СПОСОБ АГГЛЮТИНАЦИОННОГО ИММУНОЛОГИЧЕСКОГО АНАЛИЗА Российский патент 2001 года по МПК G01N33/551 

Изобретение относится к области биотехнологии и медицины, может быть использовано в диагностике различных инфекционных и соматических патологий. При этих заболеваниях в организме больного возникают антитела, комплементарные антигенам, лежащим в основе патогенеза заболевания.

Эти антитела и антигены могут обнаруживаться в периферической крови, однако до настоящего времени не созданы диагностические препараты, отличающиеся стабильностью иммунохимических свойств и позволяющие осуществлять данную реакцию бесприборно. Отсутствуют надежные и простые методы для скрининговых исследований больных и населения, относящихся к группам риска, что важно для коррекции терапии и определения прогноза заболевания.

Цель изобретения - разработка бесприборного экспресс-метода для определения наличия и вида антител и антигенов - маркеров различных нозологий, увеличение чувствительности анализа, снижение времени постановки анализа.

Аналогом данного метода является способ определения различных антигенов либо антител путем мечения одного из компонентов: антигенов либо комплиментарных им антител, именуемых в дальнейшем биолигандами, различными метками - радиологическими, ферментными, флуоресцентными, эритроцитарными [1], латексными [2].

Аналогом данного метода является способ определения антител против вируса клещевого энцефалита в сыворотке крови с помощью реакции непрямой гемагглютинации [3].

Аналогом данного метода является также способ определения антирезусных антител при аутоиммунной гемолитической анемии [4] с помощью прямой реакции гемагглютинации.

Аналогом данного метода является способ постановки агглютинационного иммунологического анализа при помощи гидрозолей [5], ультрадисперсных частиц неорганической природы, например оксида железа (III), Fe₂O₃, на поверхности которых адсорбированы антигены, либо антитела.

Прототипом данного технического решения является способ постановки агглютинационного иммунохимического анализа, описанный в [6].

Данный способ предусматривает приготовление взвеси оксида железа (III) Fe₂O₃ в буферном растворе, составленном из пары: органическая кислота, например уксусная, и ее соль с каким-либо сильным основанием, например ацетатом натрия, согласно этому способу приготавливают соответствующие буферные растворы, например, уксусная кислота - ацетат натрия с pH от 4,0 до 5,0. Далее осуществляют диспергирование в данном буфере: в 2 мл его 50 мг оксида железа. Оксида железа (III) инкубируют в данном буфере, по меньшей мере, 12 часов для предактивации. При этом поверхность оксида железа модифицируется в кислой среде и становится катионообменником. После этого вводят подлежащий сорбции биолиганд; антигены либо антитела и сорбируют по механизму ионной адсорбции [5] в течение от 1 до 24 часов в зависимости от природы искомого биолиганда. По завершении сорбции осуществляют отмывку препарата оксида железа с сорбированными биоспецифическими препаратами от не связавшихся биолигандов - антигенов (антител) - путем многократных промывок тем же самым буфером с последующим центрифугированием, удалением надосадка и ресуспендированием в том же самом буфере на основе карбоновой кислоты и ее соли. Полученный препарат именуют гидрозолем, например гидрозолем оксида железа (III), с сорбированным на нем туберкулезным антигеном для детекции комлементарных антител против антигенов M. tyberculоsis в биологических жидкостях человека.

Далее осуществляют инкубацию гидрозоля с исследуемой пробой биожидкости, например сыворотки крови, и определение содержания по агглютинации частиц в последнем разделении с использованием фосфатно-солевого [6] буферного раствора с pH от 6,8 до 7,6.

Недостатками прототипа можно считать:
1. Многоэтапность и длительность приготовления реагентов;
2. Недостаточную чувствительность агглютинационного иммунологического анализа;
3. Длительное время учета результатов анализа.

Указанные недостатки преодолеваются, если в качестве дисперсных твердых фаз для последующей сорбции биоспецифических препаратов (биолигандов) используют дисперсные препараты: частицы оксидов, гидроксидов, фосфатов, солей карбоновых кислот металлов, поверхность которых модифицируют растворимыми солями металлов, содержащих d-электронный слой Периодической системы элементов Д.И. Менделеева [7].

Указанные модификаторы используют в официальной фармакопее в качестве добавок к поливитаминам [8] (цинковая, медная соли), специфических антидотов при отравлениях красным фосфором [9], примочек (соли висмута и свинца) [10], специфических дезинфектантов хирургического инструментария [10] (соли ртути). Использование этих водорастворимых солей в качестве модификаторов гидрозольных частиц ранее описано не было.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения.

Пример 1.

Осуществляют сорбцию биолигандов на дисперсном препарате окиси железа (III) Fe₂O₃. В качестве биолиганда используют противокоревой γ-глобулин (его F_с-фрагмент) по прототипу и по предлагаемому способу. В случае прототипа используют буферный раствор из уксусной кислоты и ацетата натрия для ионной модификации поверхности окиси железа, с последующей постановкой реакции агглютинации в фосфатно-солевом буфере pH 6,8-7,6.

