ИНДИКАТОРНАЯ СИСТЕМА ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНО-ДИАГНОСТИЧЕСКОЙ ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ ДЛЯ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ КИШЕЧНЫХ И УРОЛОГИЧЕСКИХ ИНФЕКЦИЙ Российский патент 1997 года по МПК C12Q1/04 

Изобретение относится к биотехнологии и касается рецептуры индикаторной системы, добавляемой в дифференциально-диагностическую питательную среду (ДДПС) для биохимической идентификации и выделения возбудителей кишечных и урологических инфекций.

Известна индикаторная система (ИС) ДДПС, используемая при биохимической идентификации возбудителей кишечных инфекций, включающая бромтимоловый синий и фуксин кислый (Справочник по микробиологическим питательным средам, Дагестанское книжное изд-во, Махачкала, 1989, с.68).

Однако использование этой ИС ограничено вторичной идентификацией возбудителей кишечных инфекций (при введении ее в питательную среду на основе гидролизата казеина или мяса), при этом из возбудителей кишечных инфекций идентифицируют лишь возбудитель псевдотуберкулеза, о чем сообщается в вышеуказанном источнике.

Известна также ИС ДДПС возбудителей кишечных инфекций, включающая бромтимоловый синий и кристаллический фиолетовый. Она используется в составе среды Калины К-2 для выделения клебсиелл и энтеробактеров (Ж. Микробиол. эпидемиол. и иммунобиол. 1980, 6, 28-32).

Для повышения чувствительности составы известных ИС, включающих бромтимоловый синий, дополнительно содержат один или несколько следующих субстратов: инозит, цитрат аммония, маланат натрия, рафиноза (Среды для выделения клебсиелл. ж. Микробиол. эпидемиол. и иммунобиол. 1985, 1, 19-22) или перхлорат диоксолания (авт.св. N 1306136, 1985).

Наиболее близкой к заявляемой является ИС ДДПС, включающая бромтимоловый синий и инозит. Данную ИС включают в рецептуру ДДПС при следующем соотношении ингредиентов:
питательный агар 100 мл;
инозит 1 г;
бромтимоловый синий 1 мл 1,5%-ного спиртового раствора
(Киселева М. Н. Янец Я.Н. Среда с инозитом для выделения клебсиелл. - "Лабораторное дело", 1976, N 6).

Недостаток данных ИС, включая прототип, заключается в низкой дифференциальной чувствительности, что не позволяет, в частности, дифференцировать инозит-позитивные микроорганизмы (ретгереллы, провиденции, цитробактер, серрации).

Целью изобретения является повышение дифференциальной чувствительности при одновременной индикации возбудителей различной родовой принадлежности на агаровой питательной среде.

Указанная цель достигается тем, что ИС, включающая инозит и бромтимоловый синий, дополнительно содержит 2,4-динитрофенол при следующем соотношении ингредиентов, мас. на единицу массы сухой основы питательной среды:
инозит 40±8
бромтимоловый синий 2,5±0,5
2,4-динитрофенол 0,08±0,02.

Предлагаемая пропись ИС отличается от известной по следующим признакам:
1. Введен новый ингредиент 2,4-динитрофенол.

2. Существенно изменено массовое соотношение инозита и бромтимолового синего, которое составляет 40:2,5=16, тогда как в прототипе это соотношение равно 1,5 (что вытекает из очевидного расчета по данным воспроизведенного описания прототипа, в котором сохранены размерности соотношения ингредиентов, указанные в его описании).

3. Установлены (в результате 2,5-летних исследований) заявленные соотношения других ингредиентов.

Обращаем внимание экспертизы на то обстоятельство, что для получения указанного положительного эффекта важно обеспечить не только приведенное соотношение ингредиентов ИС, но и соотношение масс ИС и сухой основы питательной среды. При этом сухая основа питательной среды может быть казеиново-дрожжевым гидролизатом, агаризованным гидролизатом криля и т.п. Именно поэтому заявлена не ДДПС, а ИС, соотношения ингредиентов которой даны по отношению к сухой питательной основе. Если же экспертиза сочтет введенную нами относительную размерность нецелесообразной, то ее можно исключить из формулы, поскольку справедливо, что массовое соотношение инозита, бромтимолового синего и 2,4-динитрофенола составляет 40:2,5:0,8 соответственно.

Новый ингредиент ИС 2,4-динитрофенол известен как индикатор pH (Лабинская А.С. Микробиология, М. "Медицина", 1982, 38-40). Мы предполагаем, что в составе предлагаемой ИС 2,4- динитрофенол оказывают ингибирующее действие на инозит-положительные микроорганизмы-возбудители кишечных и урологических инфекций, вследствие чего происходит неполное расщепление ими инозита, обуславливающее специфическую окраску колоний.

