсигенности, детерминирующих синтез холерного энтеротоксина, и продуцирующий капсульный антиген. Однако уровень продукции капсулы у этого штамма также недостаточно высок (Ганин B.C., Урбанович Л.Я. и др. Vibrio.cholerae О139 (“Бенгал”) в Сибири //Материалы научной конференции, посвященной 100-летию образования противочумной службы России. - Саратов, 1997 г. - T.1. - С.30).

Для получения препарата капсульного антигена, одного из компонентов холерной химической вакцины против возбудителя холеры серогруппы О139, необходим штамм, продуцирующий значительное количество этого антигена.

Задачей изобретения является получение авирулентного штамма V.cholerae О139 с высоким и стабильным уровнем продукции капсульного антигена.

Сущность изобретения заключается в том, что на основе авирулентного природного штамма V.cholerae серогруппы О139 методом поэтапной селекции клеток с повышенной продукцией капсулы получен авирулентный штамм-продуцент капсульного антигена, стабильно образующий в 3-4 раза больше антигена по сравнению с другими штаммами этой серогруппы.

Предлагаемый штамм получен из авирулентного штамма V.cholerae 62 серогруппы О139, выделенного из внешней среды. Штамм V.cholerae 62 выращивали в жидком питательном бульоне при 37°С в течение 18 часов и рассевали на твердой питательной среде до изолированных колоний. Визуально отбирались колонии с хорошими ростовыми качествами и повышенной мутностью, свидетельствовавшей о значительной продукции капсулы. Высокий уровень капсулообразования подтверждался с помощью электронной микроскопии. В результате 4-х кратного повторения этого этапа получен авирулентный штамм, у которого продукция капсульного антигена в 3-4 раза превышает уровень его образования у других штаммов этой серогруппы.

Штамм депонирован в Государственной коллекции патогенных бактерий при РосНИПЧИ “Микроб” (г. Саратов) под номером КМ 169.

Культурально-морфологические, биохимические и серологические свойства штамма.

Грамотрицательные, слегка изогнутые палочки, подвижные, с одним полярно расположенным жгутиком.

На твердых питательных средах формирует средней величины круглые, с ровными краями, мутные колонии голубовато-серого цвета. При росте в бульоне вызывает равномерное помутнение среды.

Факультативный анаэроб. Ферментирует до кислоты без газа маннозу, сахарозу, манит, мальтозу. Не ферментирует лактозу и арабинозу. По биохимической активности относится к I группе Хейберга. Лизирует эритроциты барана. Прототроф.

Резистентен к диагностическим холерным фагам С и эльтор.

Не растет на щелочном агаре с добавлением 50 мкг/мл полимиксина. Резистентен к антибиотику ампициллину (50 мкг/мл).

Штамм агглютинируется сывороткой к O139-антигену в диагностическом титре и не агглютинируется сыворотками О, Инаба, Огава и RO.

Особые свойства штамма.

1. Продуцент полисахаридной капсулы. Штамм продуцирует полисахаридную капсулу в количествах, в 3-4 раза превышающих продукцию этого антигена у других штаммов серогруппы O139.

2. Авирулентен. Штамм не содержит генов токсигенности и не вирулентен для лабораторных животных.

3. Стабилен. Штамм стабильно продуцирует полисахаридную капсулу. Сущность изобретения подтверждается следующими примерами.

Пример 1. Определение вирулентности штамма методом ПЦР. Авирулентность штамма вызвана отсутствием в его составе генов токсигенности. Их отсутствие устанавливают с помощью полимеразной цепной реакции с праймерами на ген ctxA. Для этого клетки штамма выращивают в жидкой питательной среде при 37°С в течение 18 часов, лизируют кипячением и используют в концентрации 10⁷ кл/мл для исследования в ПЦР. Отсутствие специфического амплификата свидетельствует об отсутствии генов холерного токсина у изучаемого штамма и, следовательно, об отсутствии вирулентности у штамма КМ 169.

