СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИРАДИКАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЕЙ Российский патент 2003 года по МПК G01N33/52 

Изобретение относится к области медицины, конкретно к способам определения антирадикальной активности в биологических жидкостях.

Известен способ определения антирадикальной активности, заключающийся в измерении оптической плотности исследуемого раствора, содержащего 2,2 - azino-di-[3-ethylbentiazolinesulphonate] , перекись водорода и тестируемую пробу на спектрофотометре при 600 нм [1]. Недостатком способа является то, что он предназначен для узкой области применения, обладает невысокой чувствительностью и нестабильностью образцов в связи с ограниченным сроком хранения. Известен способ определения антирадикальной активности флуоресцентным методом, где она определяется по восстановлению флуоресценции β-фикоэритрина после добавления сыворотки крови [2]. Степень восстановления флуоресценции β-фикоэритрина пропорциональна содержанию основных антиоксидантов в образце сыворотки крови. Недостатками упомянутого способа является трудоемкость, использование дорогостоящего реактива и оборудования, а также ограниченная область применения.

Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому является способ определения антирадикальной активности [3], основанный на способности сыворотки крови "тушить" люминолзависимую хемилюминесценцию, возникающую в реакции радикалообразования. Источником радикалов служит 2,2-azobis(2-amidinopropane) dihydrochloride, растворенный в фосфатном буфере. В кювете люминометра перемешивают 450 мкл 10 мМ насыщенного кислородом фосфатного буфера, рН 7,4; 50 мкл 10 мМ люминола в боратном буфере и 50 мкл 400 мМ источника радикалов 2,2-azobis(2-amidinopropane) dihydrochloride. Реакцию проводят на люминометре при 32^oС 15 мин, затем добавляют 20 мкл плазмы. Концентрацию имеющихся антиоксидантов определяют по калибровочной кривой, построенной по концентрации водорастворимого аналога витамина Е - тролокса. Однако применение данного способа ограничено вследствие того, что при его помощи невозможно определить суммарную антирадикальную активность как водорастворимых так и жирорастворимых антиоксидантов, содержащихся в биологических жидкостях.

Новая техническая задача - повышение универсальности, чувствительности, упрощение способа. Поставленную задачу решают применением нового способа определения антирадикальной активности в биологических жидкостях, заключающегося в измерении показателей хемилюминесценции раствора, содержащего смесь вещества - источника радикалов, люминола и биологической жидкости, и последующим определением ее уровня по кинетической кривой, причем в качестве вещества источника радикалов используют 2,2-азо-бис-изо-бутиронитрил (АИБН), который предварительно растворяют в диметилсульфоксиде (ДМСО) до концентрации 50 мМ, люминол сначала растворяют в диметилсульфоксиде и в последующем при добавлении раствора Хенкса доводят концентрацию раствора люминола до 253 мкМ, после чего смешивают 800 мкл полученного раствора АИБН, растворенного в диметилсульфоксиде, 200 мкл 5 мМ раствора Na₂HPO₄ и 50 мкл 253 мкМ раствора люминола при Т +37^oС, затем перемешивают со скоростью 800 об/мин в течение 15 мин, затем в течение 1 мин регистрируют стационарный уровень свечения в процессе радикалообразования (I₀), после чего в смесь вводят 15 мкл исследуемой биологической жидкости и регистрируют новый уровень свечения (I) на стационарном участке кинетической кривой и по формуле
АРА = k₇•const = (i-^1/2 - i^1/2)/(2•[In]),
где I₀ - начальная интенсивность хемилюминесценции;
I - интенсивность хемилюминесценции на стационарном участке после добавления исследуемой жидкости;
k₇ - константа скорости обрыва цепи в реакциях с участием In;
[In] - концентрация ингибитора в пробе
i - I/I₀,
рассчитывают антирадикальную активность биологической жидкости.

Способ осуществляют следующим образом. Кровь забирают натощак из локтевой вены. Получение сыворотки крови производят стандартным методом: собранную в пробирку кровь центрифугируют 10 минут при 3000 об/мин. Сбор желудочного сока и слюны проводят следующим образом. Желудочное содержимое аспирируют при эзофагогастродуоденоскопии через катетер, введенный в биопсийный канал эндоскопа. Слюну собирают натощак в центрифужные пробирки. За 8 часов перед исследованием пациентам предлагают воздержаться от курения, а непосредственно перед сбором слюны - прополоскать рот. Слюну и базальные аспираты желудочного содержимого центрифугируют 10 минут при 3000 об/мин. Водорастворимую фракцию смешанной нестимулированной слюны и желудочный сок используют для определения уровня общей АРА. Пробы хранят при -20^oС. Дополнительно сок и слюну не разводят, все операции были аналогичны таковым с сывороткой крови. АИБН растворяют в диметилсульфоксиде до концентрации 50 мМ. Люминол сначала растворяют в диметилсульфоксиде, а затем при добавлении раствора Хенкса доводят концентрацию люминола до 253 мкМ. В кювету помещают 50 мкл раствора люминола, 800 мкл раствора АИБН и 200 мкл 5мМ раствора Na₂HPO₄. Все растворы предварительно подогреваются до 37^oС. Дальнейшую реакцию проводят при перемешивании со скоростью 800 об/мин в течение 15 минут.