В результате испытаний установлено, что при инкубировании культур микроорганизмов-возбудителей кишечных и урологических инфекций на ДДПС с предлагаемой ИС их колонии имеют окраски, указанные в табл.1.

Пример 1. ИС, включающую инозит, бромтимоловый синий и 2,4-динитрофенол, добавляют к казеиново-дрожжевой ДДПС при следующем соотношении ингредиентов, г/л:
инозит 7,5;
бромтимоловый синий 0,5;
2,4-динитрофенол 0,015;
казеиново-дрожжевой гидролизат (КДГ) 19;
дистиллированная вода остальное.

Массовые доли ингредиентов ИС в процентах на 1 г сухой питательной основы (казеиново-дрожжевого гидролизата) составляют:
инозита 7,5:19•100=40%
бромтимолового синего 0,5:19•100=2,5%
2,4-динитрофенола 0,015:19•100=0,08.

Смесь выдерживают в течение 20 мин при комнатной температуре для набухания агара, затем кипятят 2-3 мин, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, охлаждают до 45^oC и разливают в чашки Петри, готовя таким образом испытуемую ДДПС.

Параллельно готовят две контрольные ДДПС, содержащие в качестве питательной основы сухой питательный агар на гидролизате кильки (СПАК), к которым добавляют предлагаемую ИС и ИС без 2,4-динитрофенола соответственно (содержание поименованных ингредиентов как в испытуемой ДДПС).

На полученные испытуемую и контрольные ДДПС высевают фекалии больных К, Н и Х и инкубируют при 37^oC в течение 1 сут.

Результаты визуального анализа выросших колоний приведены в табл.2.

Как видно из таблицы, испытуемый состав ИС обеспечивает наиболее высокую степень дифференциальной чувствительности и позволяет выделять идентифицируемые микроорганизмы без анализа на средах для вторичной идентификации.

Пример 2. ИС, включающую инозит, бромтимоловый синий и 2,4-динитрофенол, добавляют к сухому питательному агару на основе гидролиза криля (СПАКР) при следующем соотношении ингредиентов, г/л:
инозит 6,4;
бромтимоловый синий 0,4;
2,4-динитрофенол 0,012;
СПАКР 20;
магний сернокислый 0,5;
калий сернокислый 0,5;
дистиллированная вода остальное.

Массовые доли ингредиентов ИС в процентах на 1 г сухой питательной основы (казеиново-дрожжевого гидролизата) составляют:
инозита 6,4:20•100=32%
бромтимолового синего 0,4:20•100=2,0%
2,4-динитрофенола 0,012:20•100=0,06.

Смесь выдерживают в течение 20 мин при комнатной температуре для набухания агара, затем кипятят 2-3 мин, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, охлаждают до 45^oC и разливают в чашки Петри, готовя таким образом испытуемую ДДПС.

Аналогично готовят еще четыре ДДПС с тем же содержанием СПАКР, магния сернокислого и калия сернокислого, но при значениях ингредиентов ИС, указанных в табл. 3. В этой таблице приведены соотношения ингредиентов ИС всех 5 ДДПС.

Таким образом, в данном примере приведены прописи с минимальной (ДДПС N 2), максимальной (ДДПС N 4), оптимальной (ДДПС N 3) и запредельными (ДДПС N 1,5) концентрациями ингредиентов ИС.

На полученные ДДПС высевают фекалии больного Д (клиника НИИ проктологии) и инкубируют при 37^oC в течение 1 сут.

Результаты визуального анализа выросших колоний приведены в табл.4. Из таблицы видно, что предлагаемая ИС работает только в заявленных значениях концентраций ингредиентов, включая предъявленные, и не работает вне их.

Использование предлагаемой ИС по сравнению с прототипом позволяет повысить дифференциальную чувствительность при обследовании материалов с несколькими возбудителями кишечных и урологических инфекций. Особенно эффективно ее использовать при анализе смеси микробных культур, содержащих протей, поскольку введенная добавка (2,4-динитрофенол) в установленном диапазоне концентраций других ингредиентов подавляет "ползучий" рост протея. Об этом можно судить по примеру 1 (больной Н.). Достигнутый положительный эффект подтверждается прилагаемым актом испытания.

Использование: в биотехнологии и касается рецептуры индикаторной системы, добавляемой в дифференциально-диагностическую питательную среду для биохимической идентификации и выделения возбудителей кишечных и урологических инфекций. Сущность изобретения: предлагаемая индикаторная система содержит инозит, бромтимоловый синий и 2,4-динитрофенол. 4 табл.

Индикаторная система дифференциально-диагностической питательной среды для возбудителей кишечных и урологических инфекций, включающая инозит и бромтимоловый синий, отличающаяся тем, что дополнительно содержит 2,4-динитрофенол при следующем соотношении ингредиентов, мас. на 1 г сухой питательной основы:
Инозит 32 48
Бромтимоловый синий 2 3
2,4-Динитрофенол 0,06 1,00о