Синтез иммунохимического препарата по заявляемому способу осуществляют с использованием сульфата меди, ацетата ртути, ацетата свинца, нитрата висмута, хлорида хрома, нитрата марганца, хлорида кобальта. Все заявляемые модификаторы - соли - содержат d-электронный слой в катионах своих валентных оболочек. Реакции гидрозольной агглютинации здесь также осуществляют в фосфатно-солевом буфере. Эти реакции проводят в лунках планшета со скошенным дном при наличии "положительной" и "отрицательной" сывороток. В лунках планшета разводятся сыворотки, именуемые биологической жидкостью. Сыворотки получают путем взятия небольшого (не более 0,1 мл) объема крови. Полученная кровь центрифугируется для осаждения форменных элементов. Допускается получение крови венепункцией либо капиллярным взятием. Последующие разведения "положительной" и "отрицательной" сывороток в титрах от 1:2 до 1:1280 путем разбавления и "положительной", и "отрицательной" сывороток буферным раствором производят таким образом, чтобы объем подлежащего титрованию биопрепарата в лунке составил 50 мкл. Затем в каждое разделение добавляется 50 мкл гидрозольного препарата оксида железа с сорбированным γ-глобулином. После инкубации в термостате при 37^oC в течение 20 минут производится визуальная оценка реакции либо микроскопия осадка. Положительной реакцией иммунологического агглютинационного анализа считается наличие агглютинации в разведении 1:2 и выше. Результаты данного эксперимента представлены в таблице 1.

Из представленного примера видны преимущества заявляемого технического решения в сравнении с прототипом по большей чувствительности реакции и меньшему времени ее постановки.

Пример 2.

Осуществляют сорбцию биолигандов на дисперсном препарате окиси железа Fe₂O₃, как в примере 1. В качестве модификаторов используют те же соли, в качестве биолигандов - дифтерийный анатоксин и аффинно-очищенные мылистые антитела против раково-эмбрионального антигена. В остальном, методики нагружения и последующей постановки анализа не отличаются от таковых, как в примере 1. Результаты данного эксперимента представлены в таблице 2.

Пример 3.

Осуществляют сорбцию биолигандов на дисперсном препарате гидроксида железа (III) аналогично примерам 1, 2, по прототипу и по предлагаемому способу. В качестве модификаторов используют соединения аналогичные примерам 1, 2; в качестве биолиганда используют антиген туберкулезный ППД в стандартном разведении. Результаты данного эксперимента представлены в таблице 3.

Пример 4.

Осуществляют синтез гидрозолей на основе оксалата кальция по прототипу и по предлагаемому способу, аналогично вышерассмотренным примерам 1-3. В качестве биоспецифических лигандов используют мышиный антикроличий иммуноглобулин, кардиолипиновый антиген и дифтерийный анатоксин. Сама постановка реакции агглютинации по прототипу и по предлагаемому способу не отличается от примеров 1-3. Результаты эксперимента представлены в таблице 4.

Пример 5.

Осуществляют адсорбцию на дисперсных частицах фосфата кальция человеческим γ-глобулином (его F_с-фрагментом). В качестве модификаторов используют соли d-элементов меди и ртути, а также соли металлов, не содержащих d-электронов: хлорида натрия и лития, нитраты калия и кальция, результаты эксперимента представлены в таблице 5; из анализа этих данных видно, что отсутствие d-валентных электронов не приводит к удовлетворительным результатам по чувствительности и специфичности.

Таким образом, из представленных примеров ясно видны преимущества технического решения по сравнению с прототипом в плане обеспечения большей чувствительности иммунологического агглютинационного анализа и меньшего времени на его постановку. Наряду с этим обеспечивается расширение сырьевой базы: дисперсные препараты оказывается возможным изготавливать не только на оксиде железа, но и на гидроксидах, фосфатах и солях карбоновых кислот.

Представленные результаты указывают на возможность использования предложенного способа в диагностике наличия титра и динамических изменений уровня специфических антигенов и антител, связанных с той или иной конкретной нозологической единицей. Полученные данные могут иметь важное значение в скрининговой диагностике, определении прогноза заболевания и коррекции лечения.

Литература
1. Ройт А. Основы иммунологии. - М.: Мир, 1991. - С. 91-93.

2. Ред. Покровский В.И. Иммунология инфекционного процесса. - М.: Медицина, 1994. - С. 230.

3. Никитин В.М. Справочник методов иммунологии. - Кишинев, 1982. - 304 с.

4. Никитин В.М. Справочник методов иммунологии. - Кишинев, 1982. - 304 с.

5. Мешандин А.Г. Физико-химические аспекты сорбционных процессов при синтезе твердофазных биолигандов. - М., 1994. - С. 31-34.

6. R.U. 2044320 C1. 20.09.1995 г.

7. Слесарев В.И. Основы химии живого. - С.Петербург, 2000. - с. 344-355.

8. Машковский М.Д. Лекарственные средства (т. 2). - М.: 1993 - с. 8-18.

9. Ред. Закусов В.В. Клиническая фармакология - М.: Медицина. 1978 - с. 334.

10. Беликов В.Г. Фармацевтическая химия. - М.: Высшая школа. 1985 - с. 250-257.

Изобретение относится к биотехнологии и касается способа агглютинационного иммунологического анализа. Сущность изобретения: включает модификацию поверхностей гидрозолей, имеющих в своем составе органические катионы, растворимыми солями металлов, содержащих d-электронный слой Периодической системы элементов Д.И. Менделеева, сорбцию биоспецифических лигандов на их поверхности, последующие соединения гидрозоля с подлежащей тестированию биологической жидкостью и оценку результатов анализа. Преимущество изобретения состоит в повышении чувствительности проведения анализа. 5 табл.

Способ агглютинационного иммунологического анализа при помощи не растворимых в воде гидрозольных дисперсных препаратов, имеющих в своем составе неорганические катионы, включающий модификацию поверхности гидрозолей, сорбцию биоспецифических лигандов на их поверхность, последующее соединение гидрозоля с подлежащей тестированию биологической жидкостью и оценку результатов анализа, отличающийся тем, что в качестве модификаторов используют растворимые соли металлов, содержащие d-электронный слой Периодической системы элементов Д.И. Менделеева.