СПОСОБ ИНДИКАЦИИ ВОЗБУДИТЕЛЯ СИБИРСКОЙ ЯЗВЫ Российский патент 1994 года по МПК C12Q1/04 C12N1/00 

Изобретение относится к микробиологии, в частности к специфической индикации биологических средств методом флуоресцирующих антител (ФА).

Известен способ постановки биологической пробы для индикации возбудителя сибирской язвы, который включает введение исследуемого материала в объеме 0,2-0,5 мл внутрибрюшинно или подкожно в область внутренней поверхности бедра белым мышам, которых исследуют через 2-10 дней.

Недостатками этого способа являются: отсутствие указаний на порог чувствительности; длительные сроки исследования (2-10-е сутки).

Наиболее близким к предлагаемому изобретению относится способ заражения лабораторных животных для обнаружения возбудителя сибирской язвы, включающий внутрибрюшинное введение исследуемого материала в объеме 0,5 мл вместе с таким же объемом поливалентной противоботулинической антитоксической сыворотки четырем обработанным кортизоном белым мышам, которых вскрывают через 20-22 и 40-42 ч (по 2 мыши в каждый из указанных сроков). Из внутренних органов павших и забитых животных делают мазки-отпечатки для иммунофлуоресцентного исследованиия.

Недостатками этого способа являются низкий порог чувствительности (чувствительность этого метода для возбудителя сибирской язвы в чистых кульутрах колеблется в пределах сотен тысяч микробных клеток в 1 мл взвеси); необходимость исследования всех внутреннхи органов биопробных животных (места введения, лимфатических узлов, селезенки, печени, легких, крови, экссудата), что приводит к большому объему работ.

Указанные недостатки затрудняют проведение ускоренного анализа и могут привести к отрицательным результатам при наличии небольшого количества микробных клеток в исследуемых пробах.

Целью предлагаемого изобретения является повышение чувствительности биологического метоад обнаружения возбудителя сибирской язвы.

Сущность изобретения состоит в том, что белым мышам подкожно в область спины вводят 0,5-1 мл суспензии исследуемого материала в физиологическом растворе, суспензию предварительно смешивают с желтком куриного яйца в соотношении 1: 0,5-1: 0,7, к полученной смеси добавляют 0,5-0,7 мл гепаринизированной крови морской свинки, 5-7 мг кортизона и 15-25 мг полиэтиленгликоля с мол. м. 3000-6000, патологический материал для индикации берут с места введения.

Отличительные признаки, заключаются в том, что белым мышам подкожно в область спины вводят 0,5-1 мл суспензии исследуемого материала в физиологическом растворе, суспензию предварительно смешивают с желтком куриного яйца в соотношении 1: 0,5-1: 0,7, к полученной смеси добавляют 0,5-0,7 мл гепаринизированной крови морской свинки, 5-7 мг кортизона и 15-25 мг полиэтиленгликоля с мол. м. 3000-6000, патологический материал для индикации берут с места введения.

Изобретение осуществляется следующим образом. Исследуемый материал в количестве 0,5-1 мл смешивают с желтком куриного яйца в соотношении 1: 0,5-1: 0,7, к полученной смеси добавляют 0,5-0,7 мл гепаринизированной крови морской свинки, а также полиэтиленгликоль с мол. м. 3000-6000 и гидрокортизон из расчета 15-25 мг и 5-7 мг соответственно на одно животное. При необходимости к указанной смеси добавляют противоботулиническую сыворотку. Полученную суспензию набирают в шприц и вводят 2 белым мышам подкожно в область спины. При этом помощник фиксирует животное, а экспериментатор пинцетом захватывает кожу в складку в области крестца и вводит иглу под контролем глаза так, чтобы срез иглы был на уровне лопаток. После этого плавным движением, надавливая на поршень, вводят нужное количество материала.

Павших белых мышей, зараженных исследуемым материалом, вскрывают немедленно, живых убивают эфиром или хлороформом в два срока: через 4 и 8 ч после заражения. Павших или забитых грызунов прикрепляют к вскрывочной доске приколышами спиной кверху. Кожу над крестцом животного захватывают хирургическим пинцетом, приподнимают вверх, делают маленький поперечный разрез ножницами, в образовавшееся окошечко вводят закругленную браншу ножниц и делают дугообразные разрезы кожи, обходя по бокам место введения. Образовавшийся лоскут кожи (в виде фартука) откидывают на голову грызуна. При этом легко обнаруживается место введения за счет пропитывания мягких тканей кровью. Из места введения делают мазки-отпечатки, нефикцированные мазки окрашивают по Ребигеру, а фиксированные Леффлеровской синькой или люминесцирующей капсульно-соматической сывороткой и микроскопируют на предмет выявления капсульных бацилл сибирской язвы.

П р и м е р 1. Из расчета на одно животное берут 0,5 мл исследуемого материала, смешивают его с желтком куриного яйца в соотношении 1: 0,5, к полученной смеси добавляют 0,5 мл гепаринизированной крови морской свинки, 5 мг кортизона и 15 мг полиэтиленгликоля с мол. м. 3000. Приготовленную смесь набирают в шприц и вводят под кожу спины 2-белым мышам. По одной мыши вскрывают через 4 и 8 ч после введения исследуемой пробы. С места введения делают мазки-отпечатки, которые окрашивают по Ребигеру и люминесцирующей капсульно-соматической сывороткой.

