СПОСОБ ОСВЕТЛЕНИЯ ФЕРМЕНТНЫХ РАСТВОРОВ ГИДРОЛАЗ Российский патент 2005 года по МПК C12N9/14 

Изобретение относится к области биотехнологии и предназначено для удаления взвешенных частиц в растворах ферментных препаратов с целью их осветления перед процедурами ультрафильтрации, осаждения и адсорбционного выделения ферментов.

Известен способ получения галактаназного ферментного препарата Bacillus pumilus (прототип) [US 20030022347, 30.01.2003, C 12 N 009/40], включающий стадию осветления ферментного раствора с помощью коагуляции взвешенных частиц алюминатом натрия в присутствии катионных и анионных агентов.

Недостатком данного способа является низкая скорость осветления и существенное снижение активности ферментных растворов некоторых гидролаз в процессе очистки, что снижает выход целевого продукта.

Технический результат изобретения заключается в увеличении скорости осветления ферментных растворов и выхода целевого продукта по активности при равной степени осветления, а также в увеличении удельной активности ферментных препаратов гидролаз.

Технический результат достигается тем, что в качестве коагулирующего агента вместо алюмината натрия используют хлористый кальций в присутствии эквимолярного количества орто-фосфата натрия или калия в среде, близкой к нейтральной.

Способ осуществляют следующим образом: к раствору ферментного препарата добавляют раствор хлористого кальция в количестве 1,7-2,8 г/дм³ (0,015-0,025 моль/дм³) и эквимолярное количество раствора орто-фосфата натрия или калия с рН 6,0-7,0 для того, чтобы конечный рН раствора был равен 6,0-7,0. При этом в соответствии с уравнением реакции (1) происходит образование осадка гидрофосфата кальция (CaHPO₄), способствующего коагуляции взвешенных частиц и осветлению ферментного раствора:

где Kat - катион металла.

Ферментный раствор отстаивают в течение 1-2 часов, после чего отделяют от осадка декантацией и при необходимости дополнительно фильтруют через бумажный или полимерный фильтр. Степень осветления для сильно окрашенных растворов оценивают по их прозрачности П (см), за которую принимают максимальную высоту столбика раствора в цилиндре с прозрачным дном при котором еще различим шрифт №14. Степень осветления S (%) рассчитывают по формуле S=(П_к-П_н/П)×100%, где П_н и П_к - прозрачность раствора до и после осветления, П - прозрачность раствора, фильтрованного через полимерный фильтр.

Образование объемного осадка CaHPO₄ способствует соосаждению взвешенных частиц исходного ферментного раствора, что приводит к его осветлению. При этом осадок CaHPO₄ имеет более плотную структуру по сравнению с гидроокисью алюминия, образующейся при гидролизе алюмината натрия в нейтральной среде, что способствует увеличению скорости коагуляции.

В отличие от активной гидроокиси алюминия CaHPO₄ слабо адсорбирует высокомолекулярные белки, что способствует увеличению выхода целевого продукта.

Поскольку CaHPO₄ обладает низкими адсорбционными свойствами по отношению к белкам, на его поверхности происходит преимущественное связывание неактивных низкомолекулярных белков - олигопептидов, что приводит к увеличению удельной активности ферментного раствора, рассчитанной как отношение активности раствора (ед/см³) к общей концентрации белка (мг/см³).

Способ опробован на растворах ферментных препаратов Пектофоетидин Г3х, Целловиридин Г3х и Глюкаваморин Г3х. Сравнительные экспериментальные данные по применению способа приведены в примерах 1-4 и в таблице 1.

Пример 1 (прототип). К 1000 см³ растворов ферментных препаратов Пектофоетидин Г3х, Целловиридин Г3х и Глюкаваморин Г3х с концентрацией сухих веществ 10 г/дм³ добавляют эффективное количество щелочного раствора алюмината натрия с концентрацией 100 г/дм³ (20-30 см³). Доводят рН раствора до 6,5-7,0 добавлением 20%-ной серной кислоты и отстаивают растворы до осаждения активной гидроокиси алюминия и коагуляции ферментного раствора. После отделения раствора от осадка декантацией получают 800 см³ осветленного ферментного раствора.

