СПОСОБ АГГЛЮТИНАЦИОННОГО ИММУНОЛОГИЧЕСКОГО АНАЛИЗА Российский патент 2001 года по МПК G01N33/551 G01N33/53 

Изобретение относится к области биотехнологии и медицины, может быть использовано в диагностике различных инфекционных и соматических патологий. При этих заболеваниях в организме больного возникают антитела, комплементарные антигенам, лежащим в основе патогенеза заболевания.

Эти антитела и антигены могут обнаруживаться в периферической крови, однако до настоящего времени не созданы диагностические препараты, отличающиеся стабильностью иммунохимических свойств и позволяющие осуществлять данную реакцию бесприборно. Отсутствуют надежные и простые методы для скрининговых исследований больных и населения, относящихся к группам риска, что важно для коррекции терапии и определения прогноза заболевания.

Цель изобретения - разработка бесприборного экспресс-метода для определения наличия и вида антител и антигенов - маркеров различных нозологий, увеличение чувствительности анализа, снижение времени постановки анализа.

Аналогом данного метода является способ определения различных антигенов либо антител путем мечения одного из компонентов: антигенов либо комплиментарных им антител, именуемых в дальнейшем биолигандами, различными метками - радиологическими, ферментными, флуоресцентными, эритроцитарными [1], латексными [2].

Аналогом данного метода является способ определения антител против вируса клещевого энцефалита в сыворотке крови с помощью реакции непрямой гемагглютинации [3].

Аналогом данного метода является также способ определения антирезусных антител при аутоиммунной гемолитической анемии [4] с помощью прямой реакции гемагглютинации.

Аналогом данного метода является способ постановки агглютинационного иммунологического анализа при помощи гидрозолей [5] ультрадисперсных частиц неорганической природы, например оксида железа (III), Fe₂O₃, на поверхности которых адсорбированы антигены либо антитела.

Прототипом данного технического решения является способ постановки агглютинационного иммунохимического анализа, описанный в [6].

Данный способ предусматривает приготовление взвеси оксида железа (III) Fe₂O₃ в буферном растворе, составленном из пары: органическая кислота, например уксусная, и ее соль с каким-либо сильным основанием, например, ацетатом натрия согласно этому способу, приготавливают соответствующие буферные растворы, например уксусная кислота-ацетат натрия с pH от 4,0 до 5,0. Далее осуществляют диспергирование в данном буфере: в 2 мл его 50 мг оксида железа. Оксид железа (III) инкубируют в данном буфере, по меньшей мере, 12 часов для предактивации. При этом поверхность окиси железа модифицируется в кислой среде и становится катионнообменником. После этот вводят подлежащей сорбции биолиганд, антигены либо антитела и сорбируют по механизму ионной адсорбции [5] в течение 1 до 24 часов в зависимости от природы искомого биолиганда. По завершении сорбции осуществляют отмывку препарата оксида железа с сорбированными биоспецифическими препаратами от несвязавшихся биолигандов - антигенов (антител) путем многократных промывок тем же самым буфером с последующим центрифугированием, удалением надосадка и ресуспендированием в том же самом буфере на основе карбоновой кислоты и ее соли. Полученный препарат именуют гидрозолем, например гидрозолем оксида железа (III) с сорбированным на нем туберкулезным антигеном для детекции комлементарных антител против антигенов M.tyberculosis в биологических жидкостях человека.

Далее осуществляют инкубацию гидрозоля с исследуемой пробой биожидкости, например сыворотки крови, и определение содержания по агглютинации частиц в последнем разведении с использованием фосфатно-солевого [6] буферного раствора с pH от 6,8 до 7,6.

Недостатками прототипа можно считать:
1. Многоэтапность и длительность приготовления реагентов.

2. Недостаточную чувствительность агглютинационного иммунологического анализа.

Указанные недостатки преодолеваются, если в качестве дисперсных твердых фаз для последующей сорбции биоспецифических препаратов (биолигандов) используют дисперсные препараты, имеющие в своем составе неорганические катионы, образующие гидрозоли, и в качестве таковых используют или катионы металлов, склонные к комплексообразованию, или обладающие амфотерными свойствами [7].

Указанные катионы используют для синтеза различных неорганических солей [8].

Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения.

Пример 1
Осуществляют сорбцию биолигандов на дисперсном препарате окиси железа (III) Fe₂O₃ - прототип и CnO - склонных к комплексообразованию. В качестве биолиганда используют противокоревой γ-глобулин (его F_c-фрагмент) по прототипу и по предлагаемому способу. В случае прототипа используют буферный раствор из уксусной кислоты и ацетата натрия для ионной модификации поверхности окиси железа, с последующей постановкой реакции агглютинации в фосфатно-солевом буфере pH 6,8-7,6.

