СПОСОБ ПОСТАНОВКИ РЕАКЦИИ ИММУНОЛОГИЧЕСКОГО АНАЛИЗА Российский патент 2013 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к областям биотехнологии, иммунохимии, ветеринарии и медицины, может быть использовано в решении задач диагностики различных инфекционных и соматических заболеваний человека и животных. При таких заболеваниях в организме возникают антитела, комплиментарные антигенам, лежащим в основе патогенеза заболевания. Данные антигены и антитела могут обнаруживаться в крови и являться маркерами конкретной нозологии. Однако до настоящего времени не созданы диагностические препараты, отличающиеся стабильностью и воспроизводимостью иммунохимических свойств и позволяющие проводить такие реакции бесприборно, в практически полевых условиях. Отсутствуют надежные и простые методы для скрининговых исследований животных и населения, относящихся к группам риска, что важно для коррекции терапии и определения прогноза заболевания. Цель изобретения - разработка бесприборного экспресс-метода для определения наличия специфических антигенов и антител, удаление ложноположительных результатов иммунохимического анализа.

Аналогом данного метода является способ определения различных антигенов и антител путем мечения одного из этих компонентов, именуемых в дальнейшем биолигандами, различными метками - радиоактивными, ферментными, флуоресцентными, эритроцитарными [1 - Ройт А. Основы иммунологии. М., 1991. - С.91-93], [2 - Покровский В.И. Руководство по иммунологии инфекционного процесса. - М., 1994. - С.230], [3 - Никитин В.М. Справочник методов иммунологии. Кишинев, 1982. - 304 с.]. Данные способы выявления антигенов и антител отличаются длительным временем постановки, значительными материальными затратами, опасностью для персонала при работе со специфическими метками. Кроме того, они требуют для своего исполнения наличия дорогих и сложных в эксплуатации приборов.

Известны коллоидные растворы неорганической природы, на поверхности которых адсорбированы специфические биолиганды. К таковым относят препараты коллоидного золота с адсорбированными биолигандами [4 - Ред. Жданов В.М. Методы исследования в молекулярной, общей и медицинской вирусологии. - М., 1987. - С.80-89] и препараты коллоидных растворов гексацианферрата железа (берлинской лазури) [5 - Попова С. В., Мешандин А.Г. Российский биомедицинский журнал. С-Петербург. - 2009, т.10. - С.478-491]. Данные способы выявления специфических биолигандов не требуют каких-либо специальных приборов, однако дороги (золото-драгоценный металл), имеют при своем исполнении определенное количество ложноположительных результатов.

Наиболее близко к поставленной цели изобретения является способ, описанный в [6 - Мешандин А.Г. Патент РФ №2195668 12.02.2001 г.]. Согласно известному способу постановка реакций агглютинационного иммунологического анализа включает разведение гидрозольных препаратов в подлежащих тестированию образцах биологического материала в водном солевом растворе, в качестве раствора используют растворы солей металлов II группы главной подгруппы периодической системы Д.И.Менделеева. Согласно данного способа, взятого заявителем за прототип, гидрозольный препарат разводят в подлежащих тестированию образцах биологического материала в водном растворе солей металлов II группы системы Менделеева.

Однако данный способ приводит к появлению ложноположительных результатов и длителен по времени постановки. Целью настоящего изобретения являются снижение количества ложноположительных результатов и уменьшение времени постановки анализа. Поставленная цель достигается описанным ниже способом - коллоидные растворы коллоидного золота или гексацианферрата железа (III) с адсорбированными на их поверхности биоспецифическими лигандами вводят во взаимодействие с подлежащими тестированию биологическими материалами в водном солевом растворе, отличающийся тем, что в качестве раствора используют раствор хлорида лития. Использование водного раствора хлорида лития является отличительным признаком заявляемого решения. Благодаря реализации данного способа уменьшается процент ложнопозитивных иммунологических реакций, уменьшается время постановки реакции.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения.

