СПОСОБ ПОСТАНОВКИ РЕАКЦИИ АГГЛЮТИНАЦИОННОГО ИММУНОЛОГИЧЕСКОГО АНАЛИЗА Российский патент 2002 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к области биотехнологии, иммунохимии и медицины, может быть использовано в диагностике различных инфекционных и соматических патологий. При этих заболеваниях в организме больного возникают антитела, комплиментарные антигенам, лежащим в основе патогенеза заболевания.

Эти антитела и антигены могут обнаруживаться в периферической крови, однако до настоящего времени не созданы диагностические препараты, отличающиеся стабильностью иммунохимических свойств и позволяющие осуществлять данную реакцию бесприборно. Отсутствуют надежные и простые методы для скрининговых исследований больных и населения, относящихся к группам риска, что важно для коррекции терапии и определения прогноза заболевания.

Цель изобретения - разработка бесприборного экспресс-метода для определения наличия и вида антител и антигенов - маркеров различных нозологий, снижение времени для постановки анализа, расширение сырьевой базы для этого способа.

Аналогом данного метода является способ определения различных антигенов либо антител путем мечения одного из компонентов: антигенов либо комплиментарных им антител, именуемых в дальнейшем биолигандами, различными метками - радиологическими, ферментными, флуоресцентными, эритроцитарными [1, 2].

Аналогом данного метода является способ определения антител против вируса клещевого энцефалита в сыворотке крови с помощью реакции непрямой гемагглютинации [3].

Аналогом данного метода является также способ определения антирезусных антител при аутоиммунной гемолитической анемии [3] с помощью прямой реакции гемагглютинации [4].

Аналогом данного метода является способ определения наличия противомозговых антител в сыворотке крови [5] при помощи реакции гидрозольной агглютинации, с использованием оксида железа (III) в качестве основы гидрозоля.

Аналогом данного метода является способ постановки агглютинационного иммунохимического анализа с использованием дисперсных препаратов типа гидрозолей [6] в буферных растворах, содержащих ПАВ.

Аналогом данного метода является способ постановки агглютинационного иммунохимического анализа, описанный в [7], где проводится постановка гидрозолей в емкостях, покрытых антифрикционными материалами.

Аналогом данного метода является способ постановки аглютинационного иммунологического анализа, где в качестве модификаторов дисперсных твердых фаз гидрозолей используются нитрозосоединения либо бензохинины [8].

Прототипом данного технического решения является способ постановки реакции иммунологического агглютинационного анализа, описанный в [9].

Данный способ постановки реакции агглютинационного иммунологического анализа включает проведение данных реакций с использованием эритроцитов, сорбированных биолигандом, латексов и других дисперсных веществ в 0,9% растворе хлорида натрия, именуемом физиологическим раствором.

Недостатками прототипа можно считать:
1. Недостаточную чувствительность агглютинационного иммунологического анализа;
2. Недостаточную скорость вышеназванного анализа.

Указанные недостатки преодолеваются, если в качестве водного солевого раствора используются растворы для разведения биологических жидкостей, солей металлов II группы главной подгруппы Периодической системы Д.И. Менделеева.

Эти элементы - магний, кальций, стронций и барий - образуют водорастворимые соли, например нитраты, галогениды и т.д. [10].

Применение растворов солей указанных металлов по данному новому назначению ранее описано не было.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения.

Пример 1.

Осуществляют нагружение гидрозоля оксида железа (III) генно-инженерными сифилисными антигенами по способу [8]. Далее осуществляют постановку иммунологической агглютинационной реакции в физиологическом растворе (ФР) - 0,9% NaCl (прототип) и в заявляемом варианте - растворе сульфата магния разной концентрации.

Собственно иммунологические реакции приводят известными методами [3, 4, 7].

В лунках планшета разводятся сыворотки, именуемые далее биологической жидкостью. Сыворотки получают путем взятия небольшого (не более 0,1 мл) объема крови. Полученная кровь центрифугируется для осаждения форменных элементов. Допускается получение крови венепункцией либо капиллярным взятием. Последующие разведения "положительной" и "отрицательной" сывороток в титрах от 1:2 до 1:1280 путем разбавления и "положительной" и "отрицательной" сывороток буферным раствором производят таким образом, чтобы объем подлежащего титрованию биопрепарата в лунке составил 50 мкл. Затем в каждое разведение добавляется 50 мкл гидрозольного препарата оксида железа прототипа. После инкубации в течение часа при комнатной температуре производится визуальная оценка реакции либо микроскопия осадка. Положительной реакцией иммунологического агглютинационного анализа считается наличие агглютинации в разведении 1:2 и выше. Результаты данного эксперимента представлены в таблице 1.

Из представленных данных видны преимущества заявляемого решения в сравнении с прототипом, обоснованы количественные пределы по содержанию сульфата магния.

Пример 2.

