ШТАММ ВНУТРИВИДОВЫХ ГИБРИДНЫХ КЛЕТОК ПОЧКИ ОВЦЫ (OVIS ARIES) СО СПЛЕНОЦИТАМИ ОВЦЫ ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ВИРУСОВ Российский патент 2003 года по МПК C12N5/06 

Изобретение относится к области ветеринарной биотехнологии, а именно к получению клеточных гибридов, используемых при вирусологических и биотехнологических исследованиях.

Методы гибридизации соматических клеток в настоящее время широко применяются для решения многих проблем биологии, медицины, ветеринарии. Гибридные линии клеток используются при исследовании механизмов клеточной дифференцировки, взаимодействия ядра и цитоплазмы, для изучения взаимодействия между вирусами и клетками хозяев.

Известен штамм внутривидовых гибридных клеток свиньи Suis Domestica, используемый для выделения и культивирования вируса классической чумы свиней.

Этот гибридный штамм чувствителен к вирусу энцефаломиокардита свиней, к вирусу кассической чумы свиней и вирусу ринопневмонии лошадей, трансмиссивному гастроэнтериту свиней. Является продуцентом интерферона (1).

Известен так же штамм межвидовых гибридных культур клеток почки эмбриона свиньи Suis domestica и лимфоцитов лошади Equs caballus L. для культивирования вирусов лошадей.

Гибридный штамм обладает следующими свойствами: культура представлена клетками эпителиоподобного типа, наряду с этим до 40% клеток составляют клетки лимфоцитоподобного типа. Культура хорошо пассируется, образуя сплошной монослой. Для культивирования клеток используется среда Игла 199 с добавлением 10-15% сыворотки крупного рогатого скота. Посевная концентрация клеток 50-100 тыс./мл. Коэффициент пересева 1:6-1:10. Методический индекс к 2-3 суткам культивирования составляет .

Сведения о контаминантах. Бактерии, грибы, микоплазмы при бактериологическом, цитологическом, цитохимическом исследованиях не обнаружены.

Концентрация клеток при замораживании составляет 3-5 млн./мл.

Гибридный штамм может быть использован для культивирования патогенных вирусов лошадей с целью изучения различных биологических, иммунологических свойств вирусов и наработки вирусных антител (2).

В задачу наших исследований входило получить гибридный штамм почки овцы со спленоцитами овцы, обладающий высокой чувствительностью к вирусам.

Гибридный штамм получен путем слияния неразмножающихся в культуре лимфоцитов овцы с перевиваемыми мутантными клетками овцы ПО-100-ТК^-. Клетки штамма активно растут и размножаются на синтетических питательных средах с добавлением сыворотки эмбрионов крупного рогатого скота.

Штамм внутривидовых гибридных клеток почки овцы (Ovis aries) с спленоцитами овцы назван авторами ПО-TK^-хC и хранится в Специализированной Коллекции перевиваемых соматических клеточных культур сельскохозяйственных и промысловых животных (СХЖ РАСХН) под 57.

Предложенный штамм обладает следующими свойствами:
МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ПРИЗНАКИ - внутривидовой гибридный штамм состоит из 2-х популяций клеток: эпителиоподобных, напоминающих клетки исходной мутантной культуры, и округлых с плотным ядром и узким ободком цитоплазмы, характерных для лимфоцитов. Ядрышки округлые, интенсивно окрашенные, число ядрышек 1-2. Модальный класс хромосом составляет 48 (нормальный кариотип овцы составляет 2п= 54). Митотический индекс на 50 пассаже составляет на 3-и сутки культивирования.

КУЛЬТУРАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА - внутривидовой гибридный штамм культивируется в среде Игла MEM с добавлением 7-10% фетальной сыворотки крупного рогатого скота. Клетки снимаются с использованием стандартных растворов трипсина 0,25% и версена 0,02% в соотношении 1:9, с коэффициентом пересева 1:3-1:4. Монослой формируется через 3-4 суток при посевной концентрации 70-80 тыс. кл/мл.

Внутривидовой гибридный штамм чувствителен к вирусам ринопневмонии лошадей, вирусу инфекционного ринотрахеита, латентному герпес-вирусу к.р.с.

КРИОКОНСЕРВАЦИЯ ШТАММА - криоконсервацию штамма осуществляют по 2-ступенчатому методу. Температуру снижают по 1-2^oС до -30^o, а далее до -70^oС по 3-5^o в минуту. По достижении "минус" 70^oС ампулу с клетками помещают в жидкий азот. Криозащитную среду готовят по следующей прописи:
Среда Игла MEM - 50-60%
Сыворотка эмбрионов - 40-30%
ДМSO - 10%
ПРИМЕР:
Культуру клеток ПО-TK^-хC культивируют на среде Игла MEM с добавлением 7-10% сыворотки эмбрионов крупного рогатого скота. При пересеве клетки снимают со стекла 0,25% раствором трипсина и 0,02% раствором версена в соотношении 1:9 при 37^oС. Монослой формируется на 3-4 сутки культивирования. После образования монослоя культуру заражают вирусом.

Чувствительность культуры гибридных клеток ПО-TK^-xC к патогенным вирусам приведена в таблице.

Результаты исследований по чувствительности к вирусам клеток ПО-TK^-хC коррелирует с ранее опубликованными данными по культивированию вируса ринопневмонии в гибридной культуре А₄хЛ (2), по культивированию вируса ринотрахеита в культурах клеток ЛЭК, ПТП, ПЭК. Таким образом, предлагаемая культура клеток ПО-TK^-хC может служить в качестве резервной для выращивания вирусов.

Гибридный штамм ПО-TK^-хC найдет широкое применение в вирусологических исследованиях, для культивирования вирусов - ринопневмонии лошадей, герпес-вируса типа-3, ринотрахеита крупного рогатого скота, проведения диагностических исследований и в биотехнологии при производстве вирус-вакцин и диагностикумов.

ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ
1. Патент РФ 2082758, Кл. С 12 N 5/00, 1997.

2. А.С. СССР 1417475, Кл. С 12 N 5/00, 1988.

Изобретение относится к области ветеринарной биотехнологии, а именно к получению клеточных гибридов, используемых при вирусологических и биотехнологических исследованиях. Штамм внутривидовых гибридных клеток почки овцы получен путем слияния мутантного штамма ПО-ТК^- со спленоцитами овцы (ПО-ТК^-хС). Внутривидовой гибридный штамм (ПО-ТК^-хС) может быть использован для культивирования вирусов: инфекционного ринотрахеита, латентного герпес-вируса к.р.с., ринопневмонии, для производства вакцин и диагностикумов. 1 табл.

Штамм внутривидовых гибридных клеток почки овцы (Ovis aries) со спленоцитами овцы (ПО-ТК^-•С), депонированный в специализированной коллекции перевиваемых соматических клеточных культур сельскохозяйственных и промысловых животных (СХЖ РАСХН) под 57, для культивирования вирусов.