СПОСОБ МОДЕЛИРОВАНИЯ СИМБИОЗА КЛЕТОК ВОЗБУДИТЕЛЯ МЕЛИОИДОЗА С САПРОФИТОМ MYXOCOCCUS XANTHUS Российский патент 2004 года по МПК C12Q1/04 C12Q1/68 C12Q1/04 C12R1/00 

Изобретение относится к микробиологии и экологии, в частности к способам моделирования симбиоза (биоценоза) возбудителя мелиоидоза с сапрофитными скользящими микроорганизмами и последующего выявления единичных клеток B.pseudomallei в этом симбиозе.

Мелиоидоз относится к особо опасным инфекционным болезням человека и животных. Интерес к этому заболеванию объясняется двумя основными причинами (1):

1) в результате многолетней войны во Вьетнаме 10% контингента, участвующего в ней (около 200 тыс.), оказались потенциальными носителями мелиоидозной инфекции. Мелиоидоз, в силу ряда факторов, оказался “бомбой замедленного действия”. Усиленное внимание к ретроспективной серологической диагностике привело к тому, что и в ряде стран Европы стали выявлять случаи инфекции после пребывания людей в эндемической зоне;

2) интенсивные эпидемиологические исследования показали, что существовавшие ранее мнение об “узкой” эндемичности мелиоидоза, расположенной в тропической зоне Юго-Восточной Азии (Малайзия, Бирма, Вьетнам, Камбоджа, Таиланд), ошибочно. Заболеваемость среди животных и людей, причем не только по серологическим показателям, но и подтвержденная культурально, выявлена в западной Африке (Чад, Нигер), Центральной Америке (Чили, Сальвадор), многих странах Азии (Индия, Иран, Китай), Австралии.

По первоначальным представлениям роль резервуара (источника) мелиоидоза в природе отводилась животным. Исходя из признания паразитической природы возбудителей всех инфекционных болезней, в эпидемиологии господствовало положение (закон Л.В. Громашевского), что естественным источником заразного начала или возбудителей заразных болезней, поражающих человека, служит зараженный организм человека или животного (2). Эволюция взглядов на этот вопрос достаточно поучительна в плане консервативности традиционного мышления, которое не всегда трансформируется под напором даже самых очевидных фактов.

Вначале источником мелиоидоза считали крыс - Whitmore, 1913 (3); Stanton, Fletcher, 1925 (4). Подразумевалось, что заражение людей и животных происходит в результате употребления продуктов (фуража), контаминированных выделениями больных грызунов (5). Однако эта теория находила очень мало подтверждений.

Jirard (6) выдвинул предположение, согласно которому резервуаром мелиоидоза являются домашние животные, в частности, свиньи. Данная гипотеза имела достаточно большое количество сторонников - обзорная работа Краминского В.А. и Налетовой Л.Е. (7) и др. Особенно внушительно она стала выглядеть после того, как появились сообщения о крупных эпизоотиях мелиоидоза среди овец, коз и свиней (8). Но и эта гипотеза также не нашла подтверждений.

Наиболее серьезные противоречия в ней были вскрыты Fournier, Chambon (9): весьма существенным фактором, мешающим признать эту концепцию, по их мнению, являются те обстоятельства, что неизвестны случаи непосредственного заражения людей от животных и нет данных о передаче инфекции от больного животного здоровому.

Специальные эпизоотологические эксперименты в Австралии (10) показали, что заражение животных всегда осуществляется через воду и почву: стадо овец удалили с пастбищ, где вода и почва, что было подтверждено бактериологическими анализами, содержали возбудитель мелиоидоза, а больных и сероположительных животных забили. Мелиоидоза в данном стаде больше не обнаруживали, однако болезнь появилась в новом стаде, пригнанном на это же пастбище.

Таким образом, нет доказательств зоонозной природы мелиоидоза, поскольку при данной инфекции не существует эпизоотического процесса как такового, а заражение многочисленных видов животных носит характер не связанных между собой случаев спородических заболеваний, источником которых служат элементы внешней среды.

В настоящее время приобретают все более широкое распространение представления о мелиоидозе как о сапрозоонозе (11) или даже делается вывод, что мелиоидоз относится к сапронозам, а по определению Ocklitz et al. (12) - к геонозам.