Пример №1. Осуществляют нагружение коллоидного раствора гексацианферрата железа (III) генно-инженерным антигеном туберкулезным по известным методам [8 - Мешандин А.Г. Патент РФ №2169924 12.09.1996 г.]. В качестве модификатора поверхности частиц используют катион ртути в виде раствора хлорида ртути (II). Далее осуществляют постановку иммунологической реакции в 1% растворе хлорида бария (прототип) и в заявляемом варианте - растворе хлорида лития разной концентрации. Сыворотки получают путем взятия небольшого количества (не более 0,1 мл) объема крови. Полученная кровь центрифугируется для осаждения форменных элементов. Допускается получение крови венопункцией, либо капиллярным взятием. Сыворотки получают от больных туберкулезом (+контроль) и от здоровых доноров (-контроль). Далее производят разведение сывороток в титрах 1:10. В 1% растворе хлорида бария (прототип) и в растворе хлорида лития разной концентрации (заявляемое техническое решение). После осуществления разведения сывороток в указанных водных растворах, соединяют их с исходным коллоидным раствором гексацианферрата железа (гидрозолем), и осуществляют учет результатов реакции. Результаты реакции представлены в таблице 1.

Таблица 1 Результаты постановки реакции агглютинации. Тип раствора
Показатели Прототип 1% BaCl₂ 0,04% LiCl 0,05% LiCl 1,0% LiCl 2,0% LiCl 2,2% LiCl % ложнопозитивных результатов 20 20 10 4 4 20 Время постановки, мин 8 8 6 3 3 3

Из представленных данных видны преимущества предлагаемого решения по сравнению с прототипом по позициям время постановки и % ложнопозитивных результатов. Вместе с тем, чувствительность реакции была аналогичной как у прототипа, так и в заявляемом техническом решении. Выход за оптимальные концентрации в заявляемом решении приводит к ухудшению результатов - в нижнем пределе концентрации хлорида лития нет преимуществ перед прототипом, в верхнем пределе сокращается время постановки, однако недопустимо увеличивается % ложноположительных результатов.

Пример №2. Осуществляют нагружение раствора коллоидного золота антителами к хорионическому гонадотропину человека (ХГЧ) по известным методам [4]. Далее осуществляют постановку иммунологической реакции в 1% растворе хлорида стронция (прототип) и в заявляемом варианте-растворе хлорида лития разной концентрации. Использовали в качестве биоматериала мочу как беременных женщин (положительный контроль), так и женщин не беременных (отрицательный контроль). Разведение использовали в соотношении 1:50, в остальном постановка была аналогична примеру №1. Результаты реакции представлены в таблице 2.

Таблица 2 Результаты постановки иммунологической реакции. Тип раствора
Показатели Прототип 1% SrCl₂ 0,04% LiCl 0,05% LiCl 1,0% LiCl 2,0% LiCl 2,2,0% LiCl % ложнопозитивных результатов 15 15 10 3 10 16 Время постановки, мин 10 11 9 6 6 4

Из представленных данных видны преимущества предлагаемого решения по сравнению с прототипом по позициям время постановки и % ложнопозитивных результатов. Вместе с тем, чувствительность реакции была аналогичной как у прототипа, так и в заявляемом техническом решении. Выход за оптимальные концентрации в заявляемом решении приводит к ухудшению результатов - в нижнем пределе концентрации хлорида лития нет преимуществ перед прототипом, в верхнем пределе сокращается время постановки, однако недопустимо увеличивается % ложноположительных результатов, превышающий таковой даже в прототипе.

Пример №3. Осуществляют нагружение раствора коллоидного золота антигенами к вирусу птичьего гриппа по известным методам [4]. Далее осуществляют постановку иммунологической реакции в 1% растворе хлорида кальция (прототип) и в заявляемом варианте-растворе хлорида лития разной концентрации. Использовали в качестве биоматериала сыворотки крови птиц иммунизированных (положительный контроль), так и неиммунизированных (отрицательный контроль). Разведение использовали в соотношении 1:20, в остальном постановка была аналогична примеру №1. Результаты реакции представлены в таблице 3.

Таблица 3 Результаты постановки иммунологической реакции. Тип раствора
Показатели Прототип 1% CaCl₂ 0,04% LiCl 0,05% LiCl 1,0% LiCl 2,0% LiCl 2,2,0% LiCl % ложнопозитивных результатов 10 10 9 4 4 10 Время постановки, мин 15 15 10 7 7 5

Из представленных данных видны преимущества предлагаемого решения по сравнению с прототипом по позициям время постановки и % ложнопозитивных результатов. Вместе с тем, чувствительность реакции была аналогичной как у прототипа, так и в заявляемом техническом решении. Выход за оптимальные концентрации в заявляемом решении приводит к ухудшению результатов - в нижнем пределе концентрации хлорида лития нет преимуществ перед прототипом, в верхнем пределе сокращается время постановки, однако недопустимо увеличивается % ложноположительных результатов, превышающий таковой даже в прототипе.