Пример 2. Определение вирулентности штамма на лабораторных животных. Заражение штаммом в дозе 10⁷ кл/мл крольчат-сосунков не приводит к развитию у них холерогенного эффекта, что свидетельствует о его авирулентности для лабораторных животных.

Пример 3. Определение продукции капсулы по морфологии колоний.

При выращивании на твердых питательных средах клетки, продуцирующие полисахаридную капсулу, образуют мутные колонии, в то время как у клеток, не образующих капсулу, колонии прозрачны. Заявляемый штамм образует на плотных

средах мутные колонии, что свидетельствует о его способности продуцировать полисахаридную капсулу.

Пример 4. Определение продукции капсулы с помощью электронной микроскопии методом негативного контрастирования.

Культуру клеток штамма КМ169, а также штаммов Р16064 и КМ115 суспендируют в физиологическом растворе до концентрации 2×10⁹ кл/мл. На поливинилформальдегидную сетку-подложку наносят капли взвеси клеток штаммов, которые фиксируют 2% оксидом осмия, обрабатывают фосфатным буфером и окрашивают 1,5% фосфорновольфрамовой кислоты или уранилацетатом. Просматривание в электронном микроскопе при инструментальном увеличении 8,3×10³ показывает, что все клетки штамма КМ 169 окружены мощным слоем полисахаридной капсулы. Его размеры в 3-4 раза превышают размеры капсулы у штаммов-аналогов (Р16064 и КМ115).

Пример 5. Определение продукции капсулы по чувствительности вибрионов к бактерицидному действию нормальной человеческой сыворотки (НЧС).

Клетки штамма КМ 169 выращивают в бульоне в течение 4-х часов и инкубируют с 65% НЧС. Устойчивость клеток штамма к бактерицидному действию НЧС свидетельствует о наличии у них полисахаридной капсулы.

Пример 6. Определение стабильности образования капсулы в популяции клеток штамма.

Штамм выращивают в жидкой питательной среде при 37°С в течение 2-3-х суток и рассевают на плотной питательной среде до образования изолированных колоний. Полученные колонии проверяют на продукцию капсулы. Изучение морфологии 500 колоний штамма показывает, что все они продуцируют капсульное вещество и, следовательно, штамм является стабильным продуцентом капсульного антигена.

Пример 7. Определение стабильности образования капсулы после длительного хранения в питательных средах.

Стабильность признака капсулообразования проверяется у штамма КМ169, хранившегося в течение года в полужидком питательном агаре. Для этого культура штамма из полужидкого питательного агара рассевается на твердой питательной среде до получения изолированных колоний. Изучение морфологии 500 колоний штамма показывает, что все они продуцируют капсульное вещество и, следовательно, штамм не утрачивает способность к стабильному образованию капсульного антигена после длительного хранения в питательных средах.

Таким образом, авирулентный штамм КМ169 является продуцентом полисахаридной капсулы. Он может быть успешно применен в производстве холерных химических вакцин против возбудителя холеры серогрупп O139 в качестве продуцента капсульного антигена. Преимущество штамма V.cholerae KM169 перед известными аналогами заключается в том, что он стабилен, авирулентен и имеет высокий уровень продукции полисахаридной капсулы, в 3-4 раза превышающий уровень образования этого антигена у других штаммов.

Изобретение относится к области биотехнологии. На основе авирулентного природного штамма V.cholerae серогруппы О139 методом поэтапной селекции клеток с повышенной продукцией капсулы получен авирулентный штамм - продуцент капсульного антигена, стабильно образующий в 3-4 раза больше антигена по сравнению с другими штаммами этой серогруппы. Штамм характеризуется высоким и стабильным уровнем продукции капсульного антигена, одного из компонентов химической холерной вакцины против возбудителя холеры О139 серогруппы.

Авирулентный штамм бактерий Vibrio cholerae серогруппы О139, коллекция РосНИПЧИ "Микроб" № КМ 169, продуцент капсульного антигена.