Идея о сапрофитической природе палочки Уитмора (возбудителя мелиоидоза) зародилась еще в тридцатые годы в пастеровских институтах Индокитая. Об этом свидетельствовали полевые наблюдения на рисовых чеках исследователей того времени. Специалисты по таксономии в последующем рассматривало P.pseudomallei как свободно живущий вид и считали его нормальным обитателем почвы, отводя данному микробу даже определенные функции в минерализации и денитрификации этого субстрата (13).

Однако для окончательного утверждения представления о сапрофитном существовании клеток B.pseudomallei, в пользу которого свидетельствуют многие эпидемиологические и эпизоотологические наблюдения, таксономические характеристики микроорганизма, частое обнаружение возбудителя мелиоидоза во внешней среде эндемоэнзоотических зон, необходимы были дополнительные экологические исследования, которые не оставили бы сомнений в том, что основной средой обитания микроорганизма является почва.

Для доказательства сапрофитической природы возбудителя мелиоидоза Ларионов Г.М. и Беляков В.Д. (14) впервые в практике изучения патогенных микроорганизмов применили методологию экологического представления Mac. Arthur, Wilson (15) о стратегии отбора микроорганизмов. Под стратегией отбора по Работнову Т.А. (16) необходимо понимать “совокупность приспособлений, обеспечивающих виду возможности обитать совместно с другими организмами и занимать определенное положение в соответствующих биоценозах”.

Известно, что патогенные почвенные микроорганизмы (возбудители сапронозов) находятся в симбиотических взаимоотношениях с различными сапрофитами, к которым относится и представитель скользящих бактерий Myxococcus xanthus. Это убиквитарно распространенный микроорганизм подробно охарактеризован в кратком определителе бактерий Берги (17). M.xanthus формирует популяцию, состоящую из клеток с различными физиологическими функциями. При этом миксобактерии никогда не существуют как отдельные клетки, а формируют многоклеточные образования в виде плодовых тел. Клетки популяции миксококков секретируют тяжи слизи - “струи”, которые направляют движение совокупности клеток. Такая колония (плодовое тело) окружает клетки гетерологичных микроорганизмов и заключает их в своеобразные складки, называемые “карманами”. В них происходит как питание миксококков продуктами метаболизма захваченных клеток, так и сохранение последних.

Миксобактерии чаще всего встречаются в почве; они растут на разлагающемся растительном материале - траве, листьях, коре живых деревьев или помете животных. Есть виды миксобактерий, обитающих в водной среде (17).

Применение методологии экологического понятия о стратегии отбора микроорганизмов (16) для решения центрального вопроса - учения о сапронозах относительно места возбудителей этих инфекций в почвенных биотах - позволяет считать вполне возможным совместное обитание B.pseudomallei и M.xanthus как К-стратегистов (1). Фактом, подтверждающим сапрофитическую природу возбудителя мелиоидоза как К-стратегиста, является способность этого микроорганизма синтезировать бактериоцин - антибиотик (цефалоспорин), открытый и изученный Суховым В.В. (18).

Для выявления единичных клеток B.pseudomallei в плодовых телах M.xanthus не пригодны обычные (традиционные) методы лабораторной диагностики возбудителя мелиоидоза из различного материала объектов: бактериоскопический, биологический, бактериологический, серологический.

Бактериоскопическай метод не пригоден, поскольку морфология клеток M.xanthus и B.pseudomallei могут совпадать, и в мазке - препарате выявить клетки B.pseudomallei среди множества клеток M.xanthus не представляется возможным.

Биологический метод не пригоден для выявления клеток B.pseudomallei в биомассе плодового тела M.xanfhus, поскольку единичные клетки B.pseudomallei, экранированные слизью плодового тела, приобретают свойства пониженной вирулентности и заражение биопробного животного таким материалом невозможно.

Бактериологический метод для выявления единичных клеток B.pseudomallei в плодовых телах M.xanthus не пригоден, поскольку культуральные свойства M.xanthus по сравнению с B.pseudomallei более высокие и очиститься от слизи плодовых тел M.xanthus даже на селективных средах не представляется возможным.

Серологические методы, даже такие высокочувствительные, как РПГА и ИФА, также не пригодны для выявления единичных клеток B.pseudomallei в плодовых телах M.xanfhus, поскольку с помощью этих реакций диагностируются только от n·10³ до 10⁵ клеток возбудителя.

