Изобретение относится к биотехнологии и медицине, касается производства медицинских иммунобиологических препаратов и лабораторной диагностики возбудителя инфекционного заболевания человека, в частности средства и способа экспресс-диагностики (индикации) вируса клещевого энцефалита.
Известно средство и способ экспресс-диагностики антигена вируса клещевого энцефалита путем иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием приготовленного иммуноглобулина против клещевого энцефалита и его конъюгата с пероксидазой хрена [1].
Однако данный способ длителен по времени (6-7 часов), трудоемок, так как необходимо выполнение пяти этапов исследования, а также при выполнении способа требуется дорогостоящее оборудование.
Ближайшим по технологической сущности (прототипом) к предлагаемому нами способу экспресс-диагностики антигена вируса клещевого энцефалита является способ путем проведения реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) ближайшим средством и способом для экспресс-диагностики антигена вируса клещевого энцефалита (прототипом) служит эритроцитарный диагностикум и способ его получения. Эритроцитарный диагностикум представляет собой 3%-ную взвесь эритроцитов барана, фиксированных формалином или акролеином, обработанных танином и сенсибилизированных иммуноглобулином к вирусу клещевого энцефалита [2, 3].
Эритроцитарный диагностикум получают следующим образом:
3%-ную взвесь фиксированных акролеином или формалином и тонизированных бараньих эритроцитов сенсибилизируют 0,05-0,1%-ным иммуноглобулином против клещевого энцефалита при 56°С в течение 30 минут. Затем центрифугируют 10 минут при 2000 оборотах в минуту, дважды отмывают в 1%-ной НКС с последующим центрифугированием, осадок ресуспендируют наполнителем: ФБР рН 7,2, пептон - 3%, сахароза - 1%.
Сенсибилизированные эритроциты специфически связываются с антигеном возбудителя в исследуемом материале, что визуально выражается в проявлении феномена гемагглютинации в РНГА.
Способ РНГА ставят микрометодом в общем объеме 75 мкл, используя пластины U системы "Такачи" фирмы "Мэтримпэкс" или любые другие планшеты, предназначенные для серологических анализов.
Способ РНГА ставят следующим образом:
Во все лунки планшета раскапывают по 25 мкл 1%-ного раствора НКС. В первую лунку каждого ряда вносят по 25 мкл антигена (К+, К-, исследуемый материал). Перемешивают и последовательно переносят во все лунки соответствующих рядов. Получают разведения антигенов с коэффициентом 2, затем во все лунки добавляют по 25 мкл 1%-ной НКС и 1%-ную взвесь эритроцитарного диагностикума. Проводят контроль эритроцитов на спонтанную агглютинацию: в 2-3 лунки вносят по 50 мкл 1%-ной НКС и по 25 мкл 1%-ной взвеси эритроцитарного диагностикума. Планшет встряхивают в горизонтальной плоскости для перемешивания ингредиентов и помещают при температуре (20±2)°С на 2-2,5 часа или на 1-1,5 часа при температуре (37±2)°С.
При отсутствии агглютинации в контролях эритроцитов реакцию учитывают по 4-крестовой системе визуально. Положительным результатом в РНГА считают агглютинацию эритроцитов на +3 +4. За титр антигена принимают его максимальное разведение, давшее гемагглютинацию на +3 +4. РНГА с К+ должна быть положительной, с К- - отрицательной.
Однако данное средство, способ его получения и способ экспресс-диагностики антигена вируса клещевого энцефалита имеет следующие недостатки:
- длительность приготовления эритроцитарного диагностикума, чувствительность которого зависит от многих факторов: физиологического состояния эритроцитов барана, чистоты акролеина (или формалина), танина, температурных режимов каждого этапа технологического процесса и, наконец, от чистоты, специфической активности и авидности иммуноглобулина;
- выполнение способа РНГА занимает несколько часов, при этом теряется время и падает эффективность экстренной серопрофилактики пострадавшим, которая наиболее высока в первые сутки после укуса инфицированного клеща;
- способ РНГА недостаточно чувствителен и тем самым не дает желаемого результата, что является одним из важных условий для экспресс-диагностики антигена вируса клещевого энцефалита.
