СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ШТАММОВ-ДЕСТРУКТОРОВ, ОБЛАДАЮЩИХ ПОЛИСУБСТРАТНОЙ СПЕЦИФИЧНОСТЬЮ Российский патент 1999 года по МПК C12Q1/04 C12N1/04 

Изобретение относится к области экологической микробиологии и может быть использовано при создании штаммов-деструкторов токсических отходов производственных и бытовых стоков.

Для эффективной микробиологической детоксикации производственных и бытовых стоков необходимы микроорганизмы-деструкторы с широким спектром субстратной активности. В настоящее время для выделения таких штаммов используют несколько методов:
1 - метод градиентных чашек (Готовят двухслойные чашки следующим образом: агаризованная синтетическая минимальная среда M9 (Миллер Д., 1976), содержащая токсикант, наливается в чашку Петри, расположенную наклонно по отношению к поверхности стола. После отверждения среды чашку располагают горизонтально и наслаивают равный объем этой же среды без токсиканта). После суточного выдерживания чашки для формирования градиента концентрации токсиканта на ее поверхность помещают смывы, сточные воды или микроорганизмы с предполагаемыми искомыми свойствами равномерно распределяют их по всей поверхности. Чашки инкубируют и после появления бактериального роста клоны, выросшие в зоне большей концентрации токсиканта, пересевают на аналогичные чашки с большей концентрацией токсиканта с целью получить высокоактивные штаммы-деструкторы.

2 - метод накопительных культур (навеску почвы или иного субстрата помещают в колбу с минимальной синтетической средой M9, в которую в качестве источника углерода и энергии добавляют токсикант и культивируют при определенных условиях температуры и аэрирования. Периодически производят перенесение аликвоты суспензии в свежую порцию минимальной среды с добавками токсиканта заданной концентрации. После многократного повторения этой процедуры высевают по 0,1 - 0,2 мл культуральной среды на чашки с твердой минимальной средой, содержащей в качестве единственного источника углерода используемый токсикант. Выросшие микроорганизмы смывают в минимальном объеме и вносят в минимальную среду, содержащую токсиканты в более высокой концентрации. Весь цикл манипуляций повторяют неоднократно, пока не достигают максимально высокой концентрации токсиканта в минимальной среде (Кочетков В.В., В.В. Балакшина, А.В. Наумов, В.Г. Грищенков, А.М. Боронин. Выделение и характеристики бактерий деструкторов пестицидов //Прикладная биохимия и микробиология, 1997, том 33, N 3, с. 310-313). Далее получают изолированные клоны штаммов-деструкторов и при необходимости их идентифицируют).

Метод градиентных чашек так же как и методы накопительных культур позволяют путем многократного пассирования проводить селекцию микроорганизмов, утилизирующих токсиканты в достаточно высоких концентрациях. Однако эти методы не позволяют получать микроорганизмы-деструкторы, способные утилизировать несколько токсикантов, так как хотя в минимальной среде и могут находиться несколько токсикантов, нельзя установить, к какому (-им) токсикантам имеется субстратная специфичность у выросшей культуры. Эти методы не позволяют определить уровень устойчивости выделяемых штаммов-деструкторов к токсическому воздействию используемых токсикантов, а также проводить селекцию более активных их клонов с полисубстратной специфичностью.

Целью настоящего изобретения является создание ускоренного и менее трудоемкого способа выделения микроорганизмов, способных к утилизации одновременно нескольких токсикантов, а также отбор наиболее устойчивых вариантов этих микроорганизмов, которые могут найти широкое применение при деструкции производственных и бытовых стоков, имеющих широкий спектр токсических веществ.

Поставленная цель достигается следующим образом: на пластинку агаризованной (1,5 - 2%) минимальной среды (синтетическая минимальная среда M9 наслаивается полужидкая (0,4 - 0,6%) агаризованная минимальная среда M9, содержащая аликвоту субстрата из возможных источников с микроорганизмами, обладающих способностью использовать в качестве единственного источника углерода токсиканты. После отвердения полужидкого агара на его поверхность накладываются бумажные диски 5-6 мм в диаметре, пропитанные растворами различных токсикантов. Чашки инкубируют при заданной температуре в течение 1-2 недель с ежедневным просмотром. При появлении колоний выросших вокруг бумажных дисков с различными токсикантами производят их отсев и далее вносят в полужидкий агар, повторяя выше описанную процедуру. Полученные микроорганизмы, обладающие одномоментной способностью использовать в качестве единственного источника углерода несколько токсикантов, при необходимости идентифицируют.