Антоновым Ю.В. с соавт. (19) предложена методика идентификации L форм (дефектных по клеточной стенке морфологических вариантов) возбудителя мелиоидоза, не растущих на обычных питательных средах и полученных от экспериментально зараженных животных высевом на специальную полужидкую среду. Эта методика может служить аналогом способу выявления единичных клеток B.pseudomallei в плодовых телах M.xanthus, с помощью генетической трансформации, предлагаемому нами.

Совместное существование микроорганизмов в различных экосистемах привело к естественному клонально-селекционному механизму поддержания и сохранения вида бактерий в природе. И именно внутривидовое и межвидовое многообразие микроорганизмов, а точнее - генотипический и фенотипический полиморфизм обусловил возможность осуществления генетических рекомбинационных процессов в различных экологических нишах. Все генетические процессы в природе: возникновение мутантов, адаптивная изменчивость и др. происходят “спонтанно” (20). “Спонтанным” в биологии называют события (21), причина которых неизвестна. Так, спонтанной трансформацией (22) называют трансформацию, происходящую при совместном выращивании штаммов, обладающих разными признаками, или при контакте клеток одного штамма с культуральной жидкостью другого. Впервые это явление на модели возбудителя мелиоидоза было открыто нами еще в 1973 г., а спонтанный генетический процесс трансформации в почве у этого микроорганизма - несколько позже (23).

Метод генетической трансформации для быстрого диагноза (выявления) Moraxella osloensis был использован Elliot J. еще в 1974г (24). Эта работа является прототипом нашему способу выявления единичных клеток B.pseudomallei в плодовых телах M.xanthus.

Целью настоящего изобретения является создание биологической модели симбиоза патогенного микроорганизма (B.pseudomallei) с убиквитарно распространенным сапрофитом (M.xanthus), позволяющей наиболее полно воспроизвести экологические закономерности биоценоза этих микроорганизмов в природе, при этом разработать метод выявления единичных клеток возбудителя мелиоидоза в биомассе этого сообщества.

Для достижения поставленной цели на поверхности плотной питательной среды в чашке Петри засевают штрихом культуру B.pseudomallei в виде концентрической окружности, a M.xanthus - в виде короткого штриха в центре круга (см. схему - Пример №1). Засеянные культуры микроорганизмов предварительно подращивают в термостате при 34°С в течение 72-96 ч до появления на поверхности агара роста культуры M.xanthus в виде струй и отдельных скоплений, называемых плодовыми телами. Струи с плодовыми телами M.xanthus пересекают штрихи биомассы B.pseudomallei, при этом в складки-карманы плодовых тел оказываются включены клетки возбудителя мелиоидоза. Часть клеток B.pseudomallei лизируется внутри плодовых тел, а некоторые клетки возбудителя мелиоидоза адаптируются к новой среде обитания, персестируя в ней, и даже размножаются, т.е. проявляют симбиоз.

Для выявления клеток B.pseudomallei в плодовых телах M.xanthus бактериологическую петлю массы плодового тела M.xanthus, предположительно содержащей единичные клетки возбудителя мелиоидоза, засевают в питательный бульон (5 мл) и культивируют при 34-37°С в течение 48 ч. Затем бульонные двухсуточные культуры бактерий хлороформируют (т.е. эмульгируют с 2 мл хлороформа до получения жидкости молочного цвета). Хлороформированные культуры бактерий на 2 ч помещают в термостат, а затем переносят в холодильник (для удаления паров хлороформа и его полного осаждения). Хлороформенные лизаты культивированных клеток B.pseudomallei являются трансформирующим материалом (донорной ДНК) для дальнейшей постановки генетической трансформации.

Для осуществления генетической трансформации готовят смеси суточной реципиентной культуры - универсального реципиента P.pseudomallei СВБК 141 Pur^-, запатентованного нами (25), с исследуемыми лизатами в равных объемах (по 1 мл) и высевают их на минимальную среду (1) по 0,1 мл. Чашки с посевами инкубируют 4-5 суток.

На чашках с посевами универсального реципиента просматривается фоновый рост, образованный ауксотрофными клетками и наблюдается появление колоний прототрофных клеток (рекомбинантов), которые появляются в результате генетической трансформации универсального реципиента донорным материалом (ДНК клеток B.pseudomallei в хлороформенных лизатах).

