СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СПОСОБНОСТИ ЭРИТРОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА СОРБИРОВАТЬ ПРЕДНИЗОЛОН Российский патент 2003 года по МПК G01N33/53 

Предлагаемое изобретение относится к области медицины, в именно к иммунологии, и может применяться в иммунофармакотерапии с использованием аутоэритроцитов, нагруженных, например, преднизолоном в комплексе лечебных мероприятий при различных хронических воспалительных заболеваниях, сопровождающихся признаками гиперактивации иммунной системы.

Наиболее близким к предлагаемому является способ определения сорбционной активности рецепторного аппарата эритроцитов человека. Сущность известного способа заключается в следующем: кровь больного берут в количестве 4-5 мл в пробирку, содержащую 0,1 мл 2,5 тыс. ЕД гепарина, эритроциты отмывают трехкратным центрифугированием 5-7 минут при 1500 об/мин в фосфатно-солевом буфере. Отмытые эритроциты разводят фосфатно-солевым буфером до получения 3-5% суспензии и 1,5 мл полученной суспензии инкубируют при комнатной температуре в течение 40-45 минут с 1,5 мл разведенной мышиной сыворотки. По окончании инкубации смесь центрифугируют и измеряют оптическую плотность надосадочной жидкости против контрольной пробы на спектрофотометре. Контрольная проба представляет собой 1,5 мл мышиной сыворотки взятого разведения, к которым добавляют 1,5 мл фосфатно-солевого буфера и обрабатывают также, как опытную пробу. Полученное значение сравнивают со средним донорским контролем и разность отражает сорбционную активность рецепторного аппарата эритроцитов человека (1).

Однако известный способ обладает определенными недостатками, а именно:
известный способ определения сорбционной активности позволяет судить о функциональном состоянии рецепторного аппарата эритроцитов человека и прогнозе в отношении выздоровления, в то время, как предлагаемый способ может быть применен для оценки сорбционной активности эритроцитов в отношении конкретного препарата и возможности проведения в комплексе лечебных мероприятий иммунофармакотерапии с использованием аутоэритроцитов, нагруженных преднизолоном при различных заболеваниях, сопровождающихся гиперактивацией иммунной системы.

Исходя из известного уровня технологий определения сорбционной активности эритроцитов была поставлена задача: повысить эффективность лечения за счет определения индивидуальной сорбционной способности эритроцитов пациента к преднизолону до применения в комплексе лечебных мероприятий иммунофармакотерапии.

Поставленная задача решена следующим образом.

Определение способности эритроцитов человека сорбировать преднизолон выполняют путем постановки реакции клеточной иммуносорбции и получения надосадочной жидкости. Новым в предлагаемом способе является то, что выделенную эритромассу инкубируют с раствором преднизолона в концентрации 1 мкг/мл в равных объемах в течение 60 минут, центрифугируют и получают надосадочную жидкость. Затем в первую пробу вносят 0,05 мл среды 199, во вторую пробу 0,05 мл раствора преднизолона в исходной концентрации и в третью пробу 0,05 мл надосадочной жидкости, полученной после инкубации преднизолона с эритромассой. Затем во все пробы добавляют 0,05 мл раствора нитросинего тетразолия и 0,1 мл цельной крови пациента. После чего инкубируют, центрифугируют и удаляют надосадочную жидкость. Из клеточного осадка готовят мазки, фиксируют метанолом и окрашивают нейтральным красным, подсчитывают процентное содержание нейтрофилов, в цитоплазме которых содержатся гранулы диформазана. Затем оценивают биологическую активность преднизолона в первой опытной пробе по проценту снижения НСТ-активности нейтрофилов в сравнении с контрольной пробой без преднизолона и определяют сорбционную активность эритроцитов по разнице показателей в пробе с раствором преднизолона в исходной концентрации и в пробе с надосадочной жидкостью и при выявлении разницы между этими показателями более 5% считают целесообразным проведение экстракорпоральной иммунофармакотерапии с использованием аутоэритроцитов, обработанных раствором преднизолона.

Поясняем существенность отличительных признаков предлагаемого способа иммунофармакотерапии.

При инкубации эритромассы с раствором преднизолона эритроциты обладают способностью неспецифически сорбировать и концентрировать на своей поверхности преднизолон и при введении в организм оказывать регуляторное воздействие на процессы лимфопролиферации, лежащие в основе иммунного ответа.

Полученную после инкубации и центрифугирования эритромассы с раствором преднизолона в исходной концентрации надосадочную жидкость используют для постановки НСТ-теста для оценки сорбционной способности эритроцитов, определяемой по степени падения биологической активности преднизолона после его инкубации с эритроцитами.

Первую пробу с добавлением 0,05 мл среды 199 используют как контрольную для последующего сравнения с опытными пробами.

Вторую пробу с добавлением 0,05 мл раствора преднизолона в концентрации 1 мкг/мл используют для оценки биологической активности преднизолона в сравнении с контрольной пробой.

Третью пробу с добавлением 0,05 мл надосадочной жидкости, полученной после инкубации преднизолона в исходной концентрации с эритромассой, используют для оценки сорбционной способности эритроцитов по степени падения биологической активности препарата в сравнении со второй пробой.