Задачей, решаемой предлагаемым изобретением, является сокращение времени, повышение чувствительности, доступность и экономичность способа при сохранении высокой его специфичности.
Поставленная задача решается средством для экспресс-диагностики, содержащим 2%-ный коагглютинирующий реагент, полученный путем добавления к 10%-ному растворенному в дистиллированной деионизованной воде стафилококковому реагенту равного количества 0,1%-ного высокоочищенного и высокоавидного иммуноглобулина против клещевого энцефалита, проведения сенсибилизации в течение 1-1,5 часов при температуре 25-30°С, ресуспендирования осадка в 0,15 М растворе хлорида натрия рН 5,4-5,5 и доведения полученного коагглютинирующего реагента до 2%-ного содержания и способом экспресс-диагностики антигена вируса клещевого энцефалита путем нанесения на предметное стекло 15-20 мкл исследуемого материала и добавления в него равного количества средства, для экспресс-диагностики, содержащего 2%-ный коагглютинирующий реагент, полученный путем сенсибилизации 10%-ного стафилококкового реагента высокоавидным и высокоочищенным иммуноглобулином против клещевого энцефалита, тщательного перемешивания посредством покачивания предметного стекла и визуального определения через 2-7 минут по феномену коагглютинации наличия антигена вируса клещевого энцефалита и его количества по 3-х балльной системе.
В проанализированной авторами патентной и научно-медицинской литературе не найдено данной совокупности отличительных признаков, приводящих к новому техническому результату, и они явным образом не следуют для специалиста из уровня техники. Способ, средство для экспресс-диагностики антигена вируса клещевого энцефалита и способ его получения были апробированы в лабораторных условиях. Таким образом, данные технические решения соответствуют критериям изобретения: "новизна", "изобретательский уровень", "промышленно применимо".
Средство для экспресс-диагностики антигена вируса клещевого энцефалита готовят следующим образом:
Сухой 10%-ный стафилококковый реагент растворяют в дистиллированной деионизованной воде, выдерживают 1,5-2,0 часа при комнатной температуре для набухания и прибавляют к 10%-ному растворенному в дистиллированной деионизованной воде стафилококковому реагенту равное количество 0,1%-ного высокоочищенного и высокоавидного иммуноглобулина против клещевого энцефалита и проводят сенсибилизацию в течение 1-1,5 часов при температуре 25-30°С, затем центрифугируют 20 минут при 3000 оборотах в минуту, осадок ресуспендируют в 0,15 М растворе хлорида натрия рН 5,4-5,5 до 2%-ного содержания коагглютинирующего реагента, добавляют мертиолят натрия до 0,001%-ного содержания и сохраняют при температуре (7±3)°С в течение 4-6 месяцев.
Способ экспресс-диагностики антигена вируса клещевого энцефалита осуществляют следующим образом:
На предметное стекло наносят 15-20 мкл исследуемого материала и добавляют в него равное количество средства для экспресс-диагностики, содержащее 2%-ный коагглютинирующий реагент, полученный путем сенсибилизации 10%-ного стафилококкового реагента высокоавидным и высокоочищенным иммуноглобулином против клещевого энцефалита, тщательно перемешивают посредством покачивания предметного стекла и визуально определяют через 2-7 минут по феномену коагглютинации наличие антигена вируса клещевого энцефалита по 3-х балльной системе.
“3+” - образование агглютината и интенсивное просвечивание реакционной смеси (реакция резко положительная);
“2+” - отчетливое просветление смеси (реакция положительная);
“+” - маловыраженное просветление смеси (реакция слабоположительная);
“-” - отсутствие просветления (реакция отрицательная).
Предлагаемый способ позволяет выявить как наличие, так и количественное содержание антигена вируса клещевого энцефалита в исследуемом материале. Для количественного определения делают разведения исследуемого материала на 0,15 М растворе хлорида натрия с коэффициентом 2 и наносят их по 15-20 мкл на предметное стекло, добавляют равное количество средства для экспресс-диагностики, содержащее 2%-ный коагглютинирующий реагент, полученный путем сенсибилизации 10%-ного стафилококкового реагента высокоавидным и высокоочищенным иммуноглобулином против клещевого энцефалита, перемешивают путем покачивания предметного стекла и через 2-7 минут визуально по феномену коагглютинации определяют титр антигена вируса клещевого энцефалита в исследуемом материале по 3-х балльной системе.