Пример 1: проводилось выделение микроорганизма, обладающего способностью использовать в качестве источников углерода фенол и формальдегид. Сточные воды, вытекающие из реактора очистных сооружений АО "Каустик" г. Волгоград, в объеме 0,2 мл были смешаны с 3 мл расплавленной агаризованной (0,5% агара) минимальной среды M9 и наслоены на поверхность агаризованной (1,5% агара) минимальной среды M9 в чашке Петри. После отвердения полужидкого агара на его поверхность поместили бумажные диски: 1 - пропитанный раствором фенола (100 мкг/мл), 2 - раствором формальдегида с аналогичной концентрацией. Чашки инкубировали при 28 ^oC. Через 5 дней инкубирования вокруг бумажных дисков, пропитанных фенолом и формальдегидом, появился кольцевой рост микроорганизмов в виде сплошного газона в дистальной части кольца и в виде отдельных колоний вблизи к краям бумажного диска. Полученный микроорганизм был идентифицирован. По родовым признакам он отнесен к Pseudomonas sp. и получил название Pseudomonas sp. ВДК. Pseudomonas sp. ВДК после проведенной селекции был способен утилизировать смесь фенола и формальдегида с исходной концентрацией 450-500 мкг/мл соответственно.

Пример 2: проводилось выявление штаммов микроорганизмов, относящихся к непатогенным видам псевдомонад, которые могли бы использовать фенол и формальдегид как питательный субстрат. Суспензия суточной агаровой культуры в объеме 0,2 мл была смешана с 3 мл расплавленной агаризованной (0,5% агара) минимальной среды M9 и наслоена на поверхность агаризованной (1,5% агара) минимальной среды M9 в чашке Петри. После отведения полужидкого агара на его поверхность поместили бумажные диски: 1 - пропитанный раствором фенола (100 мкг/мл), 2 - раствором формальдегида с аналогичной концентрацией. Чашки инкубировали при 32^oC. Проверка 70 штаммов бактерий, относящихся к непатогенным видам рода Pseudomonas из коллекции микроорганизмов ВолгНИПЧИ, выявила штамм, который через 5 дней инкубирования сформировал кольцевой рост вокруг бумажных дисков, пропитанных фенолом и формальдегидом. Штамм, получивший название P. cepacia ВДК, мог утилизировать смесь фенола и формальдегида до нетоксических продуктов.

Изобретение относится к экологической микробиологии. Источники микроорганизмов с полисубстратной специфичностью по отношению к токсикантам смешивают с полужидкой агаризованной синтетической минимальной средой, наслаивают вторым слоем на аналогичную более плотную среду. Пропитанные растворами токсикантов отдельные бумажные диски помещают на поверхность застывшего полужидкого агара. Чашки инкубируют при температуре 28-30^oC в течение недели с ежедневным просмотром. Клоны микроорганизмов, способные утилизировать токсиканты, формируют видимый рост в виде кольца вокруг бумажных дисков, содержащих эти токсиканты. Культура микроорганизмов, формирующая кольцевой рост вокруг дисков, содержащих различные токсиканты, обладает полисубстратной специфичностью. Клоны, отбираемые от этих колоний, обладают большей деструктивной активностью. Технический результат заключается в возможности отбора наиболее ценных штаммов микроорганизмов, являющихся активными деструкторами органических загрязнений окружающей среды.

Способ выделения штаммов-деструкторов, обладающих полисубстратной специфичностью, состоящий из внесения источника микроорганизмов в среду, содержащую в качестве единственного источника углерода соответствующий субстрат, культивирования и последующего выделения, отличающийся тем, что для выделения штаммов-деструкторов, способных использовать в качестве источника углерода одновременно несколько токсикантов, аликвоту сточных вод, смывы с водотоков или иной источник микроорганизмов, смешивают с расплавленной полужидкой агаризованной синтетической минимальной средой М9 (45 - 47^oС), которую наслаивают на поверхность агаризованной синтетической минимальной среды М9 (1,5 - 2%), а токсикантами пропитывают бумажные диски, 5 - 6 мм в диаметре (каждый токсикант на отдельном диске), которые накладывают на поверхность застывшей полужидкой агаризованной синтетической минимальной среды, инкубируют чашки при температуре 28 - 30^oС в течение недели с ежедневным просмотром, а выросшие изолированные колонии микроорганизмов, способные в качестве источника углерода и энергии использовать несколько токсикантов, отбирают в зоне наибольшей концентрации утилизируемых токсикантов, чем осуществляется селекция наиболее активных клонов данных микроорганизмов.