Добавление во все пробы 0,05 мл растворимого красителя нитросинего тетразолия и 0,1 мл цельной крови пациента с последующей инкубацией в термостате при температуре 37^oС и центрифугирование необходимо для приготовления мазков и определения процентного содержания нейтрофилов, в цитоплазме которых содержатся гранулы нерастворимого диформазана.

Биологическую активность преднизолона оценивают по проценту снижения НСТ-активности нейтрофилов в пробе с добавлением раствора преднизолона в исходной концентрации по сравнению с контрольной пробой без преднизолона.

Наличие и величину сорбционной активности эритроцитов вычисляют по разнице показателей пробы с надосадочной жидкостью и пробы с раствором преднизолона в исходной концентрации.

5 процентная разница исключает сшибку при подсчете НСТ-позитивных клеток и предполагает получение достоверных результатов при решении вопроса о целесообразности проведения у конкретного пациента экстракорпоральной иммунофармакотерапии с использованием аутоэритроцитов, обработанных преднизолоном в комплексе лечебных мероприятий.

Проведенные патентные исследования по подклассу G 01 N 33/53, A 61 К 37/02 и анализ научно-медицинской информации, отражающей существующий уровень способов определения сорбционной способности эритроцитов периферической крови, не выявили технологий, идентичных предложенной. Таким образом, предлагаемый способ определения эритроцитов человека сорбировать преднизолон является новым.

Взаимосвязь и взаимодействие существенных приемов предлагаемого способа определения способности эритроцитов человека сорбироватъ преднизолон обеспечивает достижение нового медицинского результата в решении поставленной задачи, а именно: повысить эффективность лечения за счет определения индивидуальной сорбционной способности эритроцитов пациента к преднизолону.

Предлагаемый способ может быть широко применен в практическом здравоохранении, так как может быть воспроизведен неоднократно и не требует использования дорогостоящего оборудования и реактивов.

Сущность предлагаемого способа определения способности эритроцитов человека сорбировать преднизолон заключается в следующем.

Производят забор крови пациента из локтевой вены в стерильных условиях на гепарине из расчета 25 ЕД на 1 мл крови, часть которой используют для получения эритромассы путем трехкратной отмывки в изотоническом растворе хлорида натрия. Равные объемы отмытой эритромассы и раствора преднизолона в концентрации 1 мкг/мл инкубируют в термостате при 37^oC в течение 1 часа. После инкубации взвесь центрифугируют при 1000 об/мин в течение 10 минут, снимают надосадочную жидкость, которую используют в дальнейших исследованиях. Постановку НСТ-теста проводят в планшетах для иммунологических исследований. В первую пробу вносят 0,05 мл среды 199, во вторую - 0,05 мл раствора преднизолона в концентрации 1 мкг/мл, в третью - 0,05 мл надосадочной жидкости, подученной после эритросорбции. Во все пробы вносят раствор нитросинего тетразолия в объеме 0,05 мл и 0,01 мл цельной крови пациента. Пробы инкубируют в термостате при 37^oC и в течение 30 минут, центрифугируют 10 минут при 1000 об/мин. Из клеточного осадка готовят мазки, фиксируют метанолом, окрашивают нейтральным красным и определяют процентное содержание нейтрофилов, содержащих в цитоплазме гранулы диформазана (НСТ-позитивных клеток).

Биологическую активность преднизолона в пробе с его исходной концентрацией и в пробе с надосадочной жидкостью, полученной после инкубации раствора преднизалона с эритромассой, вычисляют в процентах снижения НСТ-активности нейтрофилов в сравнении с показателем контрольной пробы без преднизолона. Сорбционную активность эритроцитов человека к преднизолону вычисляют по разнице показателей в пробе с надосадочной жидкостью и в пробе с раствором преднизолона и при выявлении разницы между этими показателями более 5 процентов считают целесообразным проведение экстракорпоральной иммунофармакотерапии с использованием аутоэритроцитов, обработанных раствором преднизолона.

Сущность предлагаемого способа поясняется клиническими примерами.

Пример 1. Больной У., 52 года. Диагноз: несросшийся диафизарный перелом правой большеберцовой кости, хронический остеомиелит, ИДС гипосупрессорного типа с признаками гиперактивации фагоцитов.

Сорбционную активность эритроцитов (САЭ) оценивали по способности преднизолона в концентрации 1 мкг/мл подавлять активность нейтрофилов перед и после инкубации его с эритроцитами, инкубацию осуществляли в термостате при температуре 37^oC в течение 1 часа после смешивания равных объемов эритромассы с раствором преднизолона. САЭ вычисляли в процентах падения биологической активности преднизолона после инкубации его с эритроцитами.

В контрольной пробе без преднизолона процент НСТ-активности составил 62%. В 1-й опытной пробе (с добавлением раствора преднизолона в исходной концентрации) НСТ-активность нейтрофилов составила 46%. Во второй опытной пробе (с добавлением надосадочной жидкости после инкубации эритроцитов с преднизолоном) НСТ-активность нейтрофилов - 57%. Показатель САЭ составил 11% (57% - 46%=11%).