Использование генетической трансформации для выявления клеток B.pseudomallei в плодовых телах M.xanthus позволяет обнаружить единичные клетки возбудителя мелиоидоза за счет предварительного инкубирования в пермессивных условиях исследуемых проб до их хлороформирования. Эта процедура аналогична способу амплификации ДНК в пробах при постановке современной методики полимеразной цепной реакции (ПЦР), которая так же позволяет опосредованно (по наличию гомологичной ДНК) выявлять единичные бактериальные клетки в загрязненной среде, но для этого нужно располагать соответствующими праймерами и дорогостоящей аппаратурой.

Пример №1.

Для моделирования симбиоза клеток возбудителя мелиоидоза с сапрофитом M.xanthus на поверхности плотной питательной среды (агар Хоттингера) в чашке Петри посеяли штамм B.pseudomallei 100 штрихом в виде концентрической окружности, a M.xanthus в виде короткого штриха в центре круга (см. схему).

Посев культур микроорганизмов предварительно подращивали в термостате при 37°С в течение 96 ч до появления на поверхности агара роста культуры M.xanthus в виде струй и отдельных скоплений, называемых плодовыми телами. Струи с плодовыми телами M.xanthus пересекают штрихи биомассы B.pseudomallei 100, при этом в складки-карманы плодовых тел оказываются включены клетки возбудителя мелиоидоза. Часть клеток B.pseudomallei лизировались внутри плодовых тел M.xanthus, а некоторые клетки возбудителя мелиоидоза, обладающие бактериоциногенностью и антилизоцимной активностью, адаптировались к новой среде обитания, персистировали в ней и даже размножались, т.е. проявляли симбиоз.

Пример №2.

Для выявления клеток B.pseudomallei 100 в плодовых телах M.xanthus бактериологическую петлю массы плодового тела M.xanthus, предположительно содержащей единичные клетки возбудителя мелиоидоза (Пример №1), засеяли в 5 мл питательного бульона (Хоттингера) и культивировали при 34°С в течение 48 ч. Затем бульонную двухсуточную смесь бактерий хлороформировали - эмульгировали с 2 мл хлороформа до получения жидкости молочного цвета. Хлороформированный лизат бактерий на 2 ч помещали в термостат при 37°, а затем переносили в холодильник (для удаления паров хлороформа и его полного осаждения). Хлороформенные лизаты культивированных клеток B.pseudomallei 100 явились трансформирующим материалом (т.е. донорный ДНК) для постановки генетической трансформации.

Для осуществления генетической трансформации смешали 1 мл суточной бульонной культуры реципиента B.pseudomallei СВБК 141 Pur^- (авт. свидетельство № 1131902) с 1 мл исследуемого лизата и высеяли 0,1 мл смеси на минимальную среду (1). Чашки с посевами инкубировали 4-5 суток.

На чашках с посевами смесей реципиентных клеток с исследуемыми лизатами наблюдался фоновый рост, образованный ауксотрофными клетками реципиента, и колонии прототрофных клеток (рекомбинантов), которые появились в результате генетической трансформации пуринзависимых клеток универсального реципиента с донорным материалом (ДНК прототрофных клеток B.pseudomallei 100 в хлороформенных лизатах).

Пример №3.

Для определения чувствительности метода генетической трансформации при выявлении единичных клеток B.pseudomallei среди клеток бактериальной массы плодовых тел, клеток почвенных микроорганизмов, воздушной микрофлоры и кишечной палочки в 3 колбы с 50 мл среды BHI (фирмы “Difco”) внесли по 1 бактериологической петле биомассы плодовых тел M.xanfhus; по 2 мл смыва питательным бульоном с поверхности пола коридора лаборатории; по 1 бактериологической петле биомассы E.coli С. В первую колбу добавили 5-10 клеток оттитрованной культуры B.pseudomallei 100; в другую - n·10² клеток и в третью колбу - n·10³ клеток B.pseudomallei 100. Все три смеси, содержащие различное количество прототрофных клеток B.pseudomallei 100, культивировали при 34°С в течение 48 ч.