Пример 2. К 1000 см³ растворов ферментных препаратов Пектофоетидин Г3х, Целловиридин Г3х и Глюкаваморин Г3х с концентрацией сухих веществ 10 г/дм³ добавляют в качестве коагулирующего агента 15 см³ 1 М раствора CaCl₂ (1,7 г/дм³) и равный объем 1 М раствора орто-фосфата натрия (калия) с рН 6,0-7,0. Растворы отстаивают до осаждения осадка СаНРО₄ и коагуляции ферментного раствора. После отделения раствора от осадка декантацией получают 800 см³ осветленного ферментного раствора.

Пример 3. К 1000 см³ растворов ферментных препаратов Пектофоетидин Г3х, Целловиридин Г3х и Глюкаваморин Г3х с концентрацией сухих веществ 10 г/дм³ добавляют 20 см³ 1 М раствора CaCl₂ (2,2 г/дм³) и равный объем 1 М раствора орто-фосфата натрия (калия) с рН 6,0-7,0. Растворы отстаивают до осаждения осадка CaHPO₄ и коагуляции ферментного раствора. После отделения раствора от осадка декантацией получают 800 см³ осветленного ферментного раствора.

Пример 4. К 1000 см³ растворов ферментных препаратов Пектофоетидин Г3х, Целловиридин Г3х и Глюкаваморин Г3х с концентрацией сухих веществ 10 г/дм³ добавляют 25 см³ 1 М раствора CaCl₂ (2,8 г/дм³) и равный объем 1 М раствора орто-фосфата натрия (калия) с рН 6,0-7,0. Растворы отстаивают до осаждения осадка CaHPO₄ и коагуляции ферментного раствора. После отделения раствора от осадка декантацией получают 800 см³ осветленного ферментного раствора.

Таблица 1Фермент/образецДоза коагулянта, г/дм³Время осаждения, часСтепень осветления, %Активность, ед/см³Содержание белка, мг/см³Удельная активность, ед/мг белкаВыход активности, %Пектофоетидин Г3х исходный---110,70,75147,6-пример 1 прототип2,02.051,09,80,4123,99,2пример 21,71,562,3112,10,68164,9104,3пример 32,21.078,6115,80,60193,0111,6пример 42,81,092,479,30,52152,575,2Целловирин Г3х исходный---8,52,104,04-пример 1 прототип3,0>5,091,71,70,662,5021,2пример 21,71,564,58,22,004,1099,3пример 32,21,076,27,61,784,2798,8пример 42.81,088,97,01,464,7986,5Глюкаваморин Г3х исходный---9,91,208,3-пример 1 прототип2,0>2,094,43,40,369,435,7пример 21,71.589,69,50,979,898,8пример 32,21,095,38,80,8510,492,1пример 42,81,097,86,70,739,271,1

Данные таблицы 1 показывают, что предлагаемое изобретение позволяет увеличить скорость осветления ферментных растворов и выход целевого продукта по активности при равной степени осветления, а также увеличить удельную активность ферментных препаратов по сравнению со способом-прототипом.

Изобретение относится к биотехнологии и предназначено для осветления ферментных растворов. Способ предусматривает коагуляцию при рН 6,0-7,0, осаждение взвешенных частиц путем добавления к ферментному раствору хлористого кальция в количестве 0,015-0,025 моль/дм³ и эквимолярного количества орто-фосфата натрия или калия. Изобретение позволяет увеличить скорость осветления ферментных растворов и выхода целевого продукта, увеличить удельную активность ферментных препаратов гидролаз. 1 табл.

Способ осветления ферментных растворов гидролаз, включающий коагуляцию и осаждение взвешенных частиц, отличающийся тем, что для коагуляции используют хлористый кальций в количестве 0,015-0,025 моль/дм³ и эквимолярное количество орто-фосфата натрия или калия, при этом коагуляцию проводят при рН 6,0-7,0.