Измерение уровня хемилюминесценции проводят на люминометре, разработанном сотрудниками лаборатории и описанном ранее [4]. В течение 30 с регистрируют шум детектора прибора, затем в течение 1 минуты регистрируют стационарный уровень свечения в процессе радикалообразования (I₀), после чего в кювету вводят 15 мкл исследуемой биологической жидкости и регистрируют новый уровень свечения (I) на стационарном участке кинетической кривой и по формуле:
АРА = k₇•const = (i^-1/2 - i^1/2)l(2•[In]),
где I₀ - начальная интенсивность хемилюминесценции;
I - интенсивность хемилюминесценции на стационарном участке после добавления исследуемой жидкости;
k₇ - константа скорости обрыва цепи в реакциях с участием In;
[In] - концентрация ингибитора в пробе,
i - I/I₀,
определяют антирадикальную активность (АРА) биологической жидкости.

В основе способа лежит способность биологических жидкостей тушить люминолзависимую хемилюминесценцию, возникающую в реакции радикалообразования. Источником радикалов служит 2,2-азо-бис-изобутиронитрил (АИБН), который в присутствии кислорода способен с постоянной скоростью продуцировать радикалы.

Взаимодействие люминола с RO₂* сопровождается хемилюминесценцией [5].

Наиболее распространенными антирадикальными препаратами являются вещества фенольной и полифенольной природы. Уравнения реакций с участием фенольных антиоксидантов и анализ кинетических параметров приведены в работе Е.А. Рогинского [6].

Антирадикальную активность биологической жидкости оценивают по величине параметра АРА, которую рассчитывали исходя из следующих предположений.

В отсутствии ингибитора интенсивность свечения для стационарного процесса
I₀ = ϕ•k₆•[RO*2

После добавления ингибитора интенсивность свечения снижается, и для стационарного процесса можно принять
i = I/I₀ =k₆•[RO₂*]/W_ин;
ARA = (i^-1/2 - i^1/2)/(2•[In]) = k₇/(W_ин•k₆)^1/2
Для концентраций ингибитора, существенно не влияющих на скорость радикалообразования, можно принять величину W_ин за константу. Следовательно, параметр
ARA = k₇•const = (i^-1/2 - i^1/2)/(2•[In]),
где I₀ - начальная интенсивность хемилюминесценции;
I - интенсивность хемилюминесценции на стационарном участке после добавления биологической жидкости;
k₇ - константа скорости обрыва цепи в реакциях с участием In;
[In] - концентрация ингибитора в пробе, отражает антирадикальную активность биологической жидкости,
i - I/I₀.

Данные рассуждения справедливы для всех ингибиторов, молекула которых обрывает две кинетические цепи окисления, связывая два активных радикала RO* (фенольные антиоксиданты, глутатион и др.).

Концентрация исследуемой биологической жидкости подбирается таким образом, чтобы не отмечалось влияния биологической жидкости на скорость радикалообразования, то есть тангенс угла наклона хемилюминесцентной кривой после добавления исследуемого образца не должен принимать отрицательные значения.

Преимуществом данного способа является то, что он позволяет оценить суммарную антирадикальную активность биологической жидкости и взаимодействие гидрофильных и гидрофобных антиоксидантов, благодаря тому что липофильный источник радикалов находится в неводной фазе и взаимодействует с гидрофобными антиоксидантами фенольной природы, тогда как водорастворимые антиоксиданты (аскорбат) находятся в водной фазе и на поверхности раздела фаз взаимодействуют с радикалами гидрофобных антиоксидантов. Кроме того, данный метод позволяет оценивать антирадикальную активность для различных биологических жидкостей с содержанием антиоксидантов в 10^-7-10^-9 М, что позволяет отнести его к чувствительным способам и также снимает часто возникающие ограничения, связанные с исследованием окрашенных образцов.

Выбор АИБН в качестве источника радикалов обусловлен тем, что данное вещество обладает гидрофобной природой в отличие от вещества источника радикалов, имеющего гидрофильную природу, используемого в способе-прототипе. Растворяя АИБН в диметилсульфоксиде, мы добиваемся того, что липофильный источник радикалов (в нашем случае АИБН) может переходить в гидрофобную фазу, генерируя в ней RO₂ радикалы, которые взаимодействуют с гидрофобными антиоксидантами фенольной природы, тогда как водорастворимые антиоксиданты (аскорбат) находятся в водной фазе и на поверхности раздела фаз взаимодействуют с радикалами гидрофобных антиоксидантов. Это приближает ситуацию образования радикалов в данной модельной системе к механизму образования радикалов в гидрофобных средах (мембраны, липопротеины) in vivo и отличает этот способ от способа прототипа, где источник RO₂ радикалов находится в водной фазе.