Положительным результатом предлагаемого способа считают коагглютинацию на +3 +2. За титр антигена (1 коагглютинирующая единица - КОАЕ) принимают его последнее разведение, давшее интенсивную коагглютинацию (на +2).
Предлагаемый нами способ и средство для экспресс-диагностики антигена вируса клещевого энцефалита основаны на феномене коагглютинации при взаимодействии специфических антител и антигена.
Для подтверждения специфичности предлагаемого способа и средства для экспресс-диагностики антигена вируса клещевого энцефалита титровали материал (субстрат), содержащий и не содержащий антиген вируса клещевого энцефалита (см. табл.1).
Предлагаемый способ и средство для экспресс-диагностики антигена вируса клещевого энцефалита сравнивали по чувствительности, определяя количество (титр) антигена вируса клещевого энцефалита путем разведения с коэффициентом 2 исследуемого материала на 0,15 М растворе хлорида натрия со способами экспресс-диагностики ИФА и РНГА. При этом титровали один и тот же материал, содержащий антиген вируса клещевого энцефалита, тремя способами: путем ИФА, РНГА и предлагаемым (см. табл.2). Исследуемым материалом служила вакцина клещевого энцефалита на разных стадиях технологического процесса.
Из приведенного материала следует, что предлагаемый способ экспресс-диагностики антигена вируса клещевого энцефалита, выполненный с помощью средства, содержащего 2%-ный коагглютинирующий реагент, полученный путем сенсибилизации 10%-ного стафилококкового реагента высокоавидным и высокоочищенным иммуноглобулином против клещевого энцефалита, специфичен, по количеству выявленного антигена вируса клещевого энцефалита и минимальному количеству белка Е во много раз чувствительнее способа РНГА и в среднем в 2-4 раза чувствительнее способа ИФА.
Таким образом, предлагаемый способ экспресс-диагностики антигена вируса клещевого энцефалита, выполненный с помощью средства, содержащего 2%-ный коагглютинирующий реагент, полученный путем добавления к 10%-ному растворенному в дистиллированной деионизованной воде стафилококковому реагенту равного количества 0,1%-ного высокоочищенного и высокоавидного иммуноглобулина против клещевого энцефалита, проведения сенсибилизации в течение 1-1,5 часов при температуре 25-30°С, ресуспендирования осадка в 0,15 М растворе хлорида натрия рН 5,4-5,5 и доведения полученного коагглютинирующего реагента до 2%-ного содержания, как и способы ИФА и РНГА, специфичен, но превосходит их по чувствительности и во много раз по экспрессности (время выполнения по ИФА - 6-7 часов, по РНГА 1.5-2.5 часа, по предлагаемому способу 2-7 минут), при простоте выполнения и экономичности (табл.3).
Список литературы
1. Лаптакова М.М., Морякин А.В., Лаврова Н.А. Разработка и применение иммунопероксидазной тест-системы для индикации вируса клещевого энцефалита. Сб. Актуальные вопросы медицинской биотехнологии и прикладной иммунологии. - Томск. - 1990. – том 36. – с 50-65.
2. Подоплекина Л.Е., Унгер Т.Н. Диагностикум эритроцитарный к вирусу клещевого энцефалита иммуноглобулиновый крысинный сухой для РНГА (эритроцитарный диагностикум к вирусу клещевого энцефалита). - ВФС 42. - 2874 - 97.
3. Подоплекина Л.Е., Унгер Т.Н. Экспериментально-производственный регламент № 527 - 95 Диагностикум эритроцитарный к вирусу клещевого энцефалита иммуноглобулиновый крысиный сухой для РНГА. НИИВС НПО “Вирион”.
(в обр.ед.)
Чувствительность ИФА, РНГА, РКОА по белку Е.