В последующем, как в Примере 2, из всех трех бактериальных смесей приготовили хлороформенные лизаты и пользовались ими как донорным материалом при постановке генетической трансформации.

Все три хлороформенных лизата бактериальных смесей, содержащие различное исходное количество клеток B.pseudomallei 100, обладали трансформулирующей активностью, что опосредованно свидетельствовало о наличии ДНК клеток B.pseudomallei в пробах, а посторонняя микрофлора в смесях на осуществление рекомбинационного процесса не повлияла.

Таким образом, созданная биологическая модель симбиоза патогенного микроорганизма (B.pseudomallei) с убиквитарно распространенным сапрофитом (M.xanthus), позволяющая наиболее полно воспроизвести экологические закономерности биоценоза этих микроорганизмов в природе, а также разработка метода выявления единичных клеток возбудителя мелиоидоза в биомассе этого сообщества могут служить способом для изучения экологических систем с определением экологической валентности компонентов, что важно для разрешения эпидемиологических проблем.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Тихонов Н.Г. Мелиоидоз. - Волгоград, 1995, 222 с.

2. Громашевский Л.В. Механизм передачи инфекции. В кн.: Руководство по микробиологии, клинике и эпидемиологии инфекционных болезней. - М.: Мед.изд., 1965, с.114-139.

3. Whitmore A.//J. Hyg. London, 1913, vol.18, p.1-34.

4. Stanton A.T., Fletcher W. // J.Hyg.-125-Vol.23-P/347-363.

5. Stanton A.T., Flatcher W. // Stud.Jnst.Med.Res. F.M.S., №21.-Londan: J.Ball.Sans and Danielson, 1932.-103 p.

6. Jirard Y.// Bull. Soc. Pathol.Exot-1936.- Vol.29, №6.-P.712-716.

7. Краминский В.А., Налетова Л.Е. География мелиоидоза. // Мед.география.-М., 1972, т.5, с.5-20.

8. Shanta C.S. //J.Maloy Vet.Med.Assoc.-1960.-Vol.3.-P.35-38.

9. Fourier J., Chambon Z. Za melioidose, maladie d' actualite et le bacille de Whitmore - Paris: Ed.Med. Flammarion, 1958.-P.47-90.

10. Jaws J., Hall W.// Aust.Vet.V.-1964.-Vol.40., №9 -P.309-314.

11. Voigt A., KIeine F. - D.Zoonoson.-Jena: VEB Yustav Fisher Veriag. 1973 -P.24-25, 234-235.

12. Ocklitz H.W., Mochmann H., Schneeweiss В.- Stuttgart -New Xork: Yustav Fisher Veriag, 1978-P.313-316.

13. Redfeam M.S.// Science -1964. Vol.146-P.648-649.

14. Ларионов Г.М., Беляков В.Д. Стратегия жизни и механизмов саморегуляции популяций возбудителей сапронозов (на примере P.pseudomallei) // Ж.Микроб.эпид. и Инф.забол.,-1990-№1, с.13-17.

15. Mac. Arthur R.H., Wolson E.О. - Princeton N.Y.: Princeton Univ. Press., 1967-P.208.

16. Работнов Т.А. Бюл. МОИП.отд.биол. -1975-№30, №2-с.5-11.

17. Хоулт Дж. Краткий определитель Берги. Скользящие бактерии.-М.: Мир, 1980, с.49-53.

18. Сухов В.В., Ларионов Г.М. О природе антагонистической активности микроба мелиоидоза // Генетика и биохимия вирулентности возбудителей особо опасных инфекций: Материалы Рос.научн.конф.- Волгоград, 1992,-с.208.

19. Способ идентификации L-форм возбудителя мелиоидоза. - А.С. 1190638 СССР, МКИ³ C 12 N 1/00.

20. Чернощеков К.А., Лепехин А.В., Чернощеков М.А. Эволюционный механизм возникновения “спонтанных” мутаций микробов // Природно-очаговые инфекции в России. - Омск, 1988, с.23-24.

21. Рингерц Н., Сэвидж Р. Спонтанное слияние клеток. Гибридные клетки.-М.: Мир, 1979, 415 с.

22. Прозоров А.А. Генетическая трансформация и трансфекция.-М.: Наука, 1980, с.157-164.