При определении способности эритроцитов больного сорбировать преднизолон показатель НСТ-активности нитрофилов в пробе с надосадочной жидкостью, полученной после инкубации эритромассы пациента с раствором преднизолона в исходном концентрации превысил показатель НСТ-активности в пробе с добавлением преднизолона. Таким образом, данному больному целесообразно проведение экстракорпоральной иммунофармакотерапии с использованием аутоэритроцитов, обработанных раствором преднизолона в комплексе лечебных мероприятий с целью снижения гиперактивации иммунной системы.

Пример 2. Больная Д., 19 лет. Диагноз: первично-открытый инфицированный двойной перелом средней трети правой большеберцовой кости со смещением, некроз мягких тканей в средней трети правой голени, инфицированная рана правой стопы, НДС гиперсупрессорного типа выраженного характера с признаками гиперактивации фагоцитирующих лейкоцитов.

В контрольной пробе (без преднизолона) процент НСТ-активности нейтрофилов составил 77%. В 1-й опытной пробе (с добавлением раствора преднизолона в исходной концентрации) НСТ-активность составила 58%. Во 2-й опытной пробе (с добавлением надосадочной жидкости после инкубации эритромассы с раствором преднизолона) HСT-активность нейтрофилов - 54%. Показатель САЭ составил 5% (58 - 54%=4%).

Следовательно, при определении способности эритроцитов данной больной сорбировать преднизолон показатель НСТ-активности нейтрофилов в пробе с надосадочной жидкостью, полученной после инкубации эритромассы с раствором преднизолона превышает показатель НСТ-активности в пробе с раствором преднизолона в исходной концентрации не более чем на 5%. Проведение экстракорпоральной иммунофармакотерапии с использованием аутоэритроцитов, обработанных преднизолоном нецелесообразно, ввиду низкой сорбционной активности эритроцитов.

Таким образом, предлагаемый "Способ определения способности эритроцитов человека сорбировать преднизолон" позволяет по сравнению с известными технологиями повысить эффективность лечения за счет определения индивидуальной сорбционной способности эритроцитов пациента к преднизолону до применения в комплексе лечебных мероприятий иммунофармакотерапии.

Источник информации
1. А.С. СССР N1778707, БИ 44, G 01 N 33/531.

Изобретение относится к области медицины, в частности к иммунологии. Способ обеспечивает повышение эффективности лечения за счет определения индивидуальной сорбционной активности эритроцитов пациента к преднизолону до применения в комплексе лечебных мероприятий иммунофармакотерапии. Проводят постановку реакции клеточной иммуносорбции и получение надосадочной жидкости, при этом выделенную эритромассу инкубируют с раствором преднизолона в концентрации 1 мкг/мл в равных объемах в течение 60 мин, центрифугируют и получают надосадочную жидкость, затем в первую пробу вносят 0,05 мл среды 199, во вторую - 0,05 мл раствора преднизолона в исходной концентрации и в третью - 0,05 мл надосадочной жидкости, полученной после инкубации преднизолона с эритромассой, затем во все пробы добавляют 0,05 мл раствора нитросинего тетразолия и 0,1 мл цельной крови пациента, после чего инкубируют, центрифугируют, удаляют надосадочную жидкость, из клеточного осадка готовят мазки, фиксируют метанолом и окрашивают нейтральным красным, подсчитывают процентное содержание нейтрофилов, в цитоплазме которых содержатся гранулы диформазана, затем оценивают биологическую активность преднизолона в первой опытной пробе по проценту снижения НТС-активности нейтрофилов в сравнении с контрольной пробой без преднизолона и определяют сорбционную активность эритроцитов по разнице показателей в пробе с надосадочной жидкостью и в пробе с раствором преднизолона.

Способ определения способности эритроцитов человека сорбировать преднизолон путем постановки реакции клеточной иммуносорбции и получения надосадочной жидкости, отличающийся тем, что выделенную эритромассу инкубируют с раствором преднизолона в концентрации 1 мкг/мл в равных объемах в течение 60 мин, центрифугируют и получают надосадочную жидкость, затем в первую пробу вносят 0,05 мл среды 199, во вторую - 0,05 мл раствора преднизолона в исходной концентрации и в третью 0,05 мл надосадочной жидкости, полученной после инкубации преднизолона с эритромассой, затем во все пробы добавляют 0,05 мл раствора нитросинего тетразолия и 0,1 мл цельной крови пациента, после чего инкубируют, центрифугируют, удаляют надосадочную жидкость, из клеточного осадка готовят мазки, фиксируют метанолом и окрашивают нейтральным красным, подсчитывают процентное содержание нейтрофилов, в цитоплазме которых содержатся гранулы диформазана, затем оценивают биологическую активность преднизолона в первой опытной пробе по проценту снижения НСТ-активности нейтрофилов в сравнении с контрольной пробой без преднизолона и определяют сорбционную активность эритроцитов по разнице показателей в пробе с надосадочной жидкостью и в пробе с раствором преднизолона.