(мкг/мл)
название | год | авторы | номер документа |
---|---|---|---|
ДИАГНОСТИКУМ ПСЕВДОТУБЕРКУЛЕЗНЫЙ ЭРИТРОЦИТАРНЫЙ МОНОКЛОНАЛЬНЫЙ | 2008 |
|
RU2377308C1 |
СПОСОБ ИММУНОДИАГНОСТИКИ ИНФЕКЦИЙ | 1996 |
|
RU2136000C1 |
Способ получения диагностикума эритроцитарного сибиреязвенного антигенного сухого | 2023 |
|
RU2805871C1 |
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДИАГНОСТИКУМА ЭРИТРОЦИТАРНОГО САПНОГО ИММУНОГЛОБУЛИНОВОГО МОНОКЛОНАЛЬНОГО | 2017 |
|
RU2658434C1 |
Способ получения флуоресцирующего иммуноглобулинового диагностикума для выявления возбудителей риккетсиозов и коксиеллезов, флуоресцирующий иммуноглобулиновый диагностикум и его применение | 2021 |
|
RU2769578C1 |
Способ индикации токсинов СLоSтRIDIUм peRFRINGeNS | 1990 |
|
SU1745768A1 |
СПОСОБ ЭКСПРЕСС-ДИАГНОСТИКИ КЛЕЩЕВОГО ЭНЦЕФАЛИТА | 2001 |
|
RU2217758C2 |
СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ПСЕВДОТУБЕРКУЛЕЗА | 1998 |
|
RU2153172C1 |
НАБОР ЭРИТРОЦИТАРНЫХ ДИАГНОСТИКУМОВ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ АНТИТЕЛ К ВИРУСУ ЧУМЫ ПЛОТОЯДНЫХ В РЕАКЦИИ НЕПРЯМОЙ ГЕМАГГЛЮТИНАЦИИ | 1996 |
|
RU2119671C1 |
ШТАММ ВИРУСА КЛЕЩЕВОГО ЭНЦЕФАЛИТА (TICK-BORNE ENCEPHALITIS) СЕМЕЙСТВА FLAVIVIRIDAE, РОДА FLAVIVIRUS, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ | 2007 |
|
RU2352632C2 |
Изобретение относится к медицине и касается средства, способа его получения и способа экспресс-диагностики вируса клещевого энцефалита. Средство представляет собой 2%-ный коагглютинирующий реагент, полученный путем добавления к 10%-ному растворенному в дистиллированной деионизованной воде стафилококковому реагенту равного количества 0,1%-ного высокоочищенного и высокоавидного иммуноглобулина против клещевого энцефалита, проведения сенсибилизации в течение 1-1,5 часов при температуре 25-30°С, ресуспендирования осадка в 0,15 М растворе хлорида натрия рН 5,4-5,5 и доведения полученного коагглютинирующего реагента до 2%-ного содержания. Способ экспресс - диагностики антигена вируса клещевого энцефалита заключается в нанесении на предметное стекло 15-20 мкл исследуемого материала, добавлении в него равного количества средства, для экспресс-диагностики, тщательном перемешивании посредством покачивания предметного стекла и визуальном определении через 2-7 минут по феномену коагглютинации наличия антигена вируса клещевого энцефалита. 3 н. и 3 з.п. ф-лы, 3 табл.
ПОДОПЛЁКИНА Л.Е | |||
и др., Диагностикум эритроцитарный к вирусу клещевого энцефалита иммуноглобулиновый крысиный сухой для РНГА (эритроцитарный диагностикум к вирусу клещевого энцефалита) ВФС-42-2874-97 | |||
СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ КЛЕЩЕВОГО ЭНЦЕФАЛИТА | 1994 |
|
RU2095814C1 |
СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ ОМСКОЙ ГЕМОРРАГИЧЕСКОЙ ЛИХОРАДКИ И КЛЕЩЕВОГО ЭНЦЕФАЛИТА | 1997 |
|
RU2133964C1 |
Способ восстановления хромовой кислоты, в частности для получения хромовых квасцов | 1921 |
|
SU7A1 |
СПОСОБ АГГЛЮТИНАЦИОННОГО ИММУНОЛОГИЧЕСКОГО АНАЛИЗА | 1996 |
|
RU2170434C2 |
Авторы
Даты
2005-03-10—Публикация
2003-05-21—Подача