Осуществуют нагружения гидрозоля гидроокиси железа (III) антителами к хорионическому гонадотропину человека. Образцы биологических жидкостей и дисперсий гидроокиси железа (III) - гидрозоли разводят в физиологическом растворе - прототип, и растворах хлорида кальция CaCl₂ разной процентной концентрации.

Далее осуществляют постановку иммунологической агглютинационной реакции в прототипе и в заявляемом решении аналогично примеру 1. Результаты данного эксперимента представлены в таблице 2.

Из представленных данных видны преимущества заявляемого решения в сравнении с прототипом; обоснованы количественные пределы по содержанию хлорида кальция.

Пример 3
Осуществляют нагружение гидрозоля гидроксида цинка антителами против миоглобина. Далее осуществляют постановку иммунологической агглютинационной реакции в физиологическом растворе (ФР) - 0,9 NaCl (прототип) и в заявляемом варианте - растворе иодида стронция разной концентрации. Далее осуществляют постановку реакции аналогично примеру 1. Результаты данного эксперимента представлены в таблице 3.

Из представленных данных видны преимущества заявляемого технического решения в сравнении с прототипом; обоснованы количественные пределы по содержанию иодида стронция.

Пример 4.

Осуществляют нагружение гидрозоля частиц оксида меди (II) антителами против поверхностного антигена рака молочной железы. Далее осуществляют постановку иммунологического агглютинационного анализа в физиологическом растворе (ФР) - 0,9% NaCl (прототип) и в заявляемом варианте - растворе хлорида бария разной концентрации. Далее осуществляют постановку аналогично примеру 1. Результаты эксперимента представлены в таблице 4.

Из представленных данных видны преимущества заявляемого решения в сравнении с прототипом, обоснованы количественные пределы по содержанию хлорида бария.

Пример 5.

Осуществляют нагружение гидрозоля на основе гидроксида меди (II) генно-инженерными антигенами возбудителя сифилиса. Образцы биологических жидкостей и гидрозоля гидроксида меди (II) разводят в физрастворе (прототип) и в хлоридах магния 1%; кальция 1%, стронция % и бария 1% - заявляемое решение. Далее осуществляют постановку аналогично примеру 1. Результаты реакции представлены в таблице 5.

Таким образом, из представленных примеров ясно видны преимущества технического решения по сравнению с прототипом в плане обеспечения большей чувствительности иммунологического агглютинационного анализа и существенно меньшего времени на его постановку.

Представленные результаты указывают на возможность использования предложенного способа в диагностике наличия титра и динамических изменений уровня специфических антигенов и антител, связанных с той или иной конкретной нозологической единицей. Полученные данные могут иметь важное значение в скрининговой диагностике, определении прогноза заболевания и коррекции лечения, а также в плане бесприборных тестов непосредственно у постели больного, на поликлиническом приеме и т.д.

Источники информации
1. Ройт А. Основы иммунологии. - М.: Мир, 1991. - С. 91-93.

2. Покровский В.И. Руководство по иммунологии инфекционного процесса. - Москва, 1994. - С. 230.

3. Никитин В.М. Справочник методов иммунологии. Кишинев, 1982. - 304 с.

4. Никитин В.М. Справочник методов иммунологии. - Кишинев, 1982. - 304 с.

5. Кислицын Ю.В., Мешандин А.Г. Российский патент 2138814 от 27.02.1999 г.

6. Мешандин А.Г. Российский патент 2130613 от 20.05.1999 г.

7. Мешандин А.Г. Российский патент 2154827 от 20.08.2000 г.

8. Мешандин А.Г. Российский патент 2154826 от 20.08.2000 г.

9. Вязов О. Г. Лабораторные методы исследования в неинфекционной иммунологии. Москва, 1967. С. 76-78 - прототип.

10. Некрасов Б.В. Основы общей химии. Москва, 1967 г., Т 2. С. 314-317.

Изобретение относится к области биотехнологии, иммунохимии и медицины и может быть использовано в диагностике различных инфекционных и соматических заболеваний Способ постановки реакций агглютинационного иммунохимического анализа включает разведение гидрозольных препаратов в подлежащих тестированию образцах биологического материала в водном солевом растворе, при этом в качестве раствора используют растворы солей металлов II группы главной подгруппы Периодической системы Д.И.Менделеева. Технический результат: разработан бесприборный экспресс-метод для определения наличия и вида антител и антигенов, позволяющий снизить время для постановки анализа при определении прогноза заболевания и коррекции лечения, а также позволяющий расширить сырьевую базу для этого вида анализа. 5 табл.

Способ постановки реакций агглютинационного иммунохимического анализа, включающий разведение гидрозольных препаратов в подлежащих тестированию образцах биологического материала в водном солевом растворе, отличающийся тем, что в качестве раствора используют растворы солей металлов II группы главной подгруппы Периодической системы Д. И. Менделеева.