АЛКАЛОИДЫ, СПОСОБ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ, СПОСОБЫ ЛЕЧЕНИЯ, ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЙ СОСТАВ Российский патент 2004 года по МПК C07D487/16 A61K31/52 

Данное изобретение относится к новым цитотоксическим алкалоидам, Асмарину А и Асмарину В, выделенным из губки Raspailia sp.

Предпосылки изобретения
Морские организмы, в особенности мягкие кораллы, губки и оболочечники, производят множество вторичных метаболитов и демонстрируют различную степень биологической активности (Faulkner, D. Nat. Prod. Rep. 1997, 14, 259-302). Эти метаболиты принадлежат к семейству дитерпеновых алкалоидов; в 1984 году Nakamura, H. et al. Tetrahedron lett. 1984, 25, 2989-2992 была опубликована структура четырех агелазинов:





Мы выделили из губки Raspalia sp. новые цитотоксические дитерпеновые алкалоиды, принадлежащие к семейству агелазинов.

Краткое описание изобретения
Данное изобретение представляет новые дитерпеновые алкалоиды, имеющие структуру, представленную формулой (I) или формулой (II):


где R¹ представляет либо водород, либо низкомолекулярный алкил, либо низкомолекулярный алканоил; R² представляет водород либо низкомолекулярный алкил; R³ является либо алкилом, либо циклоалкиловой группой, содержащей один или несколько остатков изопрена, либо монотерпеном, либо гексотерпеном, либо гексотерпеновой или дитерпеновой группой; R⁴ или R⁵ представляют собой водород либо низкомолекулярный алкил; R⁶ является низкомолекулярным алкилом; Х представляет собой F, Сl, Вr или I.

В определениях групп в формулах (I) и (II) низкомолекулярный алкил и низкомолекулярный алкильный остаток низкомолекулярного алканоила представляют собой неразветвленную или разветвленную алкильную группу, содержащую от одного до шести атомов углерода, такую как метил, этил, пропил, изопропил, бутил, изобутил, sec-бутил, трет-бутил, пентил, неопентил и гексил.

Более точно, данное изобретение относится к Асмарину А и Асмарину В, экстрагированным и выделенным из губки Raspailia sp. Структуры этих соединений показаны ниже:


Пространственная структура показана для относительной конфигурации в обоих классах.

Асмарин А и Асмарин В демонстрируют противоопухолевое действие. В особенности Асмарин А и Асмарин В демонстрируют свое противоопухолевое действие против клеточных культур, взятых из солидных опухолей человека, таких как карцинома легкого человека, карцинома толстой кишки человека, меланома человека, и, подобным же образом, они активны в борьбе с другими линиями опухолевых клеток, например лейкемией и лимфомой.

Данное изобретение также предоставляет метод лечения млекопитающего, пораженного злокачественной опухолью, чувствительной к соединению, содержащему вещество формулы (I) либо формулы (II), состоящий в введении терапевтически эффективного количества соединения, имеющего формулу (I) или (II), либо их фармацевтической композиции.

В данном изобретении далее описывается фармацевтические композиции, которые содержат в качестве активного ингредиента вещество, имеющее формулу (I) или (II), а также описан процесс их приготовления.

Еще одним аспектом данного изобретения является метод получения веществ Асмарин А и Асмарин В, который включает в себя экстрагирование и выделение из губки Raspailia sp.

Примеры фармацевтических композиций включают все твердые (таблетки, пилюли, капсулы, гранулы и т.д.) и жидкие (растворы, суспензии, эмульсии) формы с подходящими схемами орального, местного или перентерального введения и они могут включать в себя чистое вещество либо его комбинацию с любым носителем либо другими фармакологически активными веществами. При перантеральном введении данные композиции должны быть простерилизованы.

Корректная дозировка фармацевтических композиций, содержащих вещества с формулами (I) или (II) будет изменяться в зависимости от фармацевтической формы, способа применения и конкретного организма, места и обрабатываемой опухоли. Также должны приниматься в расчет и другие факторы, такие как возраст, вес тела, пол, диеты, время введения препарата, уровень экскреции, состояние организма, сочетание лекарственных средств, чувствительность реакции и тяжесть заболевания. Введение препарата может осуществляться непрерывно либо периодически в пределах максимальной переносимой дозы.

