СПОСОБ ИНДИКАЦИИ ВОЗБУДИТЕЛЯ БРУЦЕЛЛЕЗА Российский патент 1997 года по МПК C12Q1/04 G01N33/569 

Предполагаемое изобретение относится к микробиологии, в частности, к специфической индикации биологических средств методом флуоресцирующих антител (ФА).

Известен бактериологический метод обнаружения возбудителя бруцеллеза путем посева исследуемого материала на питательные среды для выращивания бруцелл ("Бруцеллез", под редакцией акад. АМН СССР П.А.Вершиловой, М.Медицина, 1972 г. с. 198-206).

Недостатками этого метода являются длительные сроки исследования (до 30 суток).

Наиболее близким к предполагаемому изобретению является биологический метод индикации возбудителя бруцеллеза из патологического материала, заключающийся во введении этого материала биопробным животным, с последующим их умерщвлением, вскрытием и посевом кусочков органов на питательные среды для выращивания бруцелл. (Методические указания по профилактике и лабораторной диагностике бруцеллеза людей. Москва, 1980г. стр. 27-28).

Недостатками этого метода являются длительные сроки получения окончательных результатов (от 20 до 30 суток); необходимость исследования многих внутренних органов биопробных животных (лимфатических узлов, селезенки, печени, костного мозга), что приводит к большому объему работ.

Указанные недостатки затрудняют проведение ускоренного анализа и удлиняют сроки выдачи результатов исследования, особенно при наличии небольшого количества микробных клеток в исследуемых пробах.

Целью предполагаемого изобретения является повышение чувствительности биологического метода обнаружения возбудителя бруцеллеза.

Сущность предполагаемого изобретения заключается в том, что биопробным животным (белые мыши) подкожно в область спины вводят 0,5-1 мл суспензии в физрастворе исследуемого материала, которую предварительно смешивают с гепаринизированной кровью морской свинки в соотношении 1:0,5-1:0,7, к полученной смеси из расчета на одно животное добавляют 0,5-0,7 мл желтка куриного яйца, 5-7 мг кортизона и 90-120 мг сухого молока. Исследованию подвергают только место введения, мазки-отпечатки которого фиксируют по общепринятой методике, окрашивают флуоресцирующими иммуноглобулинами, полученные результаты учитывают при люминесцентном микроскопическом исследовании.

Отличительные признаки, в частности, добавление к исследуемой пробе желтка куриного яйца, гепаринизированной крови морской свинки и кортизона создают оптимальные условия для задержки, размножения и накопления возбудителя бруцеллеза только на месте введения, в результате отпадает необходимость в исследовании всех внутренних органов биопробных животных, что сокращает объем работы и ускоряет выдачу результатов исследования.

Добавление к исследуемой пробе сухого молока резко усиливает размножение бруцелл, ускоряет начало их роста, что сокращает сроки индикации указанного возбудителя.

Способ подкожной инокуляции в область спины дает возможность вводить исследуемый материал белой мыши в значительных объемах (ДО 2- 3 мл), что позволяет одновременно проводить контроль на наличие ботулотоксина.

Таким образом, применение этого способа позволяет обнаружить возбудителя бруцеллеза при его минимальной концентрации в исследуемом материале.

Изобретение осуществляется следующим образом.

Исследуемый материал в количестве 0,5-1 мл смешивают с гепаринизированной кровью морской свинки в соотношении 1:0,5-1:0,7, к полученной смеси добавляют 0,5-0,7 мл желтка куриного яйца, а также сухое молоко и гидрокортизон из расчета 90-120 мг и 5-7 мг соответственно на одно животное. При необходимости к указанной смеси добавляют противоботулиническую сыворотку. Полученную суспензию набирают в шприц и вводят 4-м белым мышам подкожно в область спины. При этом помощник фиксирует животное, а экспериментатор пинцетом захватывает кожу в складку в области крестца и вводит иглу под контролем глаза так, чтобы срез иглы был на уровне лопаток. После этого плавным движением надавливая на поршень, вводят нужное количество материала.

Павших белых мышей, зараженных исследуемым материалом, вскрывают немедленно, живых убивают эфиром или хлороформом в четыре срока: на 1,2,3 и 4 сутки после заражения. Павших или забитых грызунов прикрепляют к вскрывочной доске приколышами спиной кверху. Кожу над крестцом животного захватывают хирургическим пинцетом, приподнимают вверх, делают маленький поперечный разрез ножницами, в образовавшееся окошечко вводят закругленную браншу ножниц и делают дугообразные разрезы кожи, обходя по бокам место введения. Образовавшийся лоскут кожи (в виде фартука) откидывают на голову грызуна. При этом легко обнаруживается место введения за счет пропитывания мягких тканей кровью. Из места введения делают мазки-отпечатки, которые фиксируют в хлороформе в течение 10 минут и окрашивают бруцеллезной люминесцирующей сывороткой. Часть мазков окрашивают по Граму и Козловскому.

Пример N 1.

Из расчета на одно животное, берут 0,5 мл исследуемого материала, смешивают его с гепаринизированной кровью морской свинки в соотношении 1:0,5,к полученной смеси добавляют 0,5 мл желтка куриного яйца, 5 мг кортизона и 90 мг сухого молока. Приготовленную смесь набирают в шприц и вводят под кожу спины 4-м белым мышам. По одной мыши вскрывают на 1,2,3 и 4 сутки после введения исследуемой пробы. С места введения делают мазки-отпечатки, фиксируют их 10 минут в хлороформе и окрашивают люминесцирующей бруцеллезной сывороткой.

