СПОСОБ ПОСТАНОВКИ АГГЛЮТИНАЦИОННОГО ИММУНОЛОГИЧЕСКОГО АНАЛИЗА Российский патент 2000 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к области биотехнологии и медицины, может быть использовано в диагностике различных инфекционных и соматических патологий. При этих заболеваниях в организме больного возникают антитела, комплементарные антигенам, лежащим в основе патогенеза заболевания.

Эти антитела и антигены могут обнаруживаться в периферической крови, однако, до настоящего времени не созданы диагностические препараты, отличающиеся стабильностью иммунохимических свойств и позволяющие осуществлять данную реакцию бесприборно. Отсутствуют надежные и простые методы для скрининговых исследований больных и населения, относящихся к группам риска, что важно для коррекции терапии и определения прогноза заболевания.

Цель изобретения - разработка экспресс-метода для определения наличия вида антител и антигенов - маркеров различных нозологий, увеличение чувствительности анализа, расширение сырьевой базы для этого способа.

Аналогом данного метода является способ определения различных антигенов либо антител путем лечения одного из компонентов; антигенов либо комплементарных им антител, именуемых в дальнейшем биолигандами, различными метками - радиологическими, ферментными, флуоресцентными, эритроцитарными [1].

Аналогом данного метода является способ определения антител против вируса клещевого энцефалита в сыворотке крови с помощью реакции непрямой гемагглютинацни [2].

Аналогом данного метода является также способ определения антирезусных антител при аутоиммунной гемолитической анемии [3] с помощью прямой реакции гемагглютинации [4].

Прототипом данного технического решения является способ постановки агглютинационного иммунохимического анализа, описанный в [4]. Данный способ постановки агглютинационного иммунологического анализа, включающий постановку реакции агглютинации с использованием оксидов, гидроксидов, фосфатов и солей карбоновых кислот металлов с сорбированными на их поверхности биоспецифическими лигандами путем соединения последних с биологическими жидкостями, имеет ряд недостатков.

Недостатками прототипа можно считать:
1) многоэтапность и длительность приготовления реагентов;
2) нестойкость приготовленных реагентов в связи с низким значением pH исходного буферного раствора;
3) недостаточную чувствительность агглютинационного иммунологического анализа.

Указанные недостатки преодолеваются, если в качестве дисперсных твердых фаз для последующей сорбции биоспецифических препаратов (биолигандов) используют дисперсные препараты: частицы оксидов, гидроксидов, фосфатов, солей карбоновых кислот металлов, которые перед сорбцией биоспецифических препаратов (биолигандов) модифицируют соединениями общей формулы:
R-(X=O)_n,
где X - азот, углерод, R - ароматический радикал, n = 1-2.

Указанные соединения в случае X = азот представляют собой ароматические нитрозопроизводные [5] . В случае X = углерод эти соединения представляют собой хиноны [6] . Ароматические нитрозопроизводные и хиноны используют в анилокрасочной промышленности в качестве промежуточных продуктов в производстве различных красителей. Применение их в качестве модификаторов твердых фаз при агглютинационном иммунохимическом анализе ранее описано не было. Оксиды, гидроксиды, фосфаты, соли карбоновых кислот объединены общим понятием "дисперсные препараты" [7], т.к. для них характерны нерастворимость в воде и водных буферных растворах и дисперсность, позволяющая проводить агглютинацию в требуемом практикой временном интервале от 20 мин до 1 ч.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения.

Пример 1
Осуществляют нагружение частиц оксида железа (Fe₂O₃) по прототипу и по предлагаемому способу. В качестве модификаторов используют нитрозобензол (НБ), динитрозобензол (ДНБ), бензохинон (БХ) и нафтохинон (ИХ). В качестве биолигандов используют противокоревой γ-глобулин человека, туберкулезный антиген и антитела к поверхностному антигену рака молочной железы. Результаты эксперимента представлены в табл. 1.

Пример 2
Осуществляют нагружение частиц гидроокиси меди по прототипу и по предлагаемому способу. В качестве модификаторов используют нитрозодиметиланилин (НДМА), динитробензол (ДНБ), бензохинон (БХ) и нафтохинон (НХ). В качестве биолигандов используют препараты, аналогичные примеру 1. Результаты эксперимента представлены в табл. 2.

Пример 3
Осуществляют нагружение частиц оксалата кальция по прототипу и по предлагаемому способу. В качестве модификаторов и биолигандов используют соединения, аналогичные примеру 1. Результаты эксперимента представлены в табл. 3.

Пример 4.

Осуществляют нагружение частиц фосфата алюминия по прототипу и по предлагаемому способу. В качестве модификаторов используют препараты, аналогичные примеру 1. В качестве биолигандов применяют генно-инженерные антигены ВИЧ, фракцию 1 чумного микроба, поликлональные антитела к поверхностному антигену вируса гепатита B. Результаты эксперимента представлены в табл. 4.

Таким образом, из представленных примеров явно видны преимущества заявляемого технического решения по сравнению с прототипом в плане обеспечения большей чувствительности анализа. Наряду с этим обеспечивается расширение сырьевой базы: гидрозольные препараты оказывается возможным изготавливать не только на импортном оксиде железа, но и на отечественных гидроксидах, фосфатах и солях карбоновых кислот.

Литература
1. Ройт А. Основы иммунологии. - М.: Мир, 1991. - c. 91-93
2. Никитин В.М. Справочник методов иммунологии. Кишинев, 1982. - 304 с.

3. Никитин В.М. Справочник методов иммунологии. - Кишинев, 1982. - 304 с.

4. Мешандин А. Г. Физико-химические аспекты сорбционных процессов при синтезе твердофазных биолигандов.- М., 1994. - c. 31-34.

5. Химическая энциклопедия. - Т. 3. - М., 1992. - c. 274-275.

6. Химическая энциклопедия. - Т. 5. - М., 1998. - С. 270-272.

7. Карякин Ю.В., Ангелов И.И. Чистые химические вещества. - М., 1974 - 407 c.

Способ может быть использован в медицине, а именно в иммунологии. В качестве твердых фаз используют оксиды, гидроксилы, фосфаты, соли карбоновых кислот металлов. Перед сорбцией биолигандов твердые фазы подвергают модификации соединениями общей формулы R - (X = O)n, где X - азот, углерод, R - ароматический радикал, n = 1-2. Способ обеспечивает повышение точности анализа. 4 табл.

Способ постановки агглютинационного иммунологического анализа, включающий постановку реакции агглютинации с использованием оксидов, гидроксидов, фосфатов и солей карбоновых кислот металлов с сорбированными на их поверхности биоспецифическими лигандами путем соединения последних с биологическими жидкостями, отличающийся тем, что оксиды, гидроксиды, фосфаты и соли карбоновых кислот металлов перед сорбцией биоспецифических лигандов модифицируют соединениями общей формулы
R - (X - O)_n,
где Х - азот, углерод;
R - ароматический радикал;
n = 1 - 2.