Исследование приготовленных препаратов под световым и люминесцентным микроскопом позволяет выявить возбудителя сибирской язвы при его концентрации 10⁸-10⁷ и 10⁶-10¹ м. кл. в 1 мл соответственно через 4 и 8 ч.

П р и м е р 2. Из расчета на одно животное берут 0,7 мл исследуемого материала, смешивают его с желтком куриного яйца в соотношении 1: 0,6, к полученной смеси добавляют 0,6 лм гепаринизированной крови морской свинки, 6 мг кортизона и 20 мг полиэтиленгликоля с мол. м. 5000. Приготовленную смесь набирают в шприц и вводят под кожу спины 2 белым мышам. По одной мыши вскрывают через 4 и 8 ч после введения исследуемой пробы. С места введения делают мазки-отпечатки, которые окрашивают по Ребигеру и люминесцирующей капсульно-соматической сывороткой.

Исследование приготовленных препаратов под световым и люминесцентным микроскопом позволяет выявить возбудителя сибирской язвы при его концентрации 10⁸-10⁷ и 10⁶-10¹ м. кл. в 1 мл соответственно через 4 и 8 ч.

П р и м е р 3. Из расчета на одно животное берут 1,0 мл исследуемого материала, смешивают его с желтком куриного яйца в соотношении 1: 0,7, к полученной смеси добавляют 0,7 мл гепаринизированной крови морской свинки, 7 мг кортизона и 25 мг полиэтиленгликоля с мол. м. 6000. Приготовленную смесь набирают в шприц и вводят под кожу спины 2 белым мышам. По одной мыши вскрывают через 4 и 8 ч после введения исследуемой пробы. С места введения делают мазки-отпечатки, которые окрашивают по Ребигеру и люминесцирующей капсульно-соматической сывороткой.

Исследование приготовленных препаратов под световым и люминесцентным микроскопом позволяет выявить возбудителя сибирской язвы при его концентрации 10⁸-10⁷ и 10⁶-10¹ м. кл. в 1 мл соответственно через 4 и 8 ч.

Результаты представлены в таблице.

Использование предлагаемого способа, в частности введение исследуемого материала биопробным мышам вместе с желтком куриного яйца, гепаринизированной кровью морской свинки, полиэтиленгликолем и кортизоном вызывает задержку, размножение и накопление сибиреязвенного микроба в первые сутки только на месте введения. При этом создаются оптимальные условия в организме белых мышей для синтеза капсулы указанного возбудителя, резко повышается чувствительность биологического метода. Так, иммунофлуоресцентным методом возбудитель сибирской язвы при его концентрации 10⁸-10⁷ м. кл. в 1 мл может быть обнаружен через 4 ч, а при концентрации 10⁶-10¹ м. кл. в 1 мл через 8 ч. Таким образом, с помощью предлагаемого способа, по сравнению с известным, возбудитель сибирской язвы в небольших дозах может быть выявлен на 24 ч раньше. Локальное размножение и накопление возбудителя позволяет исследовать только место введения и исключает исследование других органов и тканей биопробных животных, что резко сокращает объем работ и ускоряет выдачу результатов исследования. Высокая чувствительность и надежность метода, только 2 срока исследования (4 и 8 ч), позволяет сократить количество биопробных животных с 4-х до 2-х. Способ введения исследуемых проб (под кожу спины) дает возможность исследовать большие объемы проб (1 мл), а также вводить другие компоненты, например, противоботулиническую сыворотку.

Область применения: медицинская микробиология, в частности специфическая индикация возбудителя сибирской язвы. Сущность изобретения: способ основан на постановке биологической пробы, включающей введение исследуемого материала белым мышам с последующим взятием патологического материала, изготовлением мазков-отпечатков, их фиксацией, нанесением флуоресцирующих иммуноглобулинов и учетом результатов при люминесцестном микроскопическом исследовании. Причем биопробным животным подкожно в область спины вводят 0,5 - 1 мл суспензии в физрастворе исследуемого материала, которую предварительно смешивают с желтком куриного яйца в соотношении 1 : 0,5 - 1 : 0,7, к полученной смеси добавляют 0,5 - 0,7 мл гепаринизированной крови морской свинки, 5 - 7 мг кортизона и 15 - 25 мг полиэтиленгликоля с мол. м. 3000 - 6000, патологический материал для исследования берут с места введения. 1 табл.

СПОСОБ ИНДИКАЦИИ ВОЗБУДИТЕЛЯ СИБИРСКОЙ ЯЗВЫ, включающий введение исследуемого материала животным с последующим взятием патологического материала, изготовление мазков-отпечатков, их фиксацию, нанесение флуоресцирующих иммуноглобулинов и учет результатов под люминесцентным микроскопом, отличающийся тем, что белым мышам подкожно в область спины вводят 0,5 - 1 мл суспензии исследуемого материала в физиологическом растворе, суспензию предварительно смешивают с желтком куриного яйца в соотношении 1 : 0,5 - 0,7, к полученной смеси добавляют 0,5 - 0,7 мл гепаринизированной крови морской свинки, 5 - 7 мг кортизона и 15 - 25 мг полиэтиленгликоля с мол. м. 3000 - 6000, патологический материал для индикации берут с места введения.