Концентрации используемых растворов, условия осуществления предлагаемого способа подобраны экспериментальным путем. Исходными данными для расчета концентраций компонентов исследуемой смеси служит объем кюветы (1,2 мл), рН раствора, который должен находится в пределах 7,4-7,6. Объемы АИБН, фосфатного буфера и люмин
Таким образом, предложенный способ позволяет определять антирадикальную активность в биологических средах, к которым относится кровь, желудочный сок, слюна. Нами обследованы различные биологические жидкости - сыворотка крови, желудочный сок и слюна от 84 практически здоровых доноров.

Средние значения АРА сыворотки крови здоровых доноров составили для сыворотки - 587±54,66 ед. хем. , желудочного сока - 776±135 ед. хем., слюны 224±16 ед. хем.

Источники информации
1. Патент 2250819 и PCT/GB 91/02228, Великобритания.

2. Nieto F.J., Iribarren C., Gross M.D. Uric acid and serum antioxidant capacity: a reaction to atherosclerosis? //Atherosclerosis. - 2000. - Vol. 148.- N 1. - P. 131-139.

3. Nyyssonen К., Porkkala-Sarataho E., Kaikkonen J. Ascorbate and urate are the strongest determinants of plasma antioxidative capacity and serum lipid resistance to oxidation in Finish men. Atherosclerosis, 1997. - Vol. 130. - N1. - P. 131 -139.

4. Havalkin I. V., Kargalov A.V., Sitozhevsky A.V., Ivanov V.V. Highly sensitive computering complex for measuring of chemiluminescence // International Conference on clinical chemiluminescence, Berlin -1994. - April 25-28. - M 8.

5. Русин Б.А. Биохемилюминесценция, - М.: Наука, 1983.

6. Рогинский В.А. Фенольные антиоксиданты: Реакционная способность и эффективность. - М.: Наука, 1988. - 247 с.

Изобретение относится к медицине, конкретно к способам определения антирадикальной активности биологических жидкостей. Способ обеспечивает повышение универсальности, точности при одновременном упрощении исследования. В качестве вещества источника радикалов используют 2,2-азо-бис-изо-бутиронитрил, который предварительно растворяют в диметилсульфоксиде до концентрации 50 мМ, люминол сначала растворяют в диметилсульфоксиде и в последующем при добавлении раствора Хенкса доводят его концентрацию до 253 мкМ, после чего смешивают 800 мкл полученного раствора 2,2-азо-бис-изо-бутиронитрила, 200 мкл 5 мМ раствора Na₂HPO₄ и 50 мкл раствора люминола при Т+37^oС, смесь перемешивают со скоростью 800 об/мин в течение 15 мин, затем в течение 1 мин регистрируют стационарный уровень свечения в процессе радикалообразования (I₀), после чего в смесь вводят 15 мкл исследуемой биологической жидкости и регистрируют новый уровень свечения (I) на стационарном участке кинетической кривой и по формуле АРА=k₇•const=(i^-1/2-i^1/2)/(2•[In]), где I₀- начальная интенсивность хемилюминесценции; I - интенсивность хемилюминесценции на стационарном участке после добавления исследуемой жидкости; k₇ - константа скорости обрыва цепи в реакциях с участием In; [In] - концентрация ингибитора в пробе; i - I/I₀, рассчитывают антирадикальную активность биологической жидкости.

Способ определения антирадикальной активности биологических жидкостей, заключающийся в измерении показателей хемилюминесценции раствора, содержащего смесь вещества - источника радикалов, люминола и биологической жидкости и последующем определении ее уровня по кинетической кривой, отличающийся тем, что в качестве вещества источника радикалов используют 2,2-азо-бис-изо-бутиронитрил, который предварительно растворяют в диметилсульфоксиде до концентрации 50 мМ, люминол сначала растворяют в диметилсульфоксиде и в последующем при добавлении раствора Хенкса доводят его концентрацию до 253 мкМ, после чего смешивают 800 мкл полученного раствора 2,2-азо-бис-изо-бутиронитрила, 200 мкл 5 мМ раствора Na₂HPO₄ и 50 мкл раствора люминола при Т+37^oС, смесь перемешивают со скоростью 800 об/мин в течение 15 мин, затем в течение 1 мин регистрируют стационарный уровень свечения в процессе радикалообразования (I₀), после чего в смесь вводят 15 мкл исследуемой биологической жидкости и регистрируют новый уровень свечения (I) на стационарном участке кинетической кривой и по формуле
АРА=k₇ • const=(i^-1/2- i^1/2)/(2•[In]),
где I₀ - начальная интенсивность хемилюминесценции;
I - интенсивность хемилюминесценции на стационарном участке после добавления исследуемой жидкости;
k₇ - константа скорости обрыва цепи в реакциях с участием In;
[In] - концентрация ингибитора в пробе;
i - I/I₀,
рассчитывают антирадикальную активность биологической жидкости.