Синтез иммунологического препарата по заявляемому решению проводят путем сорбции γ -глобулина на оксиде меди в течение 2 часов; а по прототипу - в течение 2 часов. Реакции гидрозольной агглютинации в обоих случаях - прототип и заявляемое решение - осуществляют в фосфатно-солевом буфере. Эти реакции проводят в лунках планшета со скошенным дном при наличии "положительной" и "отрицательной" сывороток. В лунках планшета разводятся сыворотки, именуемые биологической жидкостью. Сыворотки получают путем взятия небольшого (не более 0,1 мл) объема крови. Полученная кровь центрифугируется для осаждения форменных элементов. Допускается получение крови венепункцией либо капиллярным взятием. Последующие разведения "положительной" и "отрицательной" сывороток в титрах от 1:2 до 1:1280 путем разбавления и "положительной", и "отрицательной" сывороток буферным раствором производят таким образом, чтобы объем подлежащего титрованию биопрепарата в лунке составил 50 мкл. Затем в каждое разведение добавляется 50 мкл гидрозольного препарата оксида железа с сорбированным γ-глобулином. После инкубации в термостате при 37^oC в течение 20 минут производится визуальная оценка реакции либо микроскопия осадка. Положительной реакцией иммунологического агглютинационного анализа считается наличие агглютинации в разведении 1:2 и выше. Результаты данного эксперимента представлены в таблице 1.

Из представленного примера видно преимущество заявляемого решения в сравнении с прототипом по обеспечению большей чувствительности реакции.

Пример 2
Осуществляют нагружение частиц оксида железа (III) (прототип) и частиц: оксида меди (CuO) - склонных к комплексообразованию, оксида алюминия (Al₂O₃) - амфотерных, оксида хрома (Cr₂O₃) - склонных к комплексообразованию - дифтерийным анатоксином. В остальном методики нагружения и последующей постановки анализа не отличаются от таковых как в примере 1. Результаты данного эксперимента представлены а таблице 2.

Пример 3
Осуществляют нагружение частиц оксида железа (прототип) и частиц оксида меди, гидроксида меди, оксида кобальта - все склонны к комплексообразованию - моноклональными антителами против поверхностного антигена рака молочной железы. В остальном методики нагружения и последующей постановки анализа не отличаются от таких как в примерах 1-2. Результаты представлены в таблице 3.

Пример 4
Осуществляют нагружение частиц оксида железа (прототип) и частиц оксида меди, оксида алюминия, оксида хрома, фракцией 1 из вакцинного штамма EV-микроба. В остальном методики нагружения и последующей постановки анализа не отличаются от таковых как в примерах 1-3. Опытные данные представлены в таблицы 4.

Таким образом, из представленных примеров ясно видны преимущества технического решения по сравнению с прототипом в плане обеспечения большей чувствительности иммунологического агглютинационного анализа. Наряду с этим обеспечивается расширение сырьевой базы: дисперсные препараты оказывается возможным изготавливать не только на оксиде железа, но и на основе других неорганических оксидов и гидроксидов.

Представленные результаты указывают на возможность использования предложенного способа в диагностике наличия титра и динамических изменений уровня специфических антигенов и антител, связанных с той или иной конкретной нозологической единицей. Полученные данные могут иметь важное значение в скрининговой диагностике, определении прогноза заболевания и коррекции лечения.

ЛИТЕРАТУРА
1. Ройт А. Основы иммунологии. -М.: Мир, 1991. -С. 91-93.

2. Ред. Покровский В.И. Иммунология инфекционного процесса. -М: Медицина, 1994 -с. 230.

3. Никитин В.М. Справочник методов иммунологии. -Кишинев, 1982. -304 с.

4. Никитин В.М. Справочник методов иммунологии. Кишинев, 1982. 304 с.

5. Мешандин А Г. Физико-химические аспекты сорбционных процессов при синтезе твердофазных биолигандов. М., 1994. -С. 31-34.

6. R.U. 2044320 C1. 20.09.1995 г.

7. Слесарев В.И. Основы химии живого. -С.Петербург, 2000. -с. 344-355.

8. Карякин Ю.В., Ангелов И.И. Чистые химические вещества. -М. 1974 -407 с.

Изобретение относится к иммунологии и биотехнологии, а именно к способу агглютинационного анализа. Сущность изобретения состоит в том, что способ включает проведение агглютинационного иммунологического анализа в присутствии гидродолей, имеющих в своем составе неорганические катионы, в качестве которых используют катионы металлов, склонные к комплексообразованию, или обладающих алифотерными свойствами. Преимущество изобретения состоит в повышении чувствительности способа. 4 табл.

Способ агглютинационного иммунологического анализа при помощи нерастворимых в воде дисперсных гидрозольных препаратов, имеющих в своем составе неорганические катионы, включающий сорбцию биоспецифических лигандов на поверхность гидрозолей, последующее соединение гидрозоля с подлежащей тестированию биологической жидкостью и оценку результатов анализа, отличающийся тем, что в качестве неорганических катионов, образующих гидрозоли, используют катионы металлов или склонные к комплексообразованию, или обладающие амфотерными свойствами.