23. Буланцев А.Л., Лозовая Н.А. Спонтанная генетическая трансформация у Pseudomonas pseudomallei. - Молекулярная генетика, микробиология и вирусология, 1985, №9, с.11-14.

24. Ellint J. Simple genetic transformation assay for rapid diagnosis of Moraxella osloensis // Appl. Microbial, 1974, v.27, №1, р.13-24.

25. Штамм Pseudomonas pseudomallei СВБК 141 Pur^- - универсальный реципиент для генетической идентификации культур. - А.с. СССР № 1131902: МКИ³ C 12 N 15/00.

Изобретение относится к микробиологии и экологии, в частности, к способам моделирования симбиоза (биоценоза) возбудителя мелиоидоза с сапрофитными скользящими микроорганизмами и последующим выявлением клеток B. pseudomallei в этом симбиозе. Способ предусматривает засев на поверхность плотной питательной среды культуры B. pseudomallei и M.xanthus штрихами в определенной аранжировке. После подращивания посевов при 34°С в течение 72-96 ч в складках-карманах плодовых тел M.xanthus оказываются включены клетки возбудителя мелиоидоза. Часть клеток B. pseudomallei лизируются внутри плодовых тел, а некоторые клетки возбудителя мелиоидоза адаптируются к новой среде обитания, персистируют в ней и даже размножаются, т.е. проявляют симбиоз. Для выявления клеток B. pseudomallei в плодовых телах M.xanthus предварительно биомассу плодовых тел, предположительно содержащую единичные клетки возбудителя мелиоидоза, подращивают в питательном бульоне, затем хлороформируют и хлороформенным лизатом пользуются как донорным материалом (т.е. препаратом ДНК) для осуществления генетической трансформации. Генетическую трансформацию осуществляют на минимальной среде по маркеру ауксотрофности с помощью универсального реципиента Р. Pseudomallei СВБК 141 Pur. О наличии клеток B. pseudomallei в плодовых телах судят опосредованно по формированию прототрофных колоний (рекомбинантов) на минимальной среде, которые появляются в результате генетической трансформации пуринзависимых клеток универсального реципиента с донорным материалом. Изобретение обеспечивает создание биологической модели симбиоза патогенного микроорганизма (B. pseudomallei) с убиквитарно распространенным сапрофитом (М.xanthus), позволяет выявить единичные клетки возбудителя мелиоидоза в биомассе этого сообщества, что служит для изучения экологических систем с определением экологической валентности компонентов. 1 з.п.ф-лы, 1 ил.

1. Способ моделирования симбиоза клеток возбудителя мелиоидоза с сапрофитом Myxococcus xanthus, включающий посев на плотную питательную среду патогенного и сапрофитного микроорганизмов для их совместного роста, причем посев микроорганизмов на поверхность агара осуществляют штрихами в определенной аранжировке - Burkholderia pseudomallei в виде концентрической окружности, а М.xanthus - в виде короткого штриха внутри круга, инкубирование в термостате при температуре 34-37°С в течение 72-96 ч до появления на поверхности агара роста М.xanthus в виде "струи" с плодовыми телами, предположительно содержащими клетки B. pseudomallei, с последующим отбором проб для опосредованного выявления в них единичных клеток возбудителя мелиоидоза.2. Способ по п.1, отличающийся тем, что опосредованное выявление единичных клеток возбудителя мелиоидоза в биомассе плодовых тел М.xanthus осуществляют путем высевания проб в питательный бульон и культивирования при температуре 34-37°С в течение 48 ч, затем бульонные культуры бактерий хлороформируют, эмульгируя их до получения жидкости молочного цвета, хлороформированные пробы на 2 ч помещают в термостат, затем переносят в холодильник для удаления паров хлороформа и его полного осаждения, полученные хлороформированные лизаты культивируемых клеток B. pseudomallei используют в качестве трансформирующего материала, содержащего донорную ДНК, для проведения генетической трансформации путем смешивания 1 мл суточной бульонной культуры B. pseudomallei СВБК - 141 pur с 1 мл исследуемого лизата и высевом по 0,1 мл смеси на минимальную среду, чашки с посевами инкубируют 4-5 суток до появления сформированных прототрофных колоний в результате генетической трансформации пуринзависимых клеток универсального реципиента, свидетельствующих о симбиозе клеток возбудителя мелиоидоза с сапрофитом М.xanthus.