Пример №4. Осуществляют нагружение раствора коллоидного раствора гексацианферрата железа (III) антителами к поверхностному антигену вируса гепатита B (HbsAg) по известным методам [8]. В качестве модификатора поверхности коллоидных частиц используют катион двухвалентной ртути в виде раствора хлорида ртути (II). Далее осуществляют постановку иммунологической реакции в 1% растворе хлорида магния (прототип) и в заявляемом варианте - растворе хлорида лития разной концентрации. Использовали в качестве биоматериала модельные сыворотки КРС, содержащие генно-инженерный HbsAg (+контроль) и не содержащие его (-контроль). Разведение использовали в соотношении 1:50, в остальном постановка была аналогична примеру №1. Результаты реакции представлены в таблице 4.

Таблица 4 Результаты постановки иммунологической реакции. Тип раствора
Показатели Прототип 1% MgCl₂ 0,04% LiCl 0,05% LiCl l,0% LiCl 2,0% LiCl 2,2,0% LiCl % ложнопозитивных результатов 9 8 7 4 4 8 Время постановки, мин 6 6 5 3 3 2

Из представленных данных видны преимущества предлагаемого решения по сравнению с прототипом по позициям время постановки и % ложнопозитивных результатов. Вместе с тем, чувствительность реакции была аналогичной как у прототипа, так и в заявляемом техническом решении. Выход за оптимальные концентрации в заявляемом решении приводит к ухудшению результатов - в нижнем пределе концентрации хлорида лития нет преимуществ перед прототипом, в верхнем пределе сокращается время постановки, однако недопустимо увеличивается % ложноположительных результатов, превышающий таковой даже в прототипе.

Пример №5. Осуществляют нагружение раствора коллоидного золота генно-инженерными антигенами ВИЧ по известному [4] методу далее осуществляют постановку иммунологической реакции в 1% растворе сульфата магния (прототип) и в заявляемом варианте - растворе хлорида лития разной концентрации. В качестве биоматериала используют модельные сыворотки от лабораторных мышей, иммунизированных, либо неиммунизированных названным антигеном. Используют разведение в прототипе и заявляемом объекте в титре 1:25. Результаты реакции представлены в таблице 5

Таблица 5 Результаты постановки иммунологической реакции. Тип раствора
Показатели Прототип 1% MgSO₄ 0,04% LiCl 0,05% LiCl 1,0% LiCl 2,0% LiCl 2,2,0% LiCl % ложнопозитивных результатов 10 9 5 4 4 8 Время постановки, мин 8 8 3 2 3 2

Из представленных данных видны преимущества предлагаемого решения по сравнению с прототипом по позициям время постановки и % ложнопозитивных результатов. Вместе с тем, чувствительность реакции была аналогичной как у прототипа, так и в заявляемом техническом решении. Выход за оптимальные концентрации в заявляемом решении приводит к ухудшению результатов - в нижнем пределе концентрации хлорида лития нет преимуществ перед прототипом, в верхнем пределе сокращается время постановки, однако недопустимо увеличивается % ложноположительных результатов, превышающий таковой даже в прототипе.

Таким образом, из приведенных примеров конкретного выполнения видны преимущества заявляемого изобретения в сравнении с прототипом по снижению времени постановки анализа и уменьшению количества ложноположительных результатов анализа.

Способ по изобретению включает адсорбцию биоспецифических лигандов на поверхность частиц коллоидных растворов золота или гексацианферрата железа (III), последующее их соединение с подлежащим тестированию биоматериалом в разведенном водном солевом растворе, в качестве которого используют раствор хлорида лития в концентрации от 0,04 до 2,2%. Использование изобретения позволяет сократить время анализа (предпочтительно при концентрации LiCl в растворе от 0,05 до 2,0%) и уменьшить процент ложнопозитивных результатов (при концентрации LiCl в растворе от 0,05 до 2,2%). 5 табл., 5 пр.

Способ иммунологического анализа, включающий адсорбцию биоспецифических лигандов на поверхность частиц коллоидных растворов золота или гексацианферрата железа (III), последующее их соединение с подлежащим тестированию биоматериалом в разведенном водном солевом растворе, отличающийся тем, что в качестве водного солевого раствора используют раствор хлорида лития.