Противоопухолевое действие
Клетки содержались в логарифмической фазе роста в Минимальной основной среде Eagle, содержащей сбалансированные соли Earle с 2,0 мМ L-глютамином, с заменимыми аминокислотами, в отсутствие бикарбоната натрия (ЕМЕМ/neaa); в среду добавлялась 10% фетальная телячья сыворотка, 10^-2 М бикарбоната натрия и 0,1 г/л пенициллина-G и стрептомицина сульфата.

Была проведена процедура отбора для определения и сравнения противоопухолевой активности данных соединений с применением адаптированной формы метода, описанного Бергероном и др. (Raymond J. Bergeron et al. Biochem. Bioph. Res. Comm. 1984, 121, 848). В качестве противоопухолевых использовались клетки Р-388 (суспензированная культура лимфоидной неоплазмы мыши DBA/2), А-549 (монослойная культура карциномы легкого человека), НТ-29 (монослойная культура карциномы толстой кишки человека) и MEL-28 (монослойная культура меланомы человека).

Клетки Р-388 были посеяны в 16-миллиметровых чашках в количестве 1•10⁴ клеток на чашку в 1 мл аликвотах MEM 5FCS, содержащих указанное количество препарата. Отдельный комплект культур, не содержащих препарат, был посеян в качестве контрольной группы роста для того, чтобы убедиться, что клетки оставались в экспоненциальной фазе роста. Все определения дублировались. После трех дней инкубации при 37^oС, 10% СО₂ и относительной влажности 98% был определен приблизительный IC₅₀ посредством сравнения роста в чашках с препаратом по отношению к контрольным чашкам.

Клетки А-549, НТ-29 и MEL-28 были посеяны в 16-миллиметровых чашках в количестве 2•10⁴ клеток на чашку в 1 мл аликвотах MEM 5FCS, содержащих указанное количество препарата. Отдельный комплект культур, не содержащих препарат, был посеян в качестве контрольной группы роста для того, чтобы убедиться, что клетки оставались в экспоненциальной фазе роста. Все определения дублировались. После трех дней инкубации при 37^oС, 10% СО₂ и относительной влажности 98% чашки окрашивались 0,1% Crystal Violet. Приблизительный IС₅₀ определялся посредством сравнения роста в чашках с препаратом по отношению к контрольным чашкам.

Результаты цитотоксического исследования Асмарина А и Асмарина В in vitro с линиями клеток Р-388, А-549, НТ-29 и MEL-28 приведены в табл.1.

Экстракция и выделение
Массовые спектры низкого разрешения были записаны при помощи масс-спектрометра EIMS. ЯМР-спектры ¹Н и ¹³С были записаны на спектрометре Bruker ARX-500. Все химические смещения приведены с учетом TMS (δ=0 ppm).

Raspailia sp. (Rob van Soest), (класс Demorspongia, порядок Poecilosclerida, семейство Raspailiidea) собиралась аквалангистами на глубине 23,5 метров в районе архипелага Дахлак, Эритрея в мае 1997 года. Сравнительный образец сохранен в Тель-Авивском университете (ЕТ-338). Губка была заморожена на месте. Высушенная вымораживанием губка (20 г) экстрагировалась этилацетатом дважды, в результате чего после испарения было получено коричневое смолоподобное вещество массой 1,2 г. Это коричневое смолоподобное вещество было по Купчону разделено на четыре фракции: гексан, тетрахлорид углерода, хлороформ и воду. Фракции СНСl₃ и ССl₄ были подобны. Эти две фракции были смешаны и хроматографированы на колонке Sephadex LH-20 элюированием смесью МеОН: СНСl₃ (1: 1), в результате чего было выявлено пять фракций. Фракции (3-5) далее были повторно хроматографированы на колонке Sephadex LH-20 в той же системе растворов, в результате чего была получена твердая фаза Асмарина А (100 мг), с температурой плавления 232^oС, m/z⁺=423 (C₂₅H₃₇N₅О), (100%) 188 (C₈H₆N₅O⁺), [α]20D

+55^° (с=0,5, СНСl₃), IR 3400, 2928, 1600, 1553, 1451, 1400, 1388, 900 см^-1, структура Асмарина была подтверждена путем рентгеноструктурного анализа. С тем же раствором был также выделен Асмарин В, (120 мг) в виде маслянистой жидкости, m/z⁺= 423 (С₂₅Н₃₇N₅O), (100%) 188 (C₈H₆N₅O⁺), [α]20D+60^° (с= 0,5 СНСl₃), IR 3400, 2927, 1606, 1553, 1451, 1404, 1388, 900 см^-1.