Исследование приготовленных препаратов под люминесцентным микроскопом позволяет выявить возбудителя бруцеллеза при его концентрации 10⁹-10⁵ и 10⁴-10¹ м.кл.в 1 мл соответственно на 1-2 и 3-4 сутки.

Пример N 2.

Из расчета на одно животное, берут 0,7 мл исследуемого материала, смешивают его с гепаринизированной кровью морской свинки в соотношении 1:0,6, к полученной смеси добавляют 0,6 мл желтка куриного яйца, 6 мг кортизона и 100 мг сухого молока. Приготовленную смесь набирают в шприц и вводят под кожу спины 4-м белым мышам. По одной мыши вскрывают на 1,2,3 и 4 сутки после введения исследуемой пробы. С места введения делают мазки-отпечатки, фиксируют их в хлороформе и окрашивают люминесцирующей бруцеллезной сывороткой.

Исследование приготовленных препаратов под люминесцентным микроскопом позволяет выявить возбудителя бруцеллеза при его концентрации 10⁹-10⁵ и 10⁴-10¹ м.кл. в 1 мл соответственно на 1-2 и 3-4 сутки.

Пример N 3.

Из расчета на одно животное, берут 1,0 мл исследуемого материала, смешивают его с гепаринизированной кровью морской свинки в соотношении 1:0,7, к полученной смеси добавляют 0,7 мл желтка куриного яйца, 7 мг кортизона и 120 мг сухого молока. Приготовленную смесь набирают в шприц и вводят под кожу 4-м белым мышам. По одной мыши вскрывают на 1,2,3 и 4 сутки после введения исследуемой пробы. С места введения делают мазки-отпечатки, фиксируют их 10 минут в хлороформе и окрашивают люминесцирующей сывороткой.

Исследование приготовленных препаратов под люминесцентным микроскопом позволяет выявить возбудителя бруцеллеза при его концентрации 10⁹-10⁵ и 10⁴-10¹ м.кл. в 1 мл соответственно на 1-2 и 3-4 сутки.

Результаты представлены в таблице N 2.

Использование заявляемого способа, в частности введение исследуемого материала биопробным мышам вместе с желтком куриного яйца, гепаринизированной кровью морской свинки, сухим молоком и кортизоном ускоряет начало роста бруцелл, резко усиливает их размножение, вызывает задержку и накопление бруцеллезного микроба только на месте введения. При этом резко повышается чувствительность биологического метода. Так, иммунофлуоресцентным методом возбудитель бруцеллеза при его концентрации 10⁴-10² м.кл. в 1 мл может быть обнаружен на 3 сутки, а при концентрации 10¹ м.кл. на 4 сутки от начала исследования. Таким образом, с помощью предлагаемого способа, по сравнению с известным, возбудитель бруцеллеза в небольших дозах может быть выявлен на несколько суток быстрее. Локальное размножение и накопление возбудителя позволяет исследовать только место введения и исключает исследование других органов и тканей биопробных животных, что резко сокращает объем работ и ускоряет выдачу результатов исследования. Способ введения исследуемых проб (под кожу спины) дает возможность исследовать большие объемы проб (1 мл), а также вводить другие компоненты, например, противоботулиническую сыворотку.

Использование: микробиология, специфическая индикация биологических средств методом флуоресцирующих антител, диагностика бруцеллеза. Сущность: изобретение заключается в том, что биопробным животным подкожно в область спины вводят 0,5-1 мл суспензии в физрастворе исследуемого материала, которую предварительно смешивают с гепаринизированной кровью морской свинки в соотношении 1 : 0,5 - 1 : 0,7, к полученной смеси из расчета на одно животное добавляли 0,5-0,7 мл желтка куриного яйца, 5-7 мг кортизона и 90-120 мг сухого молока. Исследованию подвергают только место введения, мазки отпечатки которого фиксируют по общепринятой методике, окрашивают флуоресцирующими иммуноглобулинами, полученные результаты учитывают при люминесцентном микроскопическом исследовании. Предлагаемый способ, в отличие от известного, позволяет обнаружить бруцеллы при их небольшой (10⁴-10¹) концентрации в исследуемом материале на 3-4 сутки исследования. Локальное размножение и накопление возбудителя позволяет исследовать только место введения и исключает исследование других органов и тканей биопробных животных, что резко сокращает объем работ и ускоряет выдачу результатов исследования. Кроме того, способ введения исследуемых проб (под кожу спины) дает возможность исследовать большие объемы проб (1 мл), а также вводить другие компоненты, например, противоботулиническую сыворотку. 2 табл.

Способ индикации возбудителя бруцеллеза, включающий введение исследуемого материала животным с последующим взятием патологического материала, изготовлением мазков-отпечатков, их фиксацией, нанесением флуоресцирующих иммуноглобулинов и учетом результатов при люминесцентном микроскопическом исследовании, отличающийся тем, что белым мышам подкожно в область спины вводят 0,5 1,0 мл суспензии исследуемого материала в физрастворе, которую предварительно смешивают с гепаринизированной кровью морской свинки в соотношении 1 0,5 1 0,7, к полученной смеси добавляют 0,5 0,7 мл желтка куриного яйца, 5 7 мг кортизона и 90 120 мг сухого молока, а патологический материал для исследования берут с места введения.