Данные ЯМР для Асмарина А и Асмарина В представлены в табл.2. Во всех случаях растворителем являлся СDСl₃, и все химические смещения представлены с учетом TMS (δ=0 ppm).

ПРИЛОЖЕНИЕ 1
Серия цитотоксических экспериментов in vitro с использованием активного начала асмарина (C₂₆H₃₉N₅О), структура которого отвечает основной формуле (I) настоящего изобретения

Во всех случаях указанное соединение проявило выраженное противоопухолевое действие. В табл.3 приведены данные, полученные в результате экспериментов в отношении различных клеточных линий.

Изобретение относится к новым цитотоксическим дитерпеновым алкалоидам формулы I или II, где R¹ - Н, низший алкил или низший алканоил; R² - Н, низший алкил; R³ - алкил, содержащий один или более остатков изопрена; R⁴ и R⁵ - Н или низший алкил; R⁶ - низший алкил; Х - F, Cl, Br или I, низший алкил или низший алканоил (разветвленный или неразветвленный). Соединения I или II выделяют из губки Raspailia sp. экстракцией с последующей хроматографией с использованием подходящего растворителя и элюента. 5 с. и 5 з.п.ф-лы, 3 табл.

1. Алкалоиды, имеющие структурную формулу (I) либо формулу (II):

в которых R¹ представляет либо водород, либо низкомолекулярный алкил, либо низкомолекулярный алканоил; R² представляет водород либо низкомолекулярный алкил; R³ является алкиловой группой, содержащей один или более остатков изопрена; R⁴ или R⁵ представляют собой водород либо низкомолекулярный алкил; R⁶ является низкомолекулярным алкилом; Х представляет собой F, Cl, Вr, или I;

а также в которых низкомолекулярный алкил и низкомолекулярный-алкильный остаток низкомолекулярного алканоила представляют собой неразветвленную или разветвленную алкильную группу содержащую 1-6 атомов углерода.

2. Алкалоид: Асмарин А по п.1, имеющий следующую формулу:

3. Алкалоид: Асмарин В, по п.1, имеющий следующую формулу:

4. Способ лечения млекопитающего, пораженного злокачественной опухолью, чувствительной к соединению, содержащему вещество формулы (I) либо формулы (II) по п.1, состоящий в введении пораженной особи терапевтически эффективного количества соединения либо фармацевтической композиции соединений.5. Способ лечения млекопитающего, пораженного злокачественной опухолью, чувствительной к Асмарину А по п.2 или Асмарину В по п.3, состоящий в введении пораженной особи терапевтически эффективного количества Асмарина А или Асмарина В, или их фармацевтической композиции.6. Фармацевтический состав с противоопухолевым действием, содержащий в качестве активного ингредиента соединение либо с формулой (I) либо с формулой (II) по п.1 совместно с фармацевтически приемлемым носителем или разжижителем.7. Фармацевтический состав с противоопухолевым действием, содержащий в качестве активного ингредиента Асмарин А по п.2 или Асмарин В по п.3 совместно с фармацевтически приемлемым носителем или разжижителем.8. Способ лечения млекопитающего, пораженного злокачественной опухолью, состоящий в введении пораженной особи терапевтически эффективного количества соединения вещества формулы (I) либо формулы (II) по п.1 вместе с другим или другими противоопухолевыми соединениями.9. Способ лечения млекопитающего, пораженного злокачественной опухолью, состоящий в введении пораженной особи терапевтически эффективного количества Асмарина А по п.2 или Асмарина В по п.3 вместе с другим или другими противоопухолевыми соединениями.10. Способ получения Асмарина А по п.2 либо Асмарина В по п.3, состоящий (а) в экстракции из губки Raspailia sp. соответствующих соединений с использованием подходящего растворителя; и (б) выделение из экстракта Асмарина А или Асмарина В с помощью хроматографии с